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1、LOGO代谢组学技术及其在代谢组学技术及其在中药研究中的应用中药研究中的应用Wuhan university武汉大学武汉大学 周本宏周本宏 LOGO 代谢组学代谢组学 概概 念念n是生物体或细胞在外源性物质或病理生理刺激和遗是生物体或细胞在外源性物质或病理生理刺激和遗传因素改变的条件下，传因素改变的条件下，内源性代谢物内源性代谢物会发生变化，会发生变化，利用现代分析方法对体液、细胞或组织中的利用现代分析方法对体液、细胞或组织中的所有所有低低分子量分子量内源性代谢物组内源性代谢物组（endogenousmetabolitesendogenousmetabolites）进行定性、定量分析，定量检测
2、其代谢变化，通过进行定性、定量分析，定量检测其代谢变化，通过测定整个机体的系统测定整个机体的系统代谢图谱代谢图谱来探讨基因功能调控来探讨基因功能调控机制的学科机制的学科 Wuhan universityLOGO吸收吸收分布分布代谢代谢排泄排泄内源性代谢物内源性代谢物改变改变药物药物外源性代谢产物外源性代谢产物内源性代谢产物是基因表达的终产物，代谢组学所内源性代谢产物是基因表达的终产物，代谢组学所关注的是相对分子质量为关注的是相对分子质量为1,0001,000以下的小分子物质以下的小分子物质Wuhan university病理生理的变化病理生理的变化LOGO历史沿革历史沿革n英国帝国理工大学英国
3、帝国理工大学J.K NicholsonJ.K Nicholson教授的研究小组教授的研究小组利用核磁共振利用核磁共振( (NMRNMR) )技术分析大鼠的尿液技术分析大鼠的尿液, , 并于并于19991999年年J.K NicholsonJ.K Nicholson教授等教授等3 3名科研人员共同发名科研人员共同发表了一篇表了一篇“代谢组学代谢组学”研究论文，一个新的学科研究论文，一个新的学科从此诞生，从此诞生，NicholsonNicholson教授也由于其在代谢组学发教授也由于其在代谢组学发展中的开拓性的贡献，而被誉为展中的开拓性的贡献，而被誉为“国际代谢组学国际代谢组学之父之父”Wuhan
4、 universityLOGO历史沿革历史沿革 n是继基因组学、转录物组学、蛋白质组学之后的一门新型学科，是系统是继基因组学、转录物组学、蛋白质组学之后的一门新型学科，是系统生物学的重要组成部分生物学的重要组成部分n系统生物学（系统生物学（system biologysystem biology）研究的四个层次：）研究的四个层次： Wuhan universityLOGO系系统统生生物物学学 基因与蛋白质的表达紧密相连基因与蛋白质的表达紧密相连, ,代谢代谢物则更多地反映了细胞所处的环境。正物则更多地反映了细胞所处的环境。正如如Billy DavidBilly David所言所言: :“基因组
5、学和蛋白基因组学和蛋白质组学告诉你可能发生什么质组学告诉你可能发生什么, ,而代谢组学而代谢组学则告诉你已经发生了什么则告诉你已经发生了什么” 历史沿革历史沿革Wuhan universityLOGO历史沿革历史沿革 n19991999年年NicholsonNicholson首次提出了以首次提出了以NMRNMR分析为主的代谢组学研究模分析为主的代谢组学研究模式并联合国际六大医药公司式并联合国际六大医药公司（Bristol-Meyers-Bristol-Meyers-Squibb,EliSquibb,Eli lilly,Hoffmann-laRoche,NovoNordisklilly,Hoff
6、mann-laRoche,NovoNordisk, , Pfizer,PharmaciaPfizer,Pharmacia）英国帝国学院（）英国帝国学院（Imperial Imperial College,LondonCollege,London）面对风险的挑战，于）面对风险的挑战，于20012001年组织并公布了一年组织并公布了一个研究计划个研究计划COMETCOMET（Consortium for Consortium for MetabonomicMetabonomic ToxicologyToxicology）, ,应用代谢物组学评价药物毒性，进行候选药物应用代谢物组学评价药物毒性，进行
7、候选药物的临床前毒性筛选，进而对广泛模型化合物评价和安全性预测，的临床前毒性筛选，进而对广泛模型化合物评价和安全性预测，以缩短药物开发的时间，减少损失以缩短药物开发的时间，减少损失.3.3年中对大鼠和小鼠的尿液年中对大鼠和小鼠的尿液用用NMRNMR分析研究了分析研究了150150个肝肾毒性模型个肝肾毒性模型 Wuhan universityLOGO历史沿革历史沿革n自自20022002年第一届国际植物代谢组学大会在荷兰瓦赫宁根召年第一届国际植物代谢组学大会在荷兰瓦赫宁根召开以来，植物代谢组学分析技术和方法发展迅速已开始应开以来，植物代谢组学分析技术和方法发展迅速已开始应用于植物科学研究、生物安
8、全性评价等多个领域，在基因用于植物科学研究、生物安全性评价等多个领域，在基因功能研究、代谢途径及代谢网络调控机理的解析等方面发功能研究、代谢途径及代谢网络调控机理的解析等方面发挥重要作用挥重要作用n我国植物代谢组学的研究于我国植物代谢组学的研究于20052005年前后开始起步，目前已年前后开始起步，目前已形成较好的发展趋势形成较好的发展趋势Wuhan universityLOGO代谢组学研究的优势代谢组学研究的优势 与研究蛋白组或基因组相比，研究代谢组具有许多优势：与研究蛋白组或基因组相比，研究代谢组具有许多优势：(1)(1)生物体的小分子代谢产物所构成的代谢组要比转录物组生物体的小分子代谢产
9、物所构成的代谢组要比转录物组蛋白组简单得多蛋白组简单得多( (例如酿酒酵母有例如酿酒酵母有6 0006 000多个基因，但代谢物多个基因，但代谢物仅有仅有600600个个) )，那么分析代谢组就降低了样本的复杂性；，那么分析代谢组就降低了样本的复杂性；(2)(2)对多数小分子内源性代谢产物的作用及其所在代谢通路对多数小分子内源性代谢产物的作用及其所在代谢通路代谢调控已有相当的认识，而目前对基因功能与调控的认识代谢调控已有相当的认识，而目前对基因功能与调控的认识仍相当有限仍相当有限Wuhan universityLOGO代谢组学研究的优势代谢组学研究的优势(3)(3)代谢组是基因功能活动的终点。
10、代谢控制理论和实验证代谢组是基因功能活动的终点。代谢控制理论和实验证明在一个生化反应中，虽然酶的浓度和代谢通量不会发生明在一个生化反应中，虽然酶的浓度和代谢通量不会发生重大变化，但是代谢物的浓度会发生很大变化，因此针对重大变化，但是代谢物的浓度会发生很大变化，因此针对代谢变化重大的代谢物进行分析更加直观，也更加敏感代谢变化重大的代谢物进行分析更加直观，也更加敏感代谢组是基因表达的下游产物，所以它更能正确地反映细代谢组是基因表达的下游产物，所以它更能正确地反映细胞的功能水平，与蛋白组或基因组相比，代谢组具有终点胞的功能水平，与蛋白组或基因组相比，代谢组具有终点放大的特征。研究表明代谢通量不仅受基
11、因表达控制，而放大的特征。研究表明代谢通量不仅受基因表达控制，而且还受环境的调节，因此，测量下游产物代谢物较为合适且还受环境的调节，因此，测量下游产物代谢物较为合适从这一角度分析，代谢组包含的信息量要大于基因组、蛋从这一角度分析，代谢组包含的信息量要大于基因组、蛋白组学白组学Wuhan universityLOGO代谢组学研究的优势代谢组学研究的优势(4)(4)代谢组变化揭示的是系列关联代谢组变化揭示的是系列关联生物标记物生物标记物(biomarker)(biomarker)的综合差异，要比传统依赖单一标志物的诊断方法具有更的综合差异，要比传统依赖单一标志物的诊断方法具有更高的准确性，而且其最
12、小限度的侵入性以及时空动态性，高的准确性，而且其最小限度的侵入性以及时空动态性，是基因组和蛋白组学研究所无法比拟的。是基因组和蛋白组学研究所无法比拟的。(5)(5)代谢物谱在不同生物样本中基本上都是一样的，再加代谢物谱在不同生物样本中基本上都是一样的，再加上其检测技术的多样性，代谢组学的研究具有较好的便利上其检测技术的多样性，代谢组学的研究具有较好的便利性性Wuhan universityLOGO代谢组学研究的特点代谢组学研究的特点代谢组学作为一门新兴学科，概括起来具有以下特点代谢组学作为一门新兴学科，概括起来具有以下特点: :对机体损伤小，其检测的体液主要是尿液与血液；对机体损伤小，其检测的
13、体液主要是尿液与血液；信息量大，代谢组学能够提供整个机体功能统一性信息；信息量大，代谢组学能够提供整个机体功能统一性信息；检测更容易，基因和蛋白质表达的有效的微量变化会在代检测更容易，基因和蛋白质表达的有效的微量变化会在代谢物上得到放大；谢物上得到放大；无需特征化的数据库；无需特征化的数据库；检测物种类少，代谢物的种类数远远小于基因和蛋白数目检测物种类少，代谢物的种类数远远小于基因和蛋白数目代谢物产物具有通用性；代谢物产物具有通用性；能够反映生理病理状态能够反映生理病理状态Wuhan universityLOGO研究方法研究方法 代谢组学研究步骤包括：代谢组学研究步骤包括：样品采集与制备；样品
14、采集与制备；样品分析与鉴定；样品分析与鉴定；数据处理与分析；数据处理与分析；生物标志物（生物标志物（MarkersMarkers）分析）分析 Wuhan universityLOGOWuhan universityLOGO研究方法研究方法样品采集与制备：样品采集与制备： 采集后的样品需首先进行预处理，而且整个预处理过程应尽采集后的样品需首先进行预处理，而且整个预处理过程应尽可能保留和体现样品中完整的代谢物组分信息。可能保留和体现样品中完整的代谢物组分信息。 组织样品取样后，由于酶活性和氧化过程的继续，会引起代组织样品取样后，由于酶活性和氧化过程的继续，会引起代谢物的生成和改变，故样品需即时用谢
15、物的生成和改变，故样品需即时用液氮冷冻，低温（液氮冷冻，低温（- -8080）贮存）贮存。血和尿样也应在。血和尿样也应在-80-80保存，尿样中还要加叠保存，尿样中还要加叠氮化钠抑菌氮化钠抑菌Wuhan universityLOGO研究方法研究方法 尿样或稀释的尿样可直接进样，优点是在样品制备时，代尿样或稀释的尿样可直接进样，优点是在样品制备时，代谢物没有损伤，高通量。缺点是直接用谢物没有损伤，高通量。缺点是直接用ESI/MSESI/MS分析时，盐分析时，盐类有抑制作用（代谢物之间也会相互抑制），在类有抑制作用（代谢物之间也会相互抑制），在ESIESI过程中过程中生成加合物，不挥发物的积累会降
16、低仪器性能。生成加合物，不挥发物的积累会降低仪器性能。血液和尿样常用甲醇、乙腈或混合溶剂沉淀蛋白，离心后血液和尿样常用甲醇、乙腈或混合溶剂沉淀蛋白，离心后取上清液进行分析或除去溶剂后，用取上清液进行分析或除去溶剂后，用LCLC流动相溶解后分析流动相溶解后分析溶剂萃取应用得最早，冷冻的组织样品常用溶剂萃取，样溶剂萃取应用得最早，冷冻的组织样品常用溶剂萃取，样品需要在冷冻情况下粉碎，选用极性与非极性溶剂的结合品需要在冷冻情况下粉碎，选用极性与非极性溶剂的结合如甲醇如甲醇/ /氯仿，可形成双相，分别对水溶性及脂溶性相进行氯仿，可形成双相，分别对水溶性及脂溶性相进行分析分析Wuhan universi
17、tyLOGO研究方法研究方法 样品分析与鉴定：样品分析与鉴定： 近年来，各种分离分析手段如色谱、质谱、核磁共振近年来，各种分离分析手段如色谱、质谱、核磁共振（NMRNMR）、毛细管电泳、红外光谱等及其联用技术都应用于）、毛细管电泳、红外光谱等及其联用技术都应用于代谢组学的研究中，其中最常用的分析技术是代谢组学的研究中，其中最常用的分析技术是NMRNMR技术和技术和GC-GC-MSMS、LC-MSLC-MS等各种联用技术。等各种联用技术。NMRNMR方法具有无损伤性，无偏向方法具有无损伤性，无偏向性等特点，但其灵敏度较低；性等特点，但其灵敏度较低；GC-MSGC-MS方法具有较高的分辨率方法具有
18、较高的分辨率和检测灵敏度，并且有标准谱图库可以对照，但对于挥发性和检测灵敏度，并且有标准谱图库可以对照，但对于挥发性较低的代谢产物需要进行衍生化处理，且预处理过程相对繁较低的代谢产物需要进行衍生化处理，且预处理过程相对繁琐；琐；LC-MSLC-MS方法具有良好的客观性、选择性和分辨率，避免方法具有良好的客观性、选择性和分辨率，避免了了GC-MSGC-MS中衍生化等繁琐的预处理过程中衍生化等繁琐的预处理过程Wuhan universityLOGO研究方法研究方法 数据处理与分析：数据处理与分析： 代谢组学是通过数据引导的一门学科，数据处理与分代谢组学是通过数据引导的一门学科，数据处理与分析技术在
19、代谢组学研究中具有至关重要的作用。这就析技术在代谢组学研究中具有至关重要的作用。这就要求充分运用要求充分运用化学计量学理论和多元统计分析化学计量学理论和多元统计分析新方法新方法对采集的对采集的多维海量原始数据多维海量原始数据进行压缩降维和归类以实进行压缩降维和归类以实现从大量的原始数据中挖掘出隐含其中的有效信息，现从大量的原始数据中挖掘出隐含其中的有效信息，最终实现代谢模式的正确识别最终实现代谢模式的正确识别 Wuhan universityLOGO研究方法研究方法 数据处理与分析数据处理与分析 模式识别技术主要分为模式识别技术主要分为2 2大类：非监督（大类：非监督（un-supervise
20、dun-supervised）学习方）学习方法和有监督（法和有监督（supervisedsupervised）学习方法。非监督学习方法主要适用）学习方法。非监督学习方法主要适用于在不具备任何相关背景知识的情况下，进行生物样本的类别判于在不具备任何相关背景知识的情况下，进行生物样本的类别判断和生物标志物识别。常用的方法有断和生物标志物识别。常用的方法有主成分分析法（主成分分析法（PCAPCA）、）、非非线性映射（线性映射（NLMNLM）、簇类分析（）、簇类分析（HCAHCA）等。其中以）等。其中以PCAPCA方法最为常方法最为常用，用，PCAPCA的原理是将高维数据降维，并将数据投影变换到变异最
21、的原理是将高维数据降维，并将数据投影变换到变异最大的主轴上，从而提取出数据集的特征，它对所用的数据进行无大的主轴上，从而提取出数据集的特征，它对所用的数据进行无歧视的分析，无论是内源性物质，还是外源性物质的代谢产物峰歧视的分析，无论是内源性物质，还是外源性物质的代谢产物峰都能进行分析，是目前代谢组学数据处理的主要方法都能进行分析，是目前代谢组学数据处理的主要方法Wuhan universityLOGO研究方法研究方法 数据处理与分析数据处理与分析 有监督学习方法用于建立类别间的数学模型，使各类有监督学习方法用于建立类别间的数学模型，使各类样品间达到最大的分离，并利用建立的多参数模型对样品间达到
22、最大的分离，并利用建立的多参数模型对未知的样本进行预测。常用的方法有未知的样本进行预测。常用的方法有偏最小二乘法偏最小二乘法（PLSPLS）、）、软独立建模分类法（软独立建模分类法（SIMCASIMCA）、偏最小二乘）、偏最小二乘法显著性分析（法显著性分析（PLS-DAPLS-DA）和人工神经网络（）和人工神经网络（ANNANN）技术）技术等其中最常用的也是最基础的分析方法是等其中最常用的也是最基础的分析方法是PLSPLSWuhan universityLOGO代谢组学各分析流程技术代谢组学各分析流程技术Wuhan universityLOGO代组学相关数据库代组学相关数据库Wuhan uni
23、versityLOGO在中医药研究中的应用在中医药研究中的应用评价药物的毒性评价药物的毒性药物的安全性研究药物的安全性研究中药药效物质基础和作用机制研究中药药效物质基础和作用机制研究中医证候模型的研究中医证候模型的研究中药质量控制研究中药质量控制研究中药活性成分代谢产物研究中药活性成分代谢产物研究中药及其复方的多靶点药效作用机制研究等中药及其复方的多靶点药效作用机制研究等 Wuhan universityLOGO基于代谢组学的中药整体药效研究基于代谢组学的中药整体药效研究代谢组是生物体整体功能状态的代谢组是生物体整体功能状态的“生化表型生化表型”，因而对于表征中药，因而对于表征中药“多多组份、
24、多靶点弱效应协同、有机整合整体效应组份、多靶点弱效应协同、有机整合整体效应”具有突出优势具有突出优势多成分多成分多靶点效应多靶点效应血管保护血管保护 扩张冠脉扩张冠脉 降低耗氧量降低耗氧量 强心作用强心作用 综合作用评价综合作用评价 特异药效特异药效作用弱作用弱临床疗效确切临床疗效确切 ？代谢组变化代谢组变化代谢组变化代谢组变化 Wuhan universityLOGO不足之处不足之处分析手段有限，尚无任何一个分析技术能够同时对所有代分析手段有限，尚无任何一个分析技术能够同时对所有代谢物进行分析。尚无有效数据分析手段将所得到的全部信谢物进行分析。尚无有效数据分析手段将所得到的全部信息进行分析和
25、解释息进行分析和解释数据库很不完善数据库很不完善缺乏代谢产物数据的标准值缺乏代谢产物数据的标准值另外样品之间的差异、仪器动力学范围的局限和分析误差另外样品之间的差异、仪器动力学范围的局限和分析误差的存在也给代谢组学分析带来巨大的挑战。因此在取样方的存在也给代谢组学分析带来巨大的挑战。因此在取样方法法, ,新型分析仪器和分析技术等方面，都需要有很多进一步新型分析仪器和分析技术等方面，都需要有很多进一步深入的工作深入的工作Wuhan universityLOGO雄黄、朱砂雄黄、朱砂国家标准中收载含朱砂、雄黄的中成药占收载的全部的中国家标准中收载含朱砂、雄黄的中成药占收载的全部的中成方制剂的成方制剂
26、的6.34%6.34%u应用广泛，历史悠久应用广泛，历史悠久u有效和有毒的双重性有效和有毒的双重性u安全性倍受关注安全性倍受关注Wuhan universityLOGOWeiWei等采用代谢组学的方法对雄黄、朱砂的毒性进行等采用代谢组学的方法对雄黄、朱砂的毒性进行了研究：了研究：雄性雄性WistarWistar大鼠灌胃给药；大鼠灌胃给药；采集尿液；采集尿液；1 1H NMRH NMR对代谢物进行分析；对代谢物进行分析；生物标志物的分析；生物标志物的分析；Lai Wei, Peiqiu Liao,et al Toxicology and Applied Pharmacology234 (2009
27、) 314325LOGO结果表明结果表明: :尿液中，三羧酸循环中间产物柠檬酸盐尿液中，三羧酸循环中间产物柠檬酸盐(citrate)(citrate)、琥珀酸、琥珀酸盐盐( (succinatesuccinate) )、2 2酮戊二酸盐酮戊二酸盐(2-ketoglutarate)(2-ketoglutarate)显著增显著增加；乙酸乙酯、牛磺酸加；乙酸乙酯、牛磺酸( (taurinetaurine)、丙酮显著增加，并伴随、丙酮显著增加，并伴随着二甲基甘氨酸着二甲基甘氨酸( (dimethylglycinedimethylglycine) )、丙酮酸、丙酮酸( (pylllvatepylllva
28、te) )和和肠道菌产物苯乙尿酸肠道菌产物苯乙尿酸( (phenylacetylglycinephenylacetylglycine) )、马尿酸盐、马尿酸盐( (hippuratehippurate) )等内源性代谢产物的减少，且这些内源性代谢等内源性代谢产物的减少，且这些内源性代谢产物的变化呈现时间和剂量依赖性。产物的变化呈现时间和剂量依赖性。二甲基甘氨酸为肾乳头的毒性标志物，丙酮为肾脏皮层二甲基甘氨酸为肾乳头的毒性标志物，丙酮为肾脏皮层S3S3段段的毒性标志物。牛磺酸为肝脏受损的指标上述代谢产物分的毒性标志物。牛磺酸为肝脏受损的指标上述代谢产物分析表明，对肝肾具有一定的毒性析表明，对肝肾
29、具有一定的毒性LOGOSchematic representation of the energy metabolic networkLOGO. Schematic representation of the degradation pathway of cholineLOGO n朱砂主要成分为朱砂主要成分为HgSHgS，雄黄主要成分为，雄黄主要成分为AsAs2 2S S2 2n朱砂、雄黄在人体内的毒性程度与以下因素相关：朱砂、雄黄在人体内的毒性程度与以下因素相关： （1 1）在体内产生的可溶性砷、汞量）在体内产生的可溶性砷、汞量 （2 2）上述可溶性的砷、汞在体内的存在价态）上述可溶性的砷、
30、汞在体内的存在价态 Wuhan universityLOGO砷的不同价态及其毒性：砷的不同价态及其毒性：砷化氢（砷化氢（AsH3AsH3）亚砷酸）亚砷酸(As)(As)和砷酸和砷酸(As) (As) 甲基砷酸甲基砷酸( () )和二甲基砷酸和二甲基砷酸( () )胂甜菜碱胂甜菜碱( () )和胂胆碱和胂胆碱( () ) 基本无毒基本无毒汞的不同价态及其毒性汞的不同价态及其毒性 ：甲基汞乙基汞甲基汞乙基汞Hg2+Hg2+HgHg Wuhan universityLOGO有研究表明，含朱砂、雄黄的中药制剂经口服后，其所含的有研究表明，含朱砂、雄黄的中药制剂经口服后，其所含的砷或汞基本不被人体吸收。
31、实验表明：在粪便中所检测到的砷或汞基本不被人体吸收。实验表明：在粪便中所检测到的总砷、总汞，分别占给药量的总砷、总汞，分别占给药量的9999和和98.598.5因此仅以砷、汞元素的总量作为判断其是否安全是不科学的因此仅以砷、汞元素的总量作为判断其是否安全是不科学的研究雄黄中砷、朱砂中汞在体内可溶性部分的含量及其研究雄黄中砷、朱砂中汞在体内可溶性部分的含量及其可溶可溶性的砷、汞在体内的存在价态，性的砷、汞在体内的存在价态，合理评价该类药物，保证含合理评价该类药物，保证含朱砂、雄黄中成药的安全性和有效性朱砂、雄黄中成药的安全性和有效性Wuhan universityLOGO复方黄黛片的主要成分复方
32、黄黛片的主要成分四硫化四砷四硫化四砷雄黄雄黄靛玉红靛玉红青黛青黛丹参酮丹参酮II-A -II-A -丹参丹参四硫化四砷四硫化四砷Tetraarsenic tetrasulfide靛玉红靛玉红Indirubin丹参酮丹参酮II-A治疗急性早幼粒治疗急性早幼粒细胞白血病细胞白血病(APL)(APL)的现代中药配方的现代中药配方制剂制剂LOGO本课题组关于代谢组学的实验研究本课题组关于代谢组学的实验研究基于代谢组学的天麻川芎基于代谢组学的天麻川芎 药对配伍研究药对配伍研究Wuhan universityLOGO研究背景研究背景-天麻天麻 川芎川芎Wuhan university成分：酚类，甾醇类、有
33、机成分：酚类，甾醇类、有机 酸、氨基酸类酸、氨基酸类药理作用：镇静、镇痛、抗药理作用：镇静、镇痛、抗惊厥惊厥 成分：挥发油、生物碱、成分：挥发油、生物碱、酚性物质、苯酞内酯酚性物质、苯酞内酯 药理作用：镇静、镇痛药理作用：镇静、镇痛 、抗凝血抗凝血天麻天麻川芎川芎LOGO研究背景研究背景-天麻川芎天麻川芎 药对药对 配伍依据配伍依据：疾病特点疾病特点药性及药效药性及药效作用：作用：减少药物毒性减少药物毒性增强药效增强药效偏头痛多属于内伤类头痛，常和偏头痛多属于内伤类头痛，常和“风风”有关有关天麻川芎药对恰合偏头痛的病机天麻川芎药对恰合偏头痛的病机天麻能祛风湿以天麻能祛风湿以 止痛、平肝熄风以止
34、痉止痛、平肝熄风以止痉川芎具有活血、行气、川芎具有活血、行气、 祛风、止痛的功效祛风、止痛的功效Wuhan universityLOGO研究背景研究背景-天麻川芎天麻川芎 药对药对药对药对是古代医家应用在中药复方中的一种特殊形是古代医家应用在中药复方中的一种特殊形式，是中药复方的最小单位，其配伍的规律及作式，是中药复方的最小单位，其配伍的规律及作用机制是现代中药研究的热点之一。用机制是现代中药研究的热点之一。天麻和川芎常作为药对使用，是历代医家用于治天麻和川芎常作为药对使用，是历代医家用于治疗疗偏头痛、眩晕偏头痛、眩晕的经典药对组合的经典药对组合 ，不过不同时期，不过不同时期各大医家对其配伍比
35、例却不尽相同，用法也各异各大医家对其配伍比例却不尽相同，用法也各异在在本草纲目本草纲目等古代本草书籍中，记载的天麻等古代本草书籍中，记载的天麻川芎用量之比最常见的比例为川芎用量之比最常见的比例为1:41:4和和4:14:1 ，其中天，其中天麻川芎用量之比麻川芎用量之比1:41:4最为常见最为常见Wuhan universityLOGO 研究内容研究内容Wuhan university药材分组：药材分组： 天麻组天麻组 川芎组川芎组 天麻川芎天麻川芎A组（天麻：川芎组（天麻：川芎=1:4）天麻川芎天麻川芎B组（天麻：川芎组（天麻：川芎=4:1）提取方法：提取方法：10倍量倍量70%乙醇乙醇提取时
36、间提取时间1h提取提取3次次一、天麻川芎不同配伍比例对有效成分提取的影响一、天麻川芎不同配伍比例对有效成分提取的影响LOGO-天麻川芎不同配伍比例对有效成分提取的影响天麻川芎不同配伍比例对有效成分提取的影响 Wuhan university流动相：甲醇流动相：甲醇-水水( 50:50)检测波长：检测波长：280nm；柱温：柱温：25；流速：流速：0.8mL.min-1川芎嗪的含量测定川芎嗪的含量测定LOGO-天麻川芎不同配伍比例对有效成分提取的影响天麻川芎不同配伍比例对有效成分提取的影响 Wuhan university 川芎嗪含量测定结果川芎嗪含量测定结果组别组别每克川芎含川芎嗪每克川芎含川
37、芎嗪（mg）平均值平均值（mg）川芎嗪提取增加川芎嗪提取增加率（率（%）川芎组川芎组0.0730.0760.0740.074天麻川芎天麻川芎A组组0.0970.0950.09528.27%0.092天麻川芎天麻川芎B组组0.0830.0820.08210.81%0.083LOGO-天麻川芎不同配伍比例对有效成分提取的影响天麻川芎不同配伍比例对有效成分提取的影响 Wuhan university流动相流动相:水水:甲醇甲醇:冰乙酸冰乙酸(95：5：1)流速流速: 0. 8mLmin-1检测波长检测波长: 270nm柱温：柱温：25天麻素含量测定天麻素含量测定 LOGO-天麻川芎不同配伍比例对有效
38、成分提取的影响天麻川芎不同配伍比例对有效成分提取的影响 Wuhan university天麻素含量测定结果天麻素含量测定结果组别组别每克天麻含每克天麻含天麻素（天麻素（mg）平均值平均值（mg）天麻素提取天麻素提取增加率（增加率（%）天麻组天麻组8.288.308.288.25天麻川芎天麻川芎A组组8.818.858.856.88%8.88天麻川芎天麻川芎B组组8.768.728.745.56%8.73LOGO结论结论天麻川芎配伍后有利于其有效成分的天麻川芎配伍后有利于其有效成分的溶出溶出其中川芎嗪含量的提高比天麻素明显其中川芎嗪含量的提高比天麻素明显药对配伍比例会影响到有效成分的药对配伍比例
39、会影响到有效成分的溶出溶出率率其中其中天麻川芎用量之比天麻川芎用量之比1:41:4时其有效成分的时其有效成分的溶出率相对较高溶出率相对较高Wuhan universityLOGO二、二、天麻川芎药对对大鼠尿液内源性代谢天麻川芎药对对大鼠尿液内源性代谢时间轨迹分析时间轨迹分析 Wuhan university 正常对照组正常对照组川芎组川芎组 天麻组天麻组天麻川芎天麻川芎 A A组组天麻川芎天麻川芎B B组组 正常对照组：正常对照组：给予生理盐水给予生理盐水其余各组：其余各组：给予药材提取液给予药材提取液代谢笼采集大鼠尿液代谢笼采集大鼠尿液甲醇去蛋白，离心甲醇去蛋白，离心1.动物分组动物分组2.
40、灌胃给药灌胃给药3.尿样采集尿样采集LOGOWuhan university流动相：乙腈流动相：乙腈(A)、0.1甲酸甲酸(B)，流速：，流速：0.4 mLmin-1，进样量：进样量：3L，柱温：，柱温：35，梯度洗脱条件如下表：，梯度洗脱条件如下表：T（min）A(%)B(%)0010087030129010140100190100毛细管电压为4000V；雾化器压力为40psi；干燥气流速：10Lmin-1，干燥气温度：3504. LC-MS数据采集数据采集LOGOWuhan university将将LC-MS原始数据进行转化后原始数据进行转化后导入导入SIMCA-P软件、软件、MATLAB
41、软件进行主成分分析软件进行主成分分析5. 数据分析主成分分析法：主成分分析法：将许多相关的变量转为少数几个彼此独立的综合指标的统计方法将许多相关的变量转为少数几个彼此独立的综合指标的统计方法它让多个变量的复杂关系变得简单，有利于获取其中最有效的数据它让多个变量的复杂关系变得简单，有利于获取其中最有效的数据 在进行主成分分析后，可在在进行主成分分析后，可在80以上的精度下，用以上的精度下，用2-3个新个新变量取代原来的变量取代原来的n个变量个变量LOGO单击此处添加标题由原始变量的观测数据计算前由原始变量的观测数据计算前k个主成分的得分，将其作为个主成分的得分，将其作为主成分主成分F1，F2，F
42、k的观的观测值，来建立测值，来建立Y 与主成分与主成分回归方程回归方程生成生成得分图得分图生成生成载荷图载荷图分类信息分类信息寻找生物标寻找生物标志物志物Wuhan universityLOGO单击此处添加标题X1X2X3X4.XnVar-1Var-2Var-3Var-4.Var-nY1样本1峰面积1峰面积2峰面积3峰面积4.峰面积n样本2峰面积1峰面积2峰面积3峰面积4.峰面积n样本3峰面积1峰面积2峰面积3峰面积4.峰面积nY2样本4峰面积1峰面积2峰面积3峰面积4.峰面积n样本5峰面积1峰面积2峰面积3峰面积4.峰面积n样本6峰面积1峰面积2峰面积3峰面积4.峰面积nY3样本7峰面积1峰
43、面积2峰面积3峰面积4.峰面积n样本8峰面积1峰面积2峰面积3峰面积4.峰面积n样本9峰面积1峰面积2峰面积3峰面积4.峰面积nLOGO通过得分矩阵可得到得分图通过得分矩阵可得到得分图 (Scores Plot(Scores Plot) )在得分图上，样本得分点之间的距离越大表明样本之间的差在得分图上，样本得分点之间的距离越大表明样本之间的差异越大，大鼠尿液的代谢物状态差异越大异越大，大鼠尿液的代谢物状态差异越大C0C0，C1C1，C2C2，C3C3，C4C4分别表示正常对照组大鼠在第分别表示正常对照组大鼠在第1 1，8 8，15,15, 22,22, 2929天收集的尿液样本；天收集的尿液样
44、本；A0A0，A1A1，A2A2，A3, A3, A4分别表示给分别表示给药组大鼠在第药组大鼠在第1 1，8 8，15,15, 22,22, 2929天收集的尿液样本天收集的尿液样本 Wuhan universityLOGO实验结果实验结果Wuhan university天麻组天麻组SIMCA-P平面得分图平面得分图 天麻组天麻组MATLAB平面得分图平面得分图 川芎组川芎组SIMCA-P平面得分图平面得分图 川芎组川芎组MATLAB平面得分图平面得分图 LOGOWuhan university天麻川芎天麻川芎A组组SIMCA-P平面得分图平面得分图 天麻川芎天麻川芎A组组MATLAB平面得分
45、图平面得分图 天麻川芎天麻川芎B组组MATLAB平面得分图平面得分图 天麻川芎天麻川芎B组组SIMCA-P平面得分图平面得分图 LOGO小小 结结给药时间为给药时间为2929天时，天时，各给药组大鼠内源性代谢整体变化最大各给药组大鼠内源性代谢整体变化最大两种软件主成分分析得到的结果是一致的两种软件主成分分析得到的结果是一致的SIMCA-PSIMCA-P软件比软件比MATLABMATLAB软件更适合软件更适合在医药学研究中使用在医药学研究中使用Wuhan universityLOGO三、天麻川芎药对对偏头痛模型大鼠内源性物质代谢影响三、天麻川芎药对对偏头痛模型大鼠内源性物质代谢影响 Wuhan
46、university正常对照组、模型组、正常对照组、模型组、天麻组、川芎组天麻组、川芎组天麻川芎天麻川芎A A组、天麻川芎组、天麻川芎B B组组阳性对照组阳性对照组正常对照组、模型组给予生理盐水正常对照组、模型组给予生理盐水阳性对组给予阳性药物阳性对组给予阳性药物其余各组分别给予相应的药材提取液其余各组分别给予相应的药材提取液除了正常对照组，各组大鼠均在给药后于除了正常对照组，各组大鼠均在给药后于右肩部注射硝酸甘油注射剂（右肩部注射硝酸甘油注射剂（10mg.kg-110mg.kg-1）尿液收集及数据采集方法同前尿液收集及数据采集方法同前动物分组动物分组动物给药动物给药动物造模动物造模尿液、数据
47、采集尿液、数据采集LOGO天麻川芎药对对偏头痛模型大鼠内源性物质代谢影响天麻川芎药对对偏头痛模型大鼠内源性物质代谢影响偏最小二乘法偏最小二乘法- -判别分析（判别分析（PLS-DAPLS-DA）与与PCAPCA分析相似，都是为了提取出主成分，简化数据分析相似，都是为了提取出主成分，简化数据与主成分的不同点是加入哑变量（分组信息）来引导分类与主成分的不同点是加入哑变量（分组信息）来引导分类X1X2X3X4.XnVar-1Var-2Var-3Var-4.Var-nY1第一组1样本1峰面积1峰面积2峰面积3峰面积4.峰面积n1样本2峰面积1峰面积2峰面积3峰面积4.峰面积n1样本3峰面积1峰面积2峰
48、面积3峰面积4.峰面积nY2第二组2样本4峰面积1峰面积2峰面积3峰面积4.峰面积n2样本5峰面积1峰面积2峰面积3峰面积4.峰面积n2样本6峰面积1峰面积2峰面积3峰面积4.峰面积nY3第三组3样本7峰面积1峰面积2峰面积3峰面积4.峰面积n3样本8峰面积1峰面积2峰面积3峰面积4.峰面积n3样本9峰面积1峰面积2峰面积3峰面积4.峰面积nLOGO天麻川芎药对对偏头痛模型大鼠内源性物质代谢的影响天麻川芎药对对偏头痛模型大鼠内源性物质代谢的影响 Wuhan university基于代谢组学的硝酸甘油致偏头痛大鼠模型验证分析基于代谢组学的硝酸甘油致偏头痛大鼠模型验证分析 正常对照组与偏头痛模型的
49、正常对照组与偏头痛模型的PLS-DA平面得分图与三维得分图平面得分图与三维得分图 正常对照组与偏头痛模型的正常对照组与偏头痛模型的PCA平面得分图与三维得分图平面得分图与三维得分图LOGO天麻川芎药对对偏头痛模型大鼠内源性物质代谢的影响天麻川芎药对对偏头痛模型大鼠内源性物质代谢的影响 Wuhan university不同配伍比例的天麻川芎药对对偏头痛大鼠尿液内源性物质的影响不同配伍比例的天麻川芎药对对偏头痛大鼠尿液内源性物质的影响 1 1：正常对照组；：正常对照组；2 2：阳性对照组；：阳性对照组；3 3：天麻川芎：天麻川芎A A组；组；4 4：天麻川芎：天麻川芎B B组；组；5 5：川芎组；
50、：川芎组；:6:6：天麻组；：天麻组；:7:7：模型组：模型组 LOGO天麻川芎药对对偏头痛模型大鼠内源性物质代谢的影响天麻川芎药对对偏头痛模型大鼠内源性物质代谢的影响 Wuhan university1 1：正常对照组；：正常对照组；2 2：阳性对照组；：阳性对照组；3 3：天麻川芎：天麻川芎A A组；组；4 4：天麻川芎：天麻川芎B B组；组；5 5：川芎组；：川芎组；:6:6：天麻组；：天麻组；:7:7：模型组：模型组LOGO天麻川芎药对对偏头痛模型大鼠内源性物质代谢的影响天麻川芎药对对偏头痛模型大鼠内源性物质代谢的影响 Wuhan university天麻川芎天麻川芎A A组对偏头痛大
51、鼠尿液内源性物质代谢途径的影响组对偏头痛大鼠尿液内源性物质代谢途径的影响 正常对照组（蓝），阳性对照组（绿），天麻川芎正常对照组（蓝），阳性对照组（绿），天麻川芎A A组（橙）与模型组（红）组（橙）与模型组（红）PCAPCA平面得分图与三维得分图平面得分图与三维得分图 LOGO天麻川芎药对对偏头痛模型大鼠内源性物质代谢的影响天麻川芎药对对偏头痛模型大鼠内源性物质代谢的影响Wuhan university 正常对照组，阳性对照组，天麻川芎正常对照组，阳性对照组，天麻川芎A A组与模型组组与模型组PCAPCA载荷图载荷图 5.生物标志物的寻找与鉴定生物标志物的寻找与鉴定载荷图中距离原点越远的点，表
52、示其代表的变量对分类的载荷图中距离原点越远的点，表示其代表的变量对分类的贡献越大，越有可能成为潜在的生物标志物贡献越大，越有可能成为潜在的生物标志物LOGO天麻川芎药对对偏头痛模型大鼠内源性物质代谢的影响天麻川芎药对对偏头痛模型大鼠内源性物质代谢的影响Wuhan university正常对照组，阳性对照组，天麻川芎正常对照组，阳性对照组，天麻川芎A组与模型组组与模型组PLS-DA载荷图载荷图 LOGO天麻川芎药对对偏头痛模型大鼠内源性物质代谢的影响天麻川芎药对对偏头痛模型大鼠内源性物质代谢的影响Wuhan university正常对照组，阳性对照组，天麻川芎正常对照组，阳性对照组，天麻川芎A
53、A组与模型组组与模型组PLS-DAPLS-DA的的VIPVIP柱状图柱状图 VIP值表值表 VIPVIP值可评价值可评价PLS-DAPLS-DA模型中变量的重要程度，模型中变量的重要程度， VIPVIP值越大，显示变量对模型越是重要值越大，显示变量对模型越是重要选取选取VIPVIP值大于值大于1 1的变量作为候选生物标志物的变量作为候选生物标志物随后根据质谱信息及数据库等方法寻找生物标志物随后根据质谱信息及数据库等方法寻找生物标志物LOGO天麻川芎药对对偏头痛模型大鼠内源性物质代谢的影响天麻川芎药对对偏头痛模型大鼠内源性物质代谢的影响Wuhan university硫辛酰胺质谱图硫辛酰胺质谱图
54、 该化合物的分子量为该化合物的分子量为205.0205.0，根据氮元素规则可知，根据氮元素规则可知，该化合物应含有奇数个氮原子该化合物应含有奇数个氮原子通过质谱分析其主要碎片离子为通过质谱分析其主要碎片离子为189.1,161.0,189.1,161.0,推推测可能是分子离子峰先失去一个测可能是分子离子峰先失去一个NH2NH2的结构的结构, ,再失再失去一个去一个COCO的结构的结构结合精确分子量分析，通过结合精确分子量分析，通过HMDBHMDB数据查询到共有数据查询到共有3 3个化合物符合要求，其中只有硫辛酰胺含有酰胺个化合物符合要求，其中只有硫辛酰胺含有酰胺结构结构 以硫辛酰胺为例，推测可
55、能的生物标志物结构以硫辛酰胺为例，推测可能的生物标志物结构：LOGO天麻川芎药对对偏头痛模型大鼠内源性物质代谢的影响天麻川芎药对对偏头痛模型大鼠内源性物质代谢的影响Wuhan university潜在生物标志物潜在生物标志物LOGO天麻川芎药对对偏头痛模型大鼠内源性物质代谢的影响天麻川芎药对对偏头痛模型大鼠内源性物质代谢的影响Wuhan university从从METLIN,KEGG,HMDB等数据库中等数据库中分析生物标志物的代谢途径分析生物标志物的代谢途径色氨酸，亮氨酸，酪氨酸色氨酸，亮氨酸，酪氨酸 ，琥珀酸，肌酐参与氨基酸的代谢，琥珀酸，肌酐参与氨基酸的代谢硫辛酰胺，柠檬酸，琥珀酸是三羧
56、酸循环过程重要的中间体硫辛酰胺，柠檬酸，琥珀酸是三羧酸循环过程重要的中间体马尿酸生成可能和大鼠摄入天麻素有一定联系马尿酸生成可能和大鼠摄入天麻素有一定联系尿苷是核苷酸的一种尿苷是核苷酸的一种 ，主要参与嘧啶代谢等，主要参与嘧啶代谢等LOGO柠檬酸参与的代谢途径柠檬酸参与的代谢途径 Wuhan universityLOGO 酪氨酸参与的代谢途径酪氨酸参与的代谢途径 Wuhan universityLOGO小小 结结通过代谢组学研究，初步筛选出通过代谢组学研究，初步筛选出9 9种潜在生物标志物，种潜在生物标志物，其中色氨酸，酪氨酸与琥珀酸这其中色氨酸，酪氨酸与琥珀酸这3 3个内源性物质与偏个内源性
57、物质与偏头痛发病机制联系较为紧密头痛发病机制联系较为紧密 通过对通过对9 9种潜在生物标志物内源性代谢途径的分析，种潜在生物标志物内源性代谢途径的分析，天麻川芎药对对偏头痛大鼠的代谢影响可能与氨基天麻川芎药对对偏头痛大鼠的代谢影响可能与氨基酸代谢及三羧酸循环有关酸代谢及三羧酸循环有关天麻川芎药对配伍比例为天麻川芎药对配伍比例为1:41:4时，可使偏头痛大鼠内时，可使偏头痛大鼠内源性代谢状态趋向正常的作用比其他组明显。源性代谢状态趋向正常的作用比其他组明显。在模式在模式识别方面，识别方面，PLS-DAPLS-DA优于优于PCAPCAWuhan universityLOGO代谢组学技术的展望代谢组
58、学技术的展望代谢组学技术是进行生物表型研究的主要手段之一，是系代谢组学技术是进行生物表型研究的主要手段之一，是系统生物学研究不可或缺的重要组成部分，正日益成为研究统生物学研究不可或缺的重要组成部分，正日益成为研究的热点；的热点；目前代谢组学技术还不能涵盖和分析所有的代谢物，我们目前代谢组学技术还不能涵盖和分析所有的代谢物，我们相信随着现代分析技术和手段的进步、代谢组学数据库的相信随着现代分析技术和手段的进步、代谢组学数据库的建立和完善，代谢组学技术会分析尽可能多的代谢组分，建立和完善，代谢组学技术会分析尽可能多的代谢组分，发挥更大作用；发挥更大作用；中药及其复方药效的特点是多成分、多途径、多靶点的整中药及其复方药效的特点是多成分、多途径、多靶点的整体调节，而代谢组学是通过整体代谢图谱来分析中药对机体调节，而代谢组学是通过整体代谢图谱来分析中药对机体的内源性代谢物的影响，因此代谢组学技术与中医药的体的内源性代谢物的影响，因此代谢组学技术与中医药的整体观念相一致，代谢组学技术在中医药研究方面具有独整体观念相一致，代谢组学技术在中医药研究方面具有独特优势，会得到广泛的应用。特优势，会得到广泛的应用。Wuhan universityLOGOPage 70致谢致谢 Wuhan universityThinks for your attention欢迎指正！E-mai：
