第三章固定化酶及反应动力学课件

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1、第三章固定化酶及反应动力学概述概述固定化后固定化后酶性性质变化及化及动力学影响因素力学影响因素外外扩散限制效散限制效应内内扩散限制效散限制效应扩散影响下的表散影响下的表观动力学参数力学参数内 容酶应用用过程中的一些不足程中的一些不足l酶的的稳定性定性较差差：除了某些耐高温的酶，如-淀粉酶、Taq酶等；和胃蛋白酶等可以耐受较低的pH条件以外，大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活。 l酶的一次性使用的一次性使用：酶一般都是在溶液中与底物反应，这样酶在反应系统中，与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用。这种一次性使用酶的方式，不仅使

2、生产成本提高，而且难于连续化生产。 l产物的分离物的分离纯化化较困困难：酶反应后成为杂质与产物混在一起，无疑给产物的进一步的分离纯化带来一定的困难。 固定化技固定化技术什么是固定化什么是固定化酶？水溶性水溶性酶水不溶性水不溶性载体体水不溶性水不溶性酶（固定化（固定化酶）固定化技固定化技术01概述固定化：将酶通过物理或化学方法固定在载体上或限制在一定空间内。固定化固定化酶（immobilized enzyme）l亦称固相酶或水不溶酶。是用物理的或化学的方法使酶装变为在一定的空间内其运动受到完全约束，或受到局部约束的一种不溶于水，但仍具有活性的酶。能以固相状态作用于底物进行催化反应。l水不溶性大分

3、子载体结合或把酶包埋在水不溶性凝胶或半透膜的微囊体中制成的。固定化固定化酶的研究始于的研究始于19101910年，正式研究于年，正式研究于2020世世纪6060年代、年代、7070年代已在全世界普遍开展。年代已在全世界普遍开展。19531953年德国的年德国的 GrubhoferGrubhofer和和SchleithSchleith采用聚氨基苯乙采用聚氨基苯乙烯树脂脂为载体与体与羧肽酶、淀粉、淀粉酶、胃蛋白、胃蛋白酶、核糖核酸、核糖核酸酶等等结合，制成固定化合，制成固定化酶。6060年代后期，固定化技年代后期，固定化技术迅速迅速发展起来。展起来。19691969年，日本的年，日本的千烟一郎首次

4、在工千烟一郎首次在工业上生上生产应用固定化氨基用固定化氨基酰化化酶从从DL-DL-氨基酸氨基酸连续生生产L-L-氨基酸，氨基酸，实现了了酶应用史上的一大用史上的一大变革。革。在在19711971年召开的第一次国年召开的第一次国际酶工程学工程学术会会议上，确定固上，确定固定化定化酶的的统一英文名称一英文名称为Immobilized enzymeImmobilized enzyme。随着固定化技随着固定化技术的的发展，出展，出现固定化菌体固定化菌体 。19731973年，日年，日本首次在工本首次在工业上上应用固定化大用固定化大肠杆菌菌体中的天杆菌菌体中的天门冬氨冬氨酸酸酶，由反丁，由反丁烯二酸二酸

5、连续生生产L-L-天天门冬氨酸。冬氨酸。在固定化在固定化酶和固定化菌体的基和固定化菌体的基础上，上，7070年代后期出年代后期出现了了固定化固定化细胞技胞技术。 19761976年，法国首次用固定化酵母年，法国首次用固定化酵母细胞胞生生产啤酒和酒精，啤酒和酒精，19781978年日本用固定化枯草杆菌生年日本用固定化枯草杆菌生产淀淀粉粉酶，开始了用固定化，开始了用固定化细胞生胞生产酶的先例。的先例。19821982年，日本首次研究用固定化原生年，日本首次研究用固定化原生质体生体生产谷氨酸，谷氨酸，取得取得进展。固定化原生展。固定化原生质体由于解除了体由于解除了细胞壁的障碍，胞壁的障碍，更有利于胞

6、内物更有利于胞内物质的分泌，的分泌，这为胞内胞内酶生生产技技术路路线的的变革提供了新的方向。革提供了新的方向。与游离与游离酶相比相比, ,固定化固定化酶在保持其高效在保持其高效专一及温和的一及温和的酶催催化反化反应特性的同特性的同时, ,又克服了游离又克服了游离酶的不足之的不足之处, ,呈呈现贮存存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可可控、工控、工艺简便等一系列便等一系列优点。点。固定化固定化酶不不仅在化学、生物学及生物工程、医学及生命科在化学、生物学及生物工程、医学及生命科学等学科学等学科领域的研究异常活域的研究异常活跃, ,得到迅速得

7、到迅速发展和广泛的展和广泛的应用用, ,而且因而且因为具有具有节省省资源与能源、减少或防治源与能源、减少或防治污染的生染的生态环境效境效应而符合可持而符合可持续发展的展的战略要求。略要求。为什么固定化？什么固定化？易从反应系统分离，简化产物纯化过程。稳定性增加，不易失活具有一定形状和机械强度，可以装填于反应器固定床反应器可连续生产，过程易控制。简化了提取工艺，增加产物收率，提高产品质量更适合多酶反应酶使用效率提高，产品成本降低存在存在问题(1)制备困难，活性降低(2)增加了载体成本费及固定化操作费用；(3)增大了颗粒扩散阻力，使反应速度下降。固定化细胞01概述固定化固定化细胞胞 将细胞限制或定

8、位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。 特点：特点： 1.无需进行酶的分离和纯化。 2.细胞本身含有多酶体系，可催化一系列反应。 3.酶的辅助因子可以再生，稳定性高。 4.保持酶的原始状态，酶的回收率高。 5.抗污染能力强。01概述工业规模的酶固定化方法应具备的条件：(1)载体价廉、固定化费用低；(2)能反复利用，即对非一次性固定化酶，其载体要求能再生；(3)固定化收率高、制备简便、而且结合力强；(4)载体的机械强度高；(5)物理及化学性质稳定，使用于食品加工时要安全无毒01概述固定化固定化酶制制备方法方法01概述l吸附（载体结合）法：物理吸

9、附(活性碳，硅胶等)，离子结合（离子交换剂和离子交换树脂），共价结合。作用力增强，对酶影响加大。l交联法：利用多功能试剂使酶间交联（异氰酸酯，联苯胺，形成共价键）。l包埋法：包埋于高分子凝胶网格（网格型），高分子半透膜（微囊型）（医学应用多）化学偶联酶固定化固定化间歇歇可溶可溶交联包埋吸附间歇歇连续酶的固定化技术和固定化酶01概述l活性中心活性中心：保护酶的催化作用，并使酶的活性中心的氨基酸基团固有的高级结构不受到损害，在制备固定化酶时，需要在非常严密的条件下进行。l功能基功能基团：如游离的氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等，当这些功能基团位于酶的

10、活性中心时，要求不参与酶的固定化结合l酶的高的高级结构构：要避免用高温、强酸、强碱等处理，而且有机溶剂、高浓度的盐也会使酶变性、失活，因此，操作应尽量在非常温和的条件下进行。固定化固定化酶操作的注意事操作的注意事项1 吸附法吸附法分为物理吸附法和离子交换吸附法。(1)物理吸附法: 通通过氢键、疏水作用和、疏水作用和电子子亲和力等物理和力等物理作用，将作用，将酶固定于水不溶固定于水不溶载体上从而制成固定化体上从而制成固定化酶。常用的载体有：有机载体。纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等。比如用纤维素作为吸附剂，用膨润的玻璃纸或胶棉膜吸附木瓜蛋白酶、碱性磷酸脂酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶。吸附后在载体

11、表面形成单分子层，吸附蛋白能力约70mg/cm2。无机载休。氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、二氧化钛等。比如用多孔硅为载体吸附米曲酶和枯草杆菌的alpha-淀粉酶以及黑曲霉的糖化酶，在45进行固定化，用高浓度的底物进行连续反应。半衰期分别为14、35、60d。无机载体的吸附容量较低、而且酶容易脱落。固定化固定化酶制制备方法方法01概述l吸附（载体结合）法：物理吸附(活性碳，硅胶等)，离子结合（离子交换剂和离子交换树脂），共价结合。作用力增强，对酶影响加大。l物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应，整体结构保持不变，酶的催化活性得到很好保留。但是，由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍

12、作用，因此对一些反应不适用。(2)离子交换吸附法: 这是将将酶与含有离子交与含有离子交换基的水不基的水不溶溶载体相体相结合而达到固定化的一种方法。合而达到固定化的一种方法。酶吸附较牢，在工业上颇具广泛的用途。常用的载体有阴离子交换剂，如二乙基氨基乙基(DEAE)-纤维素、混合胺类（ECTEDLA）-纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、Amberlite IRA-93、410、900等。阳离子交换剂，如羧甲基(CM)纤维素、纤维素柠檬酸盐、Amberlite CG50、IRC50、IR200、Dowex50等。uDEAE-Sephadex固定化氨基酰化酶：将DEAE-

13、SephadexA25充分溶胀用0.5mol/LNa0H和水洗涤后，加入pH7.07.5的米曲霉-粗酶液(水解乙酰DL-Ala活力为25umol/m1h)充分混合(1g湿重载体加60ml酶液)后，于低温下搅拌过夜后，吸去上清液，再用蒸馏水和0.15mol/L醋酸钠水溶液洗涤固定化酶，置4备用。固定化酶活力回收50-60，水解乙酰DLA1a活力为600-800umol/gh湿固定化酶。氨基酰化酶也可固定于DEAE纤维素。 u此外，DEAE纤维素吸附的淀粉酶、蔗糖酶已作为商品固定化酶。 通通过酶蛋白化学修蛋白化学修饰来增加蛋白来增加蛋白质分子上分子上电荷。能荷。能有效的克服吸附法制有效的克服吸附法

14、制备的固定化的固定化酶在使用在使用过程的解吸程的解吸。用水溶性乙烯顺丁烯二酸酐共聚物共价修饰的胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶、可以用DEAE纤维素和DEAEScphadex载体有效的固定。这种固定几乎是不可逆的吸附。此外酶的吸附与解吸还与介质中离子强度、pH、温度、蛋白质浓度及酶和载体的特性相关。pH的变化影响到载体和酶的电荷，从而影响载体对酶的吸附。在等电点两侧(1-2pH单位)吸附将明显减少，但也有个别例外。盐对吸附的影响较为复杂在一些特殊事例中、盐可以促进蛋白质的吸附。这就是所谓的盐析吸附。对蛋蛋白白质吸附来吸附来说，随温度的升高吸附下降。，随温度的升高吸附下降。载体的表面积、多孔性及其顶处理都

15、影响对酶的吸附。 吸附法制备固定化酶操作简单，可充分选择不同电荷、不同形状的载体，吸附过程可以同时纯化酶，固定化酶在使用过程失活后可重新活化，同时，载体可以回收再利用。但由于有些机理不十分明了，在给酶量、吸附程度与固定化酶活力回收的关系不可预见性大，同时由于吸附法制备的固定化酶易脱落，影响产物纯度和酶的操作为稳定性。共价结合法是将酶蛋白分子上官能团和载体上的反应基团通过化学价键形成不可逆的连接的方法。在温和的条件下能偶联的酶蛋白基团包括有氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基等。常用的载体包括天然高分子（纤维素、琼脂糖、葡萄糖凝胶、胶原及其衍生物），合成

16、高分子(聚酰胺、聚丙烯酰胺、乙烯-顺丁烯二酸酐共聚物等)和无机支持物（多孔玻璃、金属氧化物等）。共价结合法制备的固定化酶，酶和载体的连接键结合牢固，使用寿命长，但制备过程中酶直接参与化学反应，常常引起酶蛋白质的结构发生变化，导致酶活力的下降，往往需要严格控制操作条件才能获得活力较高的固定化酶。(1) 酶分子和载体连接的功能基团 从理论上讲，酶蛋白上可供载体结合的功能基团有以下几种：酶蛋白N端的M氨基或赖氨酸残基的-氨基。酶蛋白C-端的羧基以及Asp残基的-羧基和Glu残基-羧基。Cys残基的巯基。Ser、Tyr、Thr残基的羟基。Phe和Tyr残基的苯环。His残基的咪唑基。Trp残基的吲哚基

17、。 在实际中偶联最普遍的基团是：氨基、羧基以及苯环。被偶联的基团还应是酶活性的非必需基团，否则将导致酶失去活性。(2)载体的体的选择 载体直接关系到固定化酶的性质和形成。对载体的一般要求是:一般一般亲水水载体在蛋白体在蛋白质结合量和固定化合量和固定化酶活力及其活力及其稳定定 性上都性上都优于疏水于疏水载体。体。载体体结构疏松，表面构疏松，表面积大，有一定的机械大，有一定的机械强度。度。载体必体必须有在温和条件与有在温和条件与酶共价共价结合的功能基合的功能基团。载休没有或很少有非休没有或很少有非专一性吸附。一性吸附。载体来源容易便便并能反复使用。体来源容易便便并能反复使用。 (3)偶联反应 酶和

18、载体的连接反应取决于载体上的功能基团和酶分子上的非必需侧链基团，而且是在十分温和的pH、中等离子强度和较低温的缓冲液中进行。现已有许多种偶联反应都能制备固定化酶。这些方法在实际运用中经济意义起着决定性作用，必须考虑到酶的偶联效率固定化酶总活力，操作的简便性以及载体与试剂的成本等因素。现介绍如下：重氮法 是将带芳香族氨基的载体，先用NaNO2和稀盐酸酸处理成重氮盐衍生物，再在中性偏碱(pH89)条件下与酶蛋白发生偶联反应，得到固定化酶。 可能与酶蛋白中Tyr的酚基，His的咪唑基生成重氮衍生物，在过量重氮盐存在下还可与酶蛋白的N端氨基或Lys的氨基形成双偶氮化合物。常用载体及其反应如下：a.多糖

19、类的芳香族氨基衍生物。我国独创的使用对-硫酸脂乙砜基胺(ABSE)多糖(纤维素，葡聚糖，文联琼脂糖，交联琼脂及淀粉)属于此类载体。在碱性条件下用对硫酸脂乙砜基胺话化多糖，制得的醚键连接的乙砜基苯胺衍生物，经重氮化后偶联酶：b.氮基酸共聚体。如LLeu和对氨基DL苯丙氨酸共聚物：待1mol/L的LLeu和对氨基DLPhe的N羧基酐的苯溶液在少量水存在及室温下进行反应制成。共聚物与亚硝酸作用转变为重氮盐，可供酶固定用。用此法制备的固定化酶有蛋白酶、脲酶、核糖核酸酶等。c.聚丙烯酰胺衍生物。该类衍生物的商品名称为bioGel或Enzacry。如EnzacryIAA是含有芳香氨基的聚丙烯酰胺衍生物，经

20、重氮化可固定酶。用此法制备的有氨基酰化酶，淀粉酶等固定化酶。d.苯乙酰树脂。这是聚氨基苯乙烯(a)和一种异丁烯一间一氨基苯乙烯(b)的共聚物，通过重氮化后可固定酶如胃蛋白酶、核糖核酸酶等。e.多孔玻璃的氨基硅烷衍生物。 玻璃的化学改造物多孔玻璃在丙酮中与Y氨基丙基三氧乙烷硅回流加热，生成烷基胺玻璃:烷基氨玻璃用对硝基苯酚氯处理后，再还原，转变为芳香基衍生物:此芳香基衍生物经重氮化后与酶结合产生固定化酶。 芳香烃化反应 具有卤素取代的芳香环或含有卤素取代的杂环的高聚物以及含有卤乙酰基的高聚物，可以通过烷基化、芳香基化，在碱性条件下，与酶分子上的氨基、酚基、巯基等反应，如： a.将纤维素在二恶烷(

21、Diaxanc)-溴乙酸中与嗅乙酰溴反应，形成溴乙酰纤维素，可供胰蛋白酶、糜蛋白酶和核糖核酸酶之固定化：常用载休有卤乙酰、卤异丁烯衍生物，如氯乙酰纤维素、溴乙酰纤维索、碘乙酰纤维素等。b.纤维素等载体在碱性条件下和均三氯三嗪等反应，引入活泼的卤素基后，能与酶的氨基、酚羟基、巯基反应，产生固定化酶。 与纤维素共价结合的另一类芳香烃化功能基是3-F-4，6-二硝基苯。控制pH7，使它勺酶分子的氨基反应，产生固定化酶。c.四元缩合反应 利用四元化合物(羧酸、胺、醛和异氰酸)发生缩合反应，形成N取代的酰胺。在反应中，羧酸(R1)和胺化合物(R2)形成酰胺键，醛(R3)和异氰酸(R4)结合形成酰胺氮的侧

22、链： 当选择适当条件，适当的载体及控制反应液中的添加物，可以使连接键或通过酶的氨基或通过羧基，将酶固定并免除有害反应。例如：在乙醛和小分子的3(二甲氨基)丙基异氰酸存在下，用0.5mol/L HCl维持pH6.5，搅拌反应6h，用带氨基的聚合物，可以与酶分子的羧基偶联。而带COOH的高聚物在醛和异氰酸存在下，可与酶分子的NH2偶联。 d.巯基二硫基交换反应 带有SH或二硫基的载体，通过巯基二硫基的交换反应，和酶分子上非必需巯基偶联。若载体的功能基团为SH时，可先用2，2二吡啶二硫化物处理，生成的二硫基中间产物在酸性条件下能与酶分子的巯基发生交换反应，从而产生固定化酶。此法通过小分子巯基化合物的

23、运转，使载体可以再生：e.金属偶联法 利用某些过渡金属盐溶液将载体(纤维素、尼龙、硼硅玻璃、滤纸及酵母细胞等)浸泡24h，洗除末反应的金属盐后，制得的活化载体放入酶溶液中，即可将酶固定化。如： f.缩合反应 一些带羧基或氨基的载体用羰二亚胺活化后，与酶分子的氨基或羧基直接偶联，形成肽键，产生固定化酶。般在弱酸条件下(pH4.755)将酶、羰二亚胺、载体同时混合，羰二亚胺与载体的羧基反应生成活泼的O乙酰异脲衍生物，与酶分子的氨基缩合成肽键或者重排为酰基脲。 例如以丙烯酰胺和丙烯酸共聚物为载体用缩合法制备固定化胰蛋白酶。0.95g丙烯酸用3mol/L NaOH调pH6.5，加入1.95g丙烯酰胺和

24、0.1g N，N甲叉双丙烯酰胺，再加入0.1mol/L pH6.5磷酸缓冲液，使体积为10m1，加入25mg过硫酸铵和22ulN，N，N，N，N四甲基乙二胺，抽真空除气泡，4聚合30min，压挤成粒，搅拌下水洗丙酮干燥备用。 70g干胶在20m10.5mol/L HCl中搅拌30min，用水和 O.1mol/L pH 6.5磷酸缓冲液洗涤后转至小烧杯，加入3.5ml 0.1mol/L pH65磷酸缓冲液的8.75mg胶原蛋白酶后，搅拌5min，接着加1环己基3(2吗啉乙基)羰二亚胺甲基对甲苯磺酸，连续搅拌18h，洗涤后即为固定化酶。g.叠氮反应 带有羧基或羟基、羧甲基等的载体，首先在酸性条件下

25、用甲醇处理使之酯化，再用水合肼处理形成酰肼，最后在HNO3作用下转变成叠氮衍生物。此衍生物在低温下可与酶蛋白的羟基、酚基或巯基等反应，但产物可用中性羟胺水解掉，使之仅与一NH2反应。 此法常用载体有羧甲基纤维素、CMSephadex、聚天冬氨酸、BioGel.CM100、乙烯顺丁烯二酸酐共聚物、Amberlite IRC50等。叠氮法用途较广，举例如下： 以CM一纤维素(CMC)叠氮衍生物为载体固定化胰蛋白酶。首先，载体的酯化与肼解：CMC依次用水、乙醇和乙醚洗涤，干燥后，悬于无水甲醇，在冰浴冷却下通入HCl气体，使之饱和。室温下过夜，并重复此过程(甲酯化)。然后用甲醇、乙醚充分洗涤，并空气干

26、燥。将产物悬于甲醇中，加入80水合肼，回流1h。放置过夜，过滤，再用甲醇洗涤，干燥。其次为偶联：1g CMC酰肼和150m1 2HCl在冰浴中混合，搅拌下滴加9ml %3 NaNa2，冰水浴中搅拌20min。离心弃去上清液。沉淀用150m1二氧氯环洗涤再用150m1冷的蒸馏水洗涤二次，并且悬于预冷的10ml 0.05mol/L pH87磷酸缓冲液的胰蛋白酶溶液中，5搅拌反应23h，用HCl凋PH4，冷0.001mol/L HCl洗三次，冷水洗一次，冻干，即为固定化酶。j.异硫氰酸反应 含有芳香氨基的载体，在碱性pH条件下，与光气或硫芥子气反应生成异硫氰酸或异琉氰酸衍生物，可在温和条件下与酶分子

27、的氨基连接，产生固定化酶。 用含有酰基叠氮的载体在加热下与HClI反应，亦得到异硫氰酸衍生物亦可用于固定化酶。k.溴化氰亚胺碳酸基反应 含有羟基的载体(如纤维素、葡聚糖、琼脂等)在碱性条件下，载体的羟基与CNBr反应，生成活泼的亚胺碳酸基，在弱碱条件下，可与酶分子的氨基偶联，产生固定化酶。例如：用CNBr活化的琼脂糖固定化胰蛋白酶。将Sepharose 4B用蒸馏水洗净，含0.1g干物质的湿胶加5ml水和4ml现配溴化氰水溶液(25mg/m1)，搅拌下用2mol/LNaOH调pHll.0，2325反应6min，抽干立即用300ml 0.1mol/L NaHCO3洗净, (58min内完成)。活

28、化的载体用0.025mol/L pH10.2（含0.02mol/L CaCl2）硼酸缓冲液液快速淋洗后，用5m1缓冲液转入烧杯内加16mg结晶胰蛋白酶，搅拌4h，用0.1mol/L pH8.5硼酸缓冲液(内含1mol/L NaCl)洗涤后，复用pH4.1的醋酸缓冲液洗涤，便制成了固定化胰蛋白酶。 酰氯化反应 含羧基载体如羧基树脂(Amberlite IRC50等)，可用氯化亚砜处理，生成酰氯衍生物，与酶分子的氨基偶联，产生固定化酶。 m酸酐反应 乙烯或苯乙烯、甲代乙烯基与顺丁烯二酸酐的共聚物，在己二胺作用下，酸酐与酶蛋白的氨基起偶联反应，产生固定化酶。n活化酯法 含羧基的共聚物载体在二环己基碳

29、二亚胺(DDC)存在下用N羟基琥珀酰亚胺活化，产生活化酯，再在温和条件下连接酶。n.含醛基高聚物 多糖类如淀粉、葡聚糖、纤维素等用高碘酸或二甲基砜氧化裂解葡萄糖环，形成含醛基(每葡萄糖产生两个醛基)高聚物，可与酶蛋白氨基反应，产生固定化酶。例如：用甘蔗渣纤维素衍生物固定化木瓜蛋白酶。载体制备：60g甘蔗渣纤维素浸于500ml 0.6NaOH溶液中85处理30min，水洗至中性，抽干。悬浮于NaI04溶液中，空温下搅拌12h，用水反复冲洗、抽干。置于IL脲溶液中，搅拌。产物用水反复洗涤，抽干后，置于12甲醛溶液中搅拌处理12h，用水洗涤，除去过量甲醛，反应过程如下：加酶固定:上述载体1g加入1m

30、g/ml木瓜蛋白酶溶液(pH7.2 0.1mol/L磷酸缓冲液配制)搅拌下48固定18h后，用PH7.2 0.1mol/L磷酸缓冲液(合0.4mol/LNaCl)洗去多余酶液，抽干，即为固定化酶。交交联法法 这是利用双功能或多功能试剂在酶分子间或酶与载体间，或酶与惰性蛋白间进行交联反应，以制备固定化酶的力法。最常用的交联试剂是戊二醛，其他如苯基二异硫氰、双重氮联苯胺-2，2二磺酸、1，5二氟2，4二硝苯、己二酰二胺甲脂等。用戊二醛交联制备固定化酶的反应如下： 交联法有下列方法： (1) 交联酶法 在一定条件下，加入一定量的戊二醛溶液于酶溶液中，生成不溶性固定化酶。这种反应与酶和试剂浓度、溶液P

31、H和离子强度、温度、反应时间均有一定的关系。如木瓜蛋白酶在0.2酶蛋白浓度、2.3戊二醛、pH5.27.2、0下交联24h，可形成固定化酶。其中，FH的影响L分明显，随pH升高，闭定化速度增加5pH低于4不能形成固定化酶。其中，pH的影响十分显著，随pH升高，固定化速度增加；pH低于4不能形成固定化酶。有人认为pH应控制在酶的等电点附近有利于固定化。在交联时，加入一定量中性盐如Na2SO4、（NH4)2SO4等和丙酮等有机溶剂有助于形成固定化酶。温度也有一定影响如木瓜蛋白酶和戊二醛在pH6.0、0长时间反应，只得可溶性固定化酶，若在室温下0一5h，即可形成不溶性固定化酶。这种情况对不同酶可能有

32、不同结果。 这种方法也用于制备交联的结晶酶。交联结晶酶仍具有一定酶活力。 例如：将500mg酶溶于5m1 0.2mol/L pH6醋酸缓冲液中，在搅拌下滴加2m1 2.5戊二醛，在室温下放置1030min，会有沉淀析出，13h内反应结柬。形成的凝胶切碎后水洗，除多余戊二醛，即为固定化酶。(2)酶与辅助蛋白交联法 用双功能或多功能试剂使惰性蛋白与酶共交联从而制备固定化酶由于酶在交联反应过程中因化学修饰而引起失活，或因可得到的酶量有限时，因此，通常以一些辅助蛋白，如牛血清白蛋白、明胶、胶原、抗体等，与酶一起进行交联。 例如：10mg脲酶与2.5ml含6白蛋自、0.2戊二醛的0.02mol/L pH

33、8磷酸缓冲液混合，冷到30后，冉升温至4 下,放置4h将形成的泡沫聚合物彻底洗除后，冻干，即为固定化脲酶。(3)载体交联法 是用多或双功能试剂的一部分功能基团与载体交联，另一部分功能基团与酶蛋白交联而制备固定化酶的方法。例如：尼龙固定化木瓜蛋白酶的制备：尼龙布用含18.6CaC12和18.6水的甲醇溶液处理10min，洗净吸干，于3.65mol/LHCl中45水浴中水解45min，水洗至中性，吸干，用5戊二醛溶液(0.2mol/L pH8.5硼酸缓冲液配制)，于20搅拌交联20min，用PH7.8 0.1mol/L磷酸缓冲液洗去多余戊二醛。2g处理载体(尼龙)加入4ml酶溶液(1mg/ml）于

34、45下固定3h后，用0.1mol/L pH7.5磷酸缓冲液(内含0.5mol/LNaCl)洗涤，除去多余酶液，抽干，即为固定化木瓜蛋白酶。 单用戊二醛等试剂文联制备的固定化酶活力较低，常将此法与吸附法、包埋法结合使用，可以达到既提高固定化酶的活力，又起到加固的效果。 壳聚糖微球固定化木瓜蛋白酶制备。壳聚糖微球制备：4g壳聚糖洛于100m12醋酸溶液，在搅拌下缓慢滴人烧杯中的透平油(酸性胶与透平油的比例为1：3)中，技4：35：1比例加入25戊二醛溶液，再用1mol/L NaOH溶液调pH910，置水浴(60一70)中3h，冷却后，弃去上层油液，依次用石油醚、丙酮、无水乙醇、水洗涤真空干燥备用。

35、 酶的固定化：0.5g载休于0.1mol/L pH7.2磷酸缓冲液浸泡24h，抽干，加入1.6mg/ml的木瓜蛋白酶溶液0.6mL，48下吸附12h，滴入0.6戊二醛溶液3m1于48交联3h后弃去上层溶液，用0.1mol/L pH72磷酸缓冲液(含NaCl 0.5mol/L)洗多次，吸干水分，即得固定化酶。活力回收约60，在填充休反应器内连续水解酪蛋白(05)时半衰期为16d. 包埋法是将聚合物的包埋法是将聚合物的单体与体与酶溶液混合，再借助于聚合助溶液混合，再借助于聚合助进剂(包括交包括交联剂)的作用的作用进行聚合，行聚合，酶被包埋在聚合物中以达被包埋在聚合物中以达到固定化到固定化。包埋法操

36、作简单，由于酶分子只被包埋，未受到化学反应，可以制得较高活力的固定化酶对大多数酶、粗酶制剂甚至完整的微生物细胞都是适用的。但是，只有小分子底物和产物可以通过凝胶网络，而对大分子底物不适宜。同时，凝胶网络对物质扩散的阻力导致固定化酶动力学行为的变化、活力降低。包埋法常用凝胶包埋法和微囊化法。包埋法(1)凝胶包埋法 凝胶包埋法是将凝胶包埋法是将酶分子包埋在凝胶格子中分子包埋在凝胶格子中。聚丙聚丙烯酰胺凝胶包埋法胺凝胶包埋法。一般的制备过程如下：将1ml溶于适当缓冲液的酶溶液加入含有750mg丙烯酰胺(单体)和40mgN，N甲叉双丙烯酰胺(交联剂)的3ml溶液中，再加0.5ml 15的二甲氨基丙腈(

37、加速剂)，同时，加入1过硫酸钾(引发剂)，混合，于25T：保温10min，便得含酶凝胶。将凝胶粉碎，制得不规则的颗粒于低温储存或冷冻干燥。为制得珠状固定化酶，可以在聚合反应开始时，立即转入到疏水相(一种乳化剂，与水相有相同密度)的有机溶液中，使分散成含酶的珠状凝胶。 聚丙聚丙烯酰胺包埋法的缺点是胺包埋法的缺点是酶容易漏失，以低分子量容易漏失，以低分子量蛋白蛋白质为甚，如果甚，如果调整交整交联剂浓度与交度与交联程度可以得到克程度可以得到克服。服。辐射包埋法射包埋法。酶溶于纯单体水溶液、单体加合物水溶液或纯聚合物溶液中在常温或低温下，用x射线、Y射线或电子束辐照。可得到包埋酶的亲水凝胶。如用X射线

38、引发聚丙烯酰胺聚合，可以固定胰蛋白酶。1973年HMaeda等用聚乙烯水溶液辐照包埋了多种酶。运用弱水性或稍微疏水性的玻璃化载体，用低温过冷态的辐照聚和，可用于般生物物质的固定化。这些生物物质主要分布在载体表面层区域，固定化产物表面具有生物活性，曾称这种方法为粘附法。这种方法可粘附酶、叶绿素、病毒等，长期使用后仍有较高的活性。可以使用玻璃化单体，玻璃化单体和非玻璃化单体混合物、单体和天然聚合物的混合物为载体。其他凝胶包埋法。其他凝胶包埋法。 a.淀粉凝胶包埋法淀粉凝胶包埋法。将氨基甲酸乙酯的泡沫垫浸入温热的淀粉溶液和乙酰胆碱脂酶的混合物中，再经冷却、干燥，便制得固定化乙酰胆碱脂酶。，为增强机械

39、强度和重新水合可加入定量的甘油。b.b.胶原包埋法即大分子胶原包埋法即大分子胶原包埋法即大分子胶原包埋法即大分子络络合法合法合法合法。胶原有纤维性，易成膜，能在生理pH下自发的聚焦成束，胶束末端可以通过多种次级键与酶分子相互作用，通过酶和胶原分子形成网架而将酶固定化。其制备方法极为简单：将酶加到胶原悬浮液中、铺膜、干燥即得固定化酶。或者经过透析的酶和胶原混合，插入电极，酶胶原复合物便在电极上沉淀。 c.卡拉胶包埋法卡拉胶包埋法：卡拉胶(KCarrageenin)是由角叉菜(又名鹿角菜:Cawageen)中提取的一种多糖，可以用来包埋酶。具体方法：将100gx酶在3750溶于水中，又将1.7g卡

40、拉胶在40一60溶于34ml生理盐水中，二者混合后冷全10，所成凝胶浸在0.3mol/L KCl 溶液中硬化，作成适当大小的颗粒,即为固定化酶。 d.天然血天然血纤维包埋法包埋法：血纤维不会引起抗体形成，且无毒。在柠檬酸缓冲液中使酶和血纤蛋白原及凝血酶混合、便制得血纤蛋白包埋的固定化酶。酶分子的氨基和血纤蛋白的谷氨酰胺残基之间发生交联而将酶固定化。e.大豆蛋白包埋法大豆蛋白包埋法。含葡萄糖异构酶的链霉菌菌株与大豆蛋白溶液混合，在60用碳酸镁处理使其凝结，过滤制球，干燥后用戊二醛和六甲叉二胺处理，硬化从而制得固定化葡萄糖异构酶。 (2)微囊化法微囊化法 此法是将酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊内

41、。它使酶存在于类似细胞内的环境中，可以防止酶的脱落，防止微囊外环境直接接触从而增加了酶的稳定性同时，小分子底物能通过膜与酶作用，产物经扩散而输出。微囊一般直径约1100um，膜厚约100nm，膜上孔径约3.6nm，表面积与体积之比极大，物质能很快达到平衡，能有效的包埋许多种酶。同时、可用不同类型、不同浓度的酶、细胞提取物或细胞，不同组成和含量的膜包裹组建成人工细胞. 因此，此法在医疗上极为有用。例如固定化天门冬酰胺酶(治疗白血病)就是用这种方法制成的微胶囊。微胶囊的制备方法有4种。界面沉淀法界面沉淀法。是利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成膜，从而将酶包埋的方法。如，含有高浓度

42、血红蛋白的酶溶液在与水不互溶、沸点比水低的有机相中乳化，加入油溶性表面活性剂，形成油包水的微滴，再将溶于有机溶剂的高聚物在搅拌下加入乳化液中，然后加入一种不溶解高聚物的有机溶剂使高聚物在油一水界面上沉淀形成膜，最后移于水相，从而制成固定化酶。作为高聚物有硝酸纤维素、聚苯乙烯和聚甲基丙烯酸甲酯等。如“人造细胞”制备：25ml 10%血红蛋白水溶液(内含适当酶、界面聚合法界面聚合法。界面聚合法是将疏水性和亲水性单体在界面进行聚合，形成半透膜,使酶包埋于半透膜微囊中。此法曾用来制备Asn酶、脲酶等。制备方法一般是：将酶水溶液与亲水单体(如乙二醇)用一种水不溶混的有机溶剂制成乳化液，再将溶于同一有机溶

43、剂疏水单体(如多异氰酸)溶液在搅拌下加入到上述乳化液，便在乳化液中的水相和有机溶剂之间的界面发生聚合化 这样水相中酶便包埋在聚合体(聚脲)膜内。例如用含酶的10血红蛋白水溶液与己甲叉二胺的水溶液混合，立即在1Span85的氯仿-环已烷中分散乳化,加人癸二酰氯(有机相)后，便在油-水界面发生聚合反应，弃除上清液，加入Tween-20去乳化,洗除有机溶剂，除去未聚合单体后，转入水相，制得固定化酶。液体干燥法液体干燥法。此法曾用乙基纤维素和聚苯乙烯包埋过氧化氢酶、脂肪酶等。它是将一种聚合物溶于一种沸点比水低，且与水不混溶的溶剂中加入酶液后，加入油溶性表面活性剂为乳化剂使之乳化。再把它分散于含有保护性

44、胶质如明胶、聚丙烯醇和表面活性剂的水溶液中，第二次乳化.在不断搅拌下，低温真空除去有机溶剂，便得含酶微囊。常用聚合体有乙基纤维素、聚苯乙烯、氯橡皮等，有机溶剂有苯、环己烷和氯仿。红血球包埋法血球包埋法。在高渗溶液中红细胞膨胀伸展后，细胞内血红蛋白漏出，同时胞外蛋白也能扩散进红血球再放进等渗溶液中，红血球膜又回复至正常状态和透性，进入的酶不会漏出来.脂脂质休包埋法。休包埋法。上述微囊法是一种半透性膜将酶包埋，近年来采用双层脂质体形成极细球粒包埋酶。例如将卵磷脂、胆甾醇和二鲸腊磷酯按7：2：1溶于氯仿中再加入酶液，混合物在旋转蒸发器中，在氮气下32转动乳化，然后在室温下保持2h，再在氮气气流中4用

45、音波处理10s，在室温下保持2h，过Sepharose 6B柱，收集脂质体，离心分离脂质体，所得球粒悬浮于缓冲液中，继续音波处理，并过Sepharose 6B柱，可得含酶的微囊。这种微囊液膜当底物产物穿过时、与膜的径无关但与产物或底物对膜成分的溶解度有关。脂脂质体包裹体包裹固定化固定化酶制制备方法方法01概述l吸附（载体结合）法：物理吸附(活性碳，硅胶等)，离子结合（离子交换剂和离子交换树脂），共价结合。作用力增强，对酶影响加大。l物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应，整体结构保持不变，酶的催化活性得到很好保留。但是，由于包埋物或半透膜具有一定的空间或立体阻碍作用，因此对一些反应不适用。l化

46、学法是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上,使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法.01概述酶固定化方法01概述CharacteristicCarrier Binding MethodsCross-linking MethodEntrapping MethodPhysical adsorptionIonic Binding Covalent BindingPreparationEasyEasyDifficultDifficultDifficultEnzyme ActivityLowHighHighModerateHighSubstrate

47、 SpecificityUnchangeableUnchangeableChangeableChangeableUnchangeableBinding ForceWeakModerateStrongStrongStrongRegenerationPossiblePossibleImpossibleImpossibleImpossibleGeneral ApplicationLowModerateModerateLowHighCost of ImmobilizationLowLowHighModerateLowComparison of the Characteristics of Differ

48、ent Methods of Enzyme Immobilization固定化酶在工业生产上的应用乙乙酰 -(DL)- Ala L - Ala +乙酸乙酸乙乙酰 -D - AlaAminoacylase 氨氨 基基 酰 化化 酶固定化固定化酶的的应用用01概述世界上第一种工世界上第一种工业化生化生产的固定化的固定化酶。1969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶，用DEAE-葡聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶，将L-乙酰氨基酸水解生成L-氨基酸，用来拆分DL-乙酰氨基酸，连续生产L-氨基酸。剩余的D-乙酰氨基酸经过消旋化，生成DL-乙酰氨基酸，再进行拆分。生产成本

49、仅为用游离酶生产成本的60左右。 泵储罐反应产物离心机离心机消消旋旋反反应器器固定化酶柱子晶体L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-Ala固定化酶在工业生产上的应用固定化固定化酶的的应用用01概述高果糖高果糖浆的生的生产世界上生产规模最大的一种固定化酶。将培养好的含葡萄糖异构葡萄糖异构酶的放线菌细胞用6065热处理15min，该酶就固定在菌体上，制成固定化酶，催化葡萄糖异构化生成果糖，用于连续生产果葡糖浆。青霉素青霉素酰化化酶转化流程化流程图酶传感器感器l酶传感器是由固定化酶与传感元件两部分组成的，其中酶是与适当的载体结合形成的不溶于水的固定化酶膜。l最常用的酶传感器是酶

50、电极极，即将固定化酶膜与转换电极做在一起，当酶膜与被测物发生催化反应而生成电极活性物质后，电极测定活性物质并将其转换为电信号输出。酶电极极l酶电极是由固定化酶与各种电极密切结合的传感装置。1962年Clark和Lyons提出模型，1967年Updike和Hicks首先制造出酶电极并把它用于葡萄糖的定量分析。l酶电极一般可根据电极检测物理量的不同分为电流型和电压型，前者一般有氧电极、H2O2电极等，后者有NH3、CO2、H2电极等。l较典型的一种酶电极为葡萄糖葡萄糖酶电极极。 葡萄糖电极 半透膜酶胶层感应电极酶电极示意图D葡萄糖O2 D葡萄糖酸1，5内酯H2O固定化固定化酶的的应用用01概述葡萄

51、糖醌H2O葡萄糖酸氢醌葡萄糖氧化葡萄糖氧化酶氢醌 醌2H2ePt铂电极固定化固定化酶的的应用用01概述（2）脲电极Urea + 2H2O 2NH4+2HCO3-脲酶产生的2NH4+为阳离子电极感应。此外还有：氨基酸电极醇电极尿酸电极乳酸电极青霉素电极亚硝酸离子电极：菠菜亚硝酸还原酶产生NH3固定化固定化酶的的应用用01概述一些常一些常见的的酶电极极底 物酶电 极5腺苷酸5腺苷酸脱氨酶NH4+乙醇，醇乙醇脱氢酶Pt过氧化物过氧化氢酶Pt (O2)磷酸葡萄硫酸酯酶+葡萄糖氧化酶Pt (O2)D-氨基酸D氨基酸氧化酶NH4+L-氨基酸L氨基酸氧化酶NH3蔗糖蔗糖酶+葡萄糖氧化酶Pt (H2O2)琥珀

52、酸琥珀酸脱氢酶Pt (O2)硫酸酯芳基硫酸酯酶Pt硫氰酸硫氰酸酶CN硝酸盐硝酸盐还原酶/ 亚硝酸盐还原酶NH4+亚硝酸盐亚硝酸盐还原酶NH3（气体）草酸草酸脱羧酶CO2（气体）青霉素青霉素酶pH乳酸乳酸脱氢酶；细胞色素bPt，Fe（CN）-4L氨基酸脱羧酶CO2L精氨酸精氨酸酶NH4+L天冬酰胺天冬酰胺酶NH4+固定化固定化酶催化反催化反应过程程动力学力学概述概述固定化后固定化后酶性性质变化及化及动力学影响因素力学影响因素外外扩散限制效散限制效应内内扩散限制效散限制效应扩散影响下的表散影响下的表观动力学参数力学参数评价固定化价固定化酶的指的指标：l1 酶活定活定义（IU)：在特定条件下，每一分

53、：在特定条件下，每一分钟催化催化一个微摩一个微摩尔底物底物转化化为产物的物的酶量定量定义为1个个酶活活单位。位。l 计量量单位位l2. 酶比活定比活定义（游离）：每毫克（游离）：每毫克酶蛋白或蛋白或酶RNA（DNA)所具有的所具有的酶活力活力单位位 品品质的体的体现评价固定化价固定化酶的指的指标：l1. 固定化固定化酶的比活：的比活：每（克）干固定化每（克）干固定化酶所具有的所具有的酶活力活力单位。位。 或：或：单位面位面积（cm2）的）的酶活力活力单位表示（位表示（酶膜、膜、酶管、管、酶板）。板）。l2. 操作半衰期操作半衰期：衡量衡量稳定性的指定性的指标。 连续测活条件下固定化活条件下固定

54、化酶活力下降活力下降为最初活力一半所需要的最初活力一半所需要的时间（t1/2）酶活力表活力表现率：率：实测固定化固定化酶总活力与被固定化了的活力与被固定化了的酶在溶液状在溶液状态时总活力之比。活力之比。评价固定化价固定化酶的指的指标：l3. l4.酶活力收率：活力收率：实测固定化固定化酶总活力与固定化活力与固定化时所用全部游离所用全部游离酶的的总活力之比。活力之比。l. l或称偶或称偶联效率，活力保留百分数。效率，活力保留百分数。l5.相相对酶活力：活力：具有相同具有相同酶蛋白（或蛋白（或RNA）量的固定化）量的固定化酶活力与活力与游离游离酶活力的比活力的比值称称为相相对酶活力活力 活力回收和

55、相对活力 酶固定化般比溶液酶的活力下降，固定化酶活力占溶液酶活力的百分数称为活力回收。固定化固定化酶的的稳定性定性 大多数酶在固定化后都不同程度地提高了稳定性，延长了有效寿命。这是由于：第一，固定化增加了酶构象的牢固程度。第二、挡住了不利因素对酶的侵袭。第三，限制了酶分子间的相互作用。但是，如果固定化触及到酶活性敏感区域，也可能导致酶稳定性下降。固定化后固定化后酶性性质变化及化及动力学影响因素力学影响因素热稳定性定性 大多数酶在固定化后与溶液酶相比，有较高的热稳定性，如氨基酰化酶。溶液酶在75保温15min，活力为0；DEAESephadex固定化酶在同样条件下仍有80；DEAE纤维素固定化酶

56、在同样条件下还有60活力。其他如固定化乳酸脱氢酶、脲酶等都比溶液酶的热稳定性提高，这种性质对工业上的应用是有益的。固定化酶反应的温度一般较溶液酶的高，如用CM纤维素固定的胰蛋白酶和糜蛋白酶的最适温度比溶液酶高515。但有时固定化酶的热稳定性和最适温度都低于溶液酶的。固定化后固定化后酶性性质变化及化及动力学影响因素力学影响因素固定化后酶分子与载体多点连接，可防止酶分子伸展变形酶活力的缓慢释放。抑制自降解，提高了酶稳定性酶稳定性提高定性提高固定化后固定化后酶性性质变化及化及动力学影响因素力学影响因素对蛋白蛋白酶的抵抗力提高的抵抗力提高 溶液酶经固定化后提高了对蛋白酶的抵抗能力。比如：氨基酰化酶在胰

57、蛋白酶作用下活力仅存20，而将其固定于DEAE纤维素上在同样条件下仍有80的活力。这可能是因为蛋白酶分子量大，受到空间位阻，不能进入固定化酶中对变性性剂、抑制、抑制剂的抵抗能力提高的抵抗能力提高 酶经固定化后，提高了对蛋白质变性剂和抑制剂的抵抗能力。例如：氨基酰化酶与固定于DEAESephadex的氨基酰化酶比较，前者在6mol、2mol胍、1SDS和4mmol丙酮溶液中活力分别为9、49、1和55，而后者在相应溶液中活力则分别为146、117、35和138。操作操作稳定性定性 固定化酶在操作中可以长期使用，半衰期(t1/2)，即酶活性达到原有酶活性一半时所需的时间)较长。半衰期可按下式计算：

58、式中ED为反应t时的酶浓度，E为原有酶浓度。一些固定化酶的半衰期如下表:贮藏藏稳定性定性 大多数酶经固定化后提高了贮藏的稳定性，如固定化木瓜蛋白酶（琼脂）在4下，120天酶活力无变化。pH一一酶活力关系活力关系 反应的最适pH和酶活力pH曲线的变动依据酶蛋白和载体的电荷而定。带负电荷的载体，往往导致固定化酶的最适pH向碱性方向移动；带正电荷的载体则相反。例如：DEAE纤维素或DEAE葡聚糖固定化氨基酰化酶与其游离酶比较，低0.5个pH而偏向酸性方向。CM一纤维素固定化的胰蛋白酶、糜蛋白酶的最适pH与游离酶比较，向碱性方向偏移0.51个pH单位。尽管大多数固定化酶的活力pH关系曲线仍为钟形曲线，

59、但与溶液酶比较，其钟形更陡，或更坦，向酸性或碱性方向偏移。固定化后固定化后酶性性质变化及化及动力学影响因素力学影响因素 原因是微原因是微环境表面境表面电荷性荷性质影响。影响。 一般一般说来，来，带负电荷荷载体体(阴离子聚合物阴离子聚合物)制制备的固定化的固定化酶，其最适，其最适pH值较游离游离酶偏偏碱碱.原因：阴离子原因：阴离子载体会吸引溶液中的阳离子，体会吸引溶液中的阳离子，包括包括H+，使其附着在，使其附着在载体表面，体表面，结果是固定果是固定化化酶扩散散层H+浓度比外部溶液高，即偏酸，度比外部溶液高，即偏酸，所以外部溶液中的所以外部溶液中的pH必必须向碱性方向移向碱性方向移动固定化固定化

60、对酶最适最适pH的影响的影响固定化后固定化后酶性性质变化及化及动力学影响因素力学影响因素lpH对酶活性的影响：活性的影响：l（1） 改改变酶的空的空间构象构象l（2）影响）影响酶的催化基的催化基团的解离的解离l（3）影响）影响酶的的结合基合基团的解离的解离l（4）改）改变底物的解离状底物的解离状态，酶与底物不能与底物不能结合或合或结合后合后不能生成不能生成产物。物。固定化固定化酶pH的的变化化l1） 载体体带负电荷，荷，pH向碱性方向移向碱性方向移动。 l微微环境是指在固定化境是指在固定化酶附近的局部附近的局部环境，而把主体溶液境，而把主体溶液称称为宏宏观环境。境。l载体体带正正电荷，荷，pH

61、向酸性方向移向酸性方向移动。l（2）产物性物性质对pH的影响的影响l催化反催化反应的的产物物为酸性酸性时，固定化，固定化酶的的pH值比游离比游离酶的的pH值高；反之高；反之则低低最适温度最适温度变化化 一般与游离一般与游离酶差不多，但有些会有差不多，但有些会有较明明显的的变化。化。底物特异性底物特异性变化化作用于低分子底物的作用于低分子底物的酶 特异性没有明特异性没有明显变化化既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的既可作用于低分子底物又可作用于大分子低物的酶 特异性往往会特异性往往会变化。化。 米氏常数米氏常数Km变化化 高高级结构构变化及化及载体影响引起体影响引起酶与底物与底物亲和力的和

62、力的变化，使得化，使得Km变化化 溶液离子溶液离子强度升高，度升高，载体周体周围的静的静电梯梯度逐度逐渐减小，减小，Km变化减小化减小米氏常数米氏常数Km的的变化，化，Km值随随载体性体性质变化化由于分配效由于分配效应：=Si=Si微微环境境/S/S宏宏观环境境 Km=Km/(Km=Km/(表表观米氏常数米氏常数) )l（1 1） 载体与底物体与底物带相同相同电荷，荷，SiS,KmSiS,Km固定化固定化酶降低了降低了酶的的亲和力。和力。l（2 2） 载体与底物体与底物电荷相反，静荷相反，静电作用，作用，SiSSiS，则1,Km1,Kmrd，为外扩散控制，此时有Rsi=rd当Cs0值较高时，r

63、s0rd，为动力学控制，此时有Rsi=rs0当Cs0处于中间范围，称为过渡区，反应速率与扩散速率相差不大rs0rdRsi03 外外扩散限制效散限制效应外外扩散限制散限制时酶反反应速率的速率的计算算03 外外扩散限制效散限制效应外外扩散影响的表征参数散影响的表征参数A.丹克莱尔准数Da（最大反应速率与最大传质速率之比）Da小，反应过程（反应速率）受动力学控制Da大，反应过程（反应速率）受扩散控制。仅一级动力学Da与Cs0无关。对米氏方程动力学:n级动力学r=krCsn:一级动力学：03 外外扩散限制效散限制效应外外扩散影响的表征参数散影响的表征参数A.丹克莱尔准数Da有外扩散影响时实际反应速率与

64、无外扩散影响时反应速率之比。优点：(1)可以推测液膜传质阻力与颗粒内扩散阻力的相对大小，2)计算以颗粒表面浓度为基准的有效因子，必须知道颗粒表面浓度，而当存在液膜传质阻力时，表面浓度的计算非常复杂。但求总有效因子只需要知道溶液主体的浓度即可。03 外外扩散限制效散限制效应外外扩散影响的表征参数散影响的表征参数B. 外扩散有效因子03 外外扩散限制效散限制效应外外扩散与化学抑制同散与化学抑制同时存在的存在的动力学力学非竞争性化学抑制的存在（非（非竞争抑制争抑制动力学）力学）（传质）03 外外扩散限制效散限制效应外外扩散与化学抑制同散与化学抑制同时存在的存在的动力学力学（底物抑制抑制动力学）力学）

65、（传质）底物抑制的存在Cs1Cs2Cs3三个解，稳定性不一致。微扰理论实际处于何解属于操作稳定性问题。03 外外扩散限制效散限制效应外外扩散与化学抑制同散与化学抑制同时存在的存在的动力学力学底物抑制的存在酶扩散表面浓度某一溶液酶催化某底物进行反应，服从M-M反应动力学，其动力学参数为：Km=0.05mol/l,rmax=10mol/(lmin)。将该酶固定在某一不溶性载体上，结果发现，该酶固定化后进行 同 一 反 应 时 ， 其 表 观 动 力 学 参 数 Km=0.08mol/l,而rmax=rmax,试求当底物浓度为1mol/l时，其有效因子是多少？当不存在有扩散影响时，当存在有扩散影响时

66、，因此，解答：例题：某某酶固定在无微孔球形基固定在无微孔球形基质上，其本征上，其本征动力学参数力学参数为rmax=410-5mol/(L S),Km=210-5mol/L. CS0= 110-5 mol/L, kLa= 0.4 s-1, 求求CS和底物在固定化和底物在固定化酶外表面上的反外表面上的反应速率？速率？解解题思路：思路：这是一个外是一个外扩散限制下的固定化散限制下的固定化酶动力学力学问题，当体系达，当体系达到平衡到平衡时，外，外扩散速率与球体表面上的本征反散速率与球体表面上的本征反应速率一致，因此，速率一致，因此，将已知条件代入得：将已知条件代入得：变换为一元二次方程后求解得：一元二

67、次方程后求解得：CS=0.18x10-5mol/L所以所以rsurface=kLax(CS0-CS)=0.4x(1-0.18)x10-5 =0.328x10-5 mol/(L s)第03章固定化酶催化反应过程动力学概述概述固定化后固定化后酶性性质变化及化及动力学影响因素力学影响因素外外扩散限制效散限制效应内内扩散限制效散限制效应扩散影响下的表散影响下的表观动力学参数力学参数第03章固定化酶催化反应过程动力学4 内内扩散限制效散限制效应描述固定化描述固定化酶特征的几个参数特征的几个参数固定化固定化酶内内扩散散过程分析程分析微孔内反微孔内反应组分分浓度分布度分布内内扩散反散反应速率速率计算算外外扩

68、散与化学抑制同散与化学抑制同时存在存在的的动力学力学l比表面积：单位质量载体的内表面积l微孔半径l孔隙率：孔隙体积占颗粒体积之比l颗粒当量直径：体积相当，外表面积相当，比表面积相当，形状系数l颗粒密度：表观密度，真密度，堆密度04 内内扩散限制效散限制效应描述固定化描述固定化酶特征的几个参数特征的几个参数无因次化无因次化3.2.2符合M-M动力学时的浓度分布梯勒模数：表面浓度下反应速率与内扩散传质速率之比边界条件：3.2.2符合M-M动力学时的浓度分布该方程描述了符合米氏方程动力学的球形固定化酶微孔内底物浓度和扩散距离的关系只能通过数值解法得到浓度分布。微孔内扩散n分子扩散：微孔直径比分子运动

69、平均自由程大，扩散阻力主要来自于分子间碰撞。(/d=10)n液相流体一般为分子扩散，满足Fick定律，但扩散系数受微孔影响而减小。引入曲节因子和位阻因子：p：孔隙率p：曲节因子H：位阻因子固定化酶催化反应的内扩散过程分析对于用多孔性介于用多孔性介质或微胶或微胶囊固定的囊固定的酶，则其内其内扩散散阻力将会影响到阻力将会影响到酶反反应速速率率“分布模型分布模型”假假设：1. 等温反等温反应2. 扩散散传质3. 传质稳定定4. 颗粒均匀粒均匀5. 分配系数分配系数为16. 活性活性稳定定7. 浓度梯度一致度梯度一致8. 无外无外扩散散传质阻力阻力固定化酶剖面及浓度分布图04 内内扩散限制效散限制效应

70、分子分子扩散：微孔直径比分子运散：微孔直径比分子运动平均自由程大，平均自由程大，扩散阻力散阻力主要来自于分子主要来自于分子间碰撞。碰撞。( /d=10)液相流体一般液相流体一般为分子分子扩散，散，满足足Fick定律，但定律，但扩散系数受散系数受微孔影响而减小。微孔影响而减小。引入曲引入曲节因子和位阻因子：因子和位阻因子： p：孔隙率：孔隙率 p：曲：曲节因子因子H：位阻因子：位阻因子固定化固定化酶内内扩散散过程分析程分析04 内内扩散限制效散限制效应得到得到浓度分布再度分布再积分得到速率分得到速率稳态假假设，物料衡算，表面，物料衡算，表面传质速率速率速率求解方法的思路速率求解方法的思路04 内

71、内扩散限制效散限制效应对底物：流入流出消耗底物：流入流出消耗积累累浓度分布不随度分布不随时间变化，化，积累累为0。l反反应与与扩散同散同时进行，各行，各处浓度不同因而速率不同，度不同因而速率不同，须先求出先求出浓度分布再度分布再积分得到速率。分得到速率。l如何求如何求浓度分布？（物料衡算）度分布？（物料衡算）l物料衡算体物料衡算体积微元的微元的选择：球状：球状 颗粒粒对一薄壳一薄壳层进行衡算。行衡算。微孔内反微孔内反应组分分浓度分布度分布04 内内扩散限制效散限制效应微孔内反微孔内反应组分分浓度分布度分布04 内内扩散限制效散限制效应无因次化无因次化梯勒模数：表面浓度下反应速率与内扩散传质速率

72、之比04 内内扩散限制效散限制效应M-M动力学力学微孔内反微孔内反应组分分浓度分布度分布边界条件：该方程描述了符合米氏方程动力学的球形固定化酶微孔内底物浓度和扩散距离的关系只能通过数值解法得到浓度分布。04 内内扩散限制效散限制效应M-M动力学力学微孔内反微孔内反应组分分浓度分布度分布底物有浓度分布，酶浓度是否亦有类似分布？04 内内扩散限制效散限制效应M-M动力学力学微孔内反微孔内反应组分分浓度分布度分布一一级反反应动力学力学04 内内扩散限制效散限制效应微孔内反微孔内反应组分分浓度分布度分布一级动力学：边界条件：一一级反反应动力学力学04 内内扩散限制效散限制效应微孔内反微孔内反应组分分浓

73、度分布度分布令则零零级动力学：力学：04 内内扩散限制效散限制效应微孔内反微孔内反应组分分浓度分布度分布零零级动力学：力学：04 内内扩散限制效散限制效应微孔内反微孔内反应组分分浓度分布度分布边界条件：底物浓度降为0时之半径为临界半径Rc:rRc处的酶不起作用，因此最大颗粒半径应使Rc=0零零级动力学力学04 内内扩散限制效散限制效应微孔内反微孔内反应组分分浓度分布度分布大，反应速率快，内扩散速率慢，内扩散影响大小，反应速率慢，内扩散速率快，动力学影响大各种形状颗粒的梯勒模数通式Vp为颗粒体积，Ap为反应表面积。梯勒模数的物理意义及通式公式中各项的意义04 内内扩散限制效散限制效应内内扩散反散

74、反应速率速率计算算l积分法： 各微元速率加和l物料平衡法： 外表面处扩散通过的底物量 即总的反应消耗量。Rs是针对固体颗粒的反应速率。应除以固相分率换算为针对反应器总体积的反应速率。04 内内扩散限制效散限制效应一级动力学：米氏动力学：0级动力学：积分法内内扩散反散反应速率速率计算算04 内内扩散限制效散限制效应有效因子：颗粒内实际反应速率与颗粒内无浓度梯度（即内部浓度等于界面浓度）时反应速率之比。不考虑外扩散时04 内内扩散限制效散限制效应米氏米氏一级动力学颗粒内的浓度梯度颗粒表面处浓度梯度：04 内内扩散限制效散限制效应内内扩散反散反应速率速率计算算扩散到颗粒内的底物量固定化酶的反应速率本

75、征反应速率球形固定化酶内扩散有效因子：一级动力学04 内内扩散限制效散限制效应内内扩散反散反应速率速率计算算膜状固定化酶内扩散有效因子：13时，内扩散控制0.413，过渡区在一级不可逆反应中，固定化酶形状不同，并不会显著影响内扩散有效因子的大小。不同形状固定化酶的1-1关系1104 内内扩散限制效散限制效应内内扩散反散反应速率速率计算算一级动力学而CE0是针对固相颗粒还是反应器总体积呢？由Rsi计算实际速率时，此处的rm是针对固相颗粒还是反应器总体积呢？04 内内扩散限制效散限制效应内内扩散反散反应速率速率计算算一级动力学球形固定化酶内扩散有效因子：假定假定针对固相，固相，则所得速率亦所得速率

76、亦针对固相，固相，转化化为针对反反应器（器（单位体位体积）的速率）的速率为：固定化固定化酶是将是将酶固定于固体上，然后均匀分布于反固定于固体上，然后均匀分布于反应器中，宏器中，宏观上，上，酶的分布的分布还是均匀的是均匀的04 内内扩散限制效散限制效应内内扩散反散反应速率速率计算算04 内内扩散限制效散限制效应内内扩散反散反应速率速率计算算零零级动力学力学底物消耗速率与底物浓度无关(1) 直接法直接法(2) 西勒模数法西勒模数法有效系数：(a)当临界半径Rc0时，(b)当Rc0时(1)直接法以临界半径为判断依据04 内内扩散限制效散限制效应内内扩散反散反应速率速率计算算零零级动力学力学西勒模数：

77、当000，01当00.577时，0与0有如下关系：其中：(2)西勒模数法04 内内扩散限制效散限制效应内内扩散反散反应速率速率计算算零零级动力学力学00.577当00.577时，0与0有如下关系：其中：(2)西勒模数法04 内内扩散限制效散限制效应内内扩散反散反应速率速率计算算零零级动力学力学米氏动力学只能采用数值解法颗粒内部浓度没有解析解有效因子M也没有解析解(2)经验公式法对膜状固定化酶：ab1对球形固定化酶：a2.6，b0.8解法：(1)查图法04 内内扩散限制效散限制效应内内扩散反散反应速率速率计算算1)查图法04 内内扩散限制效散限制效应1)查图法04 内内扩散限制效散限制效应（表（

78、表观泰勒模数）泰勒模数）（泰勒模数）（泰勒模数）（ 因子因子）固定化固定化酶催化催化剂的有效系数的有效系数 M与表与表观泰勒模数泰勒模数 的关系的关系1)查图法04 内内扩散限制效散限制效应1）对in影响不大，影响内影响不大，影响内部部传递效率因子的主要参数效率因子的主要参数是西勒准数是西勒准数。2）若）若0.3，则有有in10, 对于一于一级动力学力学in1/，对于零于零级动力学力学in 2/减少减少值有有3种方法：种方法：减少减少颗粒直径。粒直径。 降低降低rmax(正比正比k+2CE) 通通过温度等条件温度等条件调节rmax/De1) 查图法法04 内内扩散限制效散限制效应第03章固定化

79、酶催化反应过程动力学3 内内扩散限制效散限制效应描述固定化描述固定化酶特征的几个参数特征的几个参数固定化固定化酶内内扩散散过程分析程分析微孔内反微孔内反应组分分浓度分布度分布内内扩散反散反应速率速率计算算外外扩散与化学抑制同散与化学抑制同时存在存在的的动力学力学第03章固定化酶催化反应过程动力学概述概述固定化后固定化后酶性性质变化及化及动力学影响因素力学影响因素外外扩散限制效散限制效应内内扩散限制效散限制效应扩散影响下的表散影响下的表观动力学参数力学参数扩散对表观动力学参数与稳定性的影响a.使反应级数趋向于1b.使动力学参数偏离原来值c.使表观活化能降低d.提高了表观热稳定性第03章固定化酶催

80、化反应过程动力学纤维二糖在固定在藻朊酸钠凝胶上的葡萄糖苷酶的作用下水解为葡萄糖，该固定化酶为球形，其直径d=2.5mm。假设在颗粒内发生的反应为零级反应，k0=0.0765mol/(sm3),纤维二糖通过颗粒内有效扩散系数De=0.610-5cm2/s，试求当纤维二糖在液相主体中浓度为10mol/m3时，该固定化酶有效因子是多少？例题3纤维二糖在固定在藻朊酸钠凝胶上的葡萄糖苷酶的作用下水解为葡萄糖，该固定化酶为球形，其直径d=2.5mm。假设在颗粒内发生的反应为零级反应，k0=0.0765mol/(sm3),纤维二糖通过颗粒内有效扩散系数De=0.610-5cm2/s，试求当纤维二糖在液相主体

81、中浓度为10mol/m3时，该固定化酶有效因子是多少？dm=1.37mm，远小于此颗粒直径。解：由题意可知因此=3，则内扩散有效因子习题3.3习题3.12例例题3.12令得代入得即时，(1)(2)Cs=2mol/kg3.10葡萄糖限制反应，即固定化酶颗粒中心的葡萄糖浓度0即当葡萄糖浓度大于4.4mol/m3时葡萄糖不会限制反应某某酶固定在无微孔的球形固定在无微孔的球形载体上，在排除外体上，在排除外扩散影响的条散影响的条件下件下测得其得其动力学参数力学参数值为rmax=410-5mol/(Ls)，Km= 210-5mol/L。现将将该固定固定 化化酶颗粒放在一底物粒放在一底物浓度度为110-5m

82、ol/L的液相反的液相反应器中器中进行行酶催化反催化反应。并已知在。并已知在该操作条件下流体的体操作条件下流体的体积传质系数系数为410-1S-1。试求：求：(1) 底物在固定化底物在固定化酶外表面上的反外表面上的反应速率速率为多少多少? (2) 该固定化固定化酶的外的外扩散有效因子是多少？散有效因子是多少？ 第三章固定化酶及反应动力学1固定化酶的利弊固定化酶常用方法2与固定化酶相关的常用概念固定化后对酶性质的影响3固定化对酶动力学的影响因素及与这些因素相对应的速率4求解固定化酶动力学的一般性方法5比较外扩散限制和内扩散限制对固定化酶的影响6比较研究外扩散限制和内扩散限制有效因子所起的作用7分

83、析动力学因素和传质因素对固定化酶的影响及在解决问题时的作用8稳态假设在研究固定化酶时所起的作用9Da准数和模数如何在研究固定化酶反应中起作用10解决固定化酶反应速率问题的思路11计算3.4 扩散影响下的表散影响下的表观动力学参数力学参数3.5.1 扩散对反应级数的影响则反应级数趋于一级，因扩散为一级。内扩散控制时(p8889)3.5.2扩散对反应速率与浓度关系的影响3.5.3扩散对反应速率与温度关系的影响扩散严重时，表观活化能降低，温度影响减弱其中：3.5.4扩散对固定化酶失活速率的影响（失活系数）无内扩散时：1，1内扩散严重时：1/，0.5对于一级不可逆失活：内扩散严重时：本征酶反应动力学：

84、3.5.4扩散对固定化酶失活速率的影响蔗糖酶催化蔗糖水解反应蔗糖酶固定在直径为1.6mm有微孔球形树脂颗粒上，其密度为0.1mol酶/g颗粒，这样水溶液在树脂中有效扩散系数为1.3*10-11m2/s，该反应在一篮式反应器内进行，外扩散限制影响可消除。蔗糖浓度为0.85kg/m3。反应的表现速率为1.25*10-3kg/（sm3树脂），Km3.5kg/m3。试求（1）内扩散有效因子是多少？（2）本征一级反应速率常数为多少？3.3假设反应为一级反应假设=3，则内扩散有效因子习题3.33.3：已知表观速率求rm,列方程求解，可先采用简化公式再验证。结果rm=0.0642,有效因子0.1，k1=0.

85、0183。若完整公式迭代得：rm=0.0683,有效因子0.097。本征速率计算时即可采用米氏方程又可采用一级动力学。注意表观速率和本征速率的区分（计算rm时）7题标准计算过程，由计算有效因子求速率。8题计算临界半径求有效因子，个别人结果大于110题以其半径为最大颗粒半径计算Cs0，不用套公式。多人得0.45？习题讲解可直接由物料衡算推导方程，也可引用书中公式由此计算出最大颗粒半径，因其大于颗粒半径，故有效因子为1。注意看清是直径还是半径。零级动力学时k0=rm,而k1=rm/Km，本题注意rm的单位，化为针对体积的。3.2：某固定化酶为球形颗粒，消耗氧为零级动力学，速率常数k03.6mol/

86、（kgh），如果颗粒半径为6mm，对氧的有效扩散系数De1*10-9m2/s，试问：（1）氧在该反应系统变成限制因素的可能性有多大？（2）若将该固定化酶做成条状，每一条体积为6*10-9/m2，表面积为3*10-6/m2，这种变化对其有效因子数值有何变化？3.123.12令得带入得即时，(1)(2)Cs=2mol/kg3.10葡萄糖限制反应，即固定化酶颗粒中心的葡萄糖浓度0即当葡萄糖浓度大于4.4mol/m3时葡萄糖不会限制反应3.12：同10题计算Cs0，片状浓度分布：穿透厚度3.14：计算内扩散梯勒模数和外扩散丹克莱尔准数，也可先计算Csi，再计算Cs0，从而求出本征速率习题：1L均相酶溶

87、液中CE0=1.2mM，测得此时rm24mM/s，Km=3mM。现将这些酶固定化，过程中损失16.7%的酶，固定化后固有动力学参数Km=5mM，仍将这些酶置于1L溶液中进行反应，Cs0=2mM.1.假定固定化酶为球形，颗粒直径0.06cm，固相体积百分数为0.05,传质系数kl为0.4cm/s。只考虑外扩散计算此时反应速率？2还考虑内扩散，De=0.002cm2/s，求有效因子及反应速率（按一级不可逆反应）。3要消除内扩散影响，颗粒直径应为多大？4要消除外扩散影响，颗粒直径应多大？解答：计算固定化后的rm,Km，由颗粒直径计算及固相体积百分数计算比表面积从而得出kla，由稳态方程解出速率。计算

88、固相rm，从而求出梯勒模数及内扩散有效因子，进而计算出总有效因子求得速率。令梯勒模数0.4。直径影响比表面积，使Da小于0.1。复习题1.固定化酶的利弊2.固定化酶常用方法3.与固定化酶相关的常用概念4.固定化后对酶性质的影响5.固定化对酶动力学的影响因素及与这些因素相对应的速率6.求解固定化酶动力学的一般性方法7.比较外扩散限制和内扩散限制对固定化酶的影响8.比较研究外扩散限制和内扩散限制有效因子所起的作用9.分析动力学因素和传质因素对固定化酶的影响及在解决问题时的作用10.稳态假设在研究固定化酶时所起的作用11.Da准数和 模数如何在研究固定化酶反应中起作用12.解决固定化酶反应速率问题的

89、思路13.计算1.2.3 微生物细胞的固定化方法 菌体细胞的固定化方法基本上沿用酶固定化方法，主要有包埋法、吸附法和不用载体法等。(1) 包埋法 包埋法是制备固定化细胞最常用的方法。将产酶菌株用包埋剂如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶、琼脂、海藻酸、卡拉胶、二和三醋酸纤维、胶原、明胶和戊二醛等包埋起来，发挥酶或酶系的作用。1977年我国投入生产的固定化青霉素酰胺酶，是使用明胶、戊二醛包埋大肠杆茵而成。美国、欧洲和日本等大规模生产高果糖浆的工艺多数采用固定化菌体的酶柱工艺。包埋法制备固定化细胞与其制备固定化酶大体相似，兹举例介绍如下。聚丙烯酰胺凝胶包埋法 3m1细胞悬浮液，加入12m1生理盐水和丙烯酰

90、胺2.25g、甲叉双丙烯酰胺O.25g、5二甲氨基丙氰1.5ml及2.5过硫酸铵1.5ml，在10min内聚合，得到终浓度为15的聚丙烯酰胺凝胶切成3mmX3mmX3mm小块，用蒸馏水、生理盐水各洗二次，抽干即可。又如用聚丙烯酰胺包埋大肠杆菌(Ecoli ATCCll303)固定天冬氨酸酶：将大肠杆菌细胞悬浮液和单体溶液(750g丙烯酰胺和40gNN中叉双丙烯酰胺溶于2.4L水)在8混合后，加入100m125(体积比)P二甲氨丙氰和500ml1过硫酸钾，混匀后于2025放置约5min开始聚合并升温，当升至30即用冷水冷却，放置1520min完成聚合。凝胶切成直径34mm颗粒。再用水洗涤。约10

91、ml凝胶相当于1g湿细胞，酶活力约为13001800umol/h。若用1mmol/LMg2+和1mol/L反丁烯二酸(pH8.5)将胶在37保温2448h酶活力可提高910倍。琼脂凝胶包理 3m1细胞悬浮液加入到20ml4琼脂液(45)中，搅拌均匀，凝固后，切成3mm3mm3mm小方块，用100m1生理盐水洗二次。海藻酸包埋 3m1细胞悬浮液加人到20ml 2CaCl2溶液中，置冰箱10h，用100ml生理盐水洗二次。 卡拉胶包埋法 8g湿菌、8m1生理盐水在45混匀；再将1.5g卡拉胶溶于3m1生理盐水中，两者于50混合后、冷至10，30min后将凝胶浸于0.3mol/L KCl溶液中4h，

92、切块或制粒。 明胶包埋法 将3m1细胞悬浮液加入到200ml 10明胶液，34混匀冷凝后，切块，加入20m15戊二醛溶液，室温下文联1.5h，用蒸馏水、生理盐水各洗二次。 其他包埋方法还有胶原膜、四氯化钠在水中形成的聚合的金属氧化物沉淀及液体膜等。(2)吸附法吸附法也分物理吸附法和离子交换吸附法 物理吸附法 物理吸附法是将微生物细胞附着于固体载体上的一种固定方法。载体常用的多孔砖、瓷杯、木屑、蔗渣、聚氯乙烯、硅藻土、玻璃纤维等。如将酵母用聚氯乙烯或多孔砖固定化，每克载体可以固定80mg酵母；也可将固定化的酿酒酵母，装入反应柱，以生产乙醇，乙醇可达120g/L。在环境保护中用木片、石砾等固定微生

93、物细胞作为污水处理的过滤器。物理吸附法载体与微生物细胞间不起反应，吸附量大.但细胞极容易脱落而流失.有待于进一步改善.离子交换吸附法 利用离子交换吸附细胞常用的载体是离于交换树脂，例如利用阴离子交换树脂吸附放线菌含葡萄糖异构酶含酶菌株；用Dowea吸附敏捷固氮菌(含多酶)菌株；用离子交换纤维素吸附无色杆菌(含头孢霉素酰化酶菌株)以及用离子交换纤维素吸附米曲霉含转化酶菌株等获得成功.这种方法制备的固定化细胞，细胞易脱落，需不断补充新细胞. 不用载体法这是选择适当的条件，通过一定处理使酶固定在细胞内的种方法。如葡萄糖异构酶是一种胞内酶，将生物细胞加热至60，10min，其他酶失活，则该酶被固定在细

94、胞内，所以又称加热固定化。又如链霉菌细胞用柠檬酸处理使酶固定在细胞内，若再用壳聚糖处理，使之凝聚干燥即成固定化细胞。2 辅基与辅酶的固定方法2.1辅基的固定方法 对于与酶结合牢固的辅基，可以考虑在固定化酶时一般可以将辅基同时固定，但是在一些条件下如酶蛋白与辅基结合弱而辅基容易泄露时，或者用于亲和层析来分离纯化相应酶等，必须将辅基固定。辅基固定化过程是，将载体与连接臂连接，再以适当反应与辅基连接。裁体应符合以下条件： 没有非专一件吸附，具有多孔性和定的机械强度；具有适合与臂或辅基结合的功能基团；具有化学和生物学稳定性等.载体大多采用琼脂糖，也使用纤维素、多孔玻璃珠或合成高分子材料等。连接臂，尚需

95、考虑其疏水性、亲水性、离子性和体积、长度等因素。选择偶联反应有两种情况： 是在不影响辅基活性条件下，引入适当的功能基团，如羧基或氨基等容易与载体连接；二是如果辅基分子本身具备有参与催化活性的功能基团，无须再引入功能团。如磷酸吡哆醛(胺)、FAD、FMA、TPP、生物素、硫辛酸、卟啉等，大都利用分子本身原有的功能基团。接着，将具有某种功能团的辅基与连接臂结合，再与活化载体结合.用琼脂糖为载体时有如下反应：2.1.1溴化氰法活化载体可直接与辅基偶联。2.1.2带羧基载体2.1.3带氨基载体2.1.4带巯基或二硫基裁体2.1.5带芳香氨基线体2.2辅酶的固定方法辅酶的固定方法主要有两种：载体结合法和

96、包埋法。载体结合法与捕基固定方法相似，主要用于制备亲和吸附利。包埋法中，由于辅酶相对分子质量小，先将辅酶与水溶性高分子结合，然后再来包埋。这种包埋和酶的包埋法相似。因此，辅酶固定化包括：引入一个功能基团，生成辅酶衍生物，再与水溶性高分子聚合物结合。2.2.1引入功能基团 对于一些腺苷酸的辅酶，如NAD+、NADP+、CoA和ATP等，在腺嘌呤的第6位或第8位上引入氨基或羧基。其反应分别如下：2.2.2高分子化 选择高分子化合物时，首先要考虑的是其溶解度大、分子大小适当，既能保持在半适膜内，又不会过大地增加粘度而影响活性；其次是，高分子大小、结构、亲水性、解离基团、结合量等都影响高分子化辅酶的活

97、性。一般引入羧基的辅酶，用碳二亚胺缩合反应使其与聚Lys、聚乙亚胺结合，形成水溶性高分子化合物；引入氨基的辅酶， 一般用BrCN活化后，再与水溶性多糖类(如右旋糖苷)结合，而高分子化。 酶反应器中，使用高分子辅酶衍生物还有捕酶的再生问题。一般采用与主反应共组合和独立进行二种方式来解决。如下页图： 在实践中，许多重要的生物活性物质或生化药物的生物合成中，尚需辅酶参加酶反应，所以，辅酶的固定化和固定化辅酶的再生是酶工程的一项重要任务。目前尚未见用于工业生产的报道。3 动植物细胞固定化3.1植物细胞固定化 植物细胞比菌体细胞娇嫩得多，需要温和的固定化方法。80年代开始研究，目前一般采用吸附法和包埋法

98、(下表 )。3.1.1吸附法 吸附法是将植物细胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂缝内。或吸附于中空纤维外壁上。如将植物细胞定置在中空纤维的外壁与容器内壁之间，培养液及O2在中空维管内流动，透过中空纤维管壁(具半透膜性)，传递给附着于外壁的细胞，细胞代谢产物亦透过外壁随管内培养液流出。利用此法固定的豌豆细胞和胡萝卜细胞进行生产多酚化合物的研究，可连续使用1个多月。又如将洗净、灭茵后的泡沫塑料放进辣椒细胞培养液中，振荡培养一 段时间，细胞吸附于塑料孔洞内，并能生长繁殖。3.1.2包埋法 包埋法是将植物细胞包埋于琼脂、海藻酸钙、聚丙烯酰胺、明胶和角叉菜胶等多孔凝胶中。 Brodelius等(1979)首次用

99、海藻酸钙包埋制备了固定化长春花细胞、毛地黄细胞、海巴戟细胞。3.2 动物细胞固定化 动物细胞比菌体细胞、植物细胞更娇嫩需要最温和的固定化方法。目前,动物细胞固定的方法有吸附法和包埋法两种，其中吸附法用的最多。3.2.1吸附法 由于大多数动物细胞属于附着细胞，它们在培养过程中趋向于附着固体表面。因此，吸附法特别适合于制备固定化动物细胞。主要载体及固定方法有：(1)转瓶法。转瓶是由玻璃或塑料制成。其表面经一定处理而带有电荷，如用高锰酸钾等氧化剂，强酸、强碱或紫外辐射等表而处理，可使动物细胞附着于表面，转瓶以一定旋转速度进行培养.若在转瓶内增大表面积，可提高生产能力。(2)微载体法。微载体是指直径为

100、100200um，相对密度接近于1.0的颗粒固定化载体。它是由表面带有电荷的葡聚糖、明胶、纤维素、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯或玻璃等材料制成的。微载体具有较大的表面，对细胞生长和物质传递特别有利，但强度不够易破碎，使用时间较短，已用于固定多种细胞。如用于生产p干扰素、人纤溶酶原活化剂白细胞介素及各种疫苗的细胞固定化。(3)中空纤维法 中空纤维由聚丙烯、硅化聚碳酸脂等高分子聚合物制成。其管壁具有半透性。将细胞胞置于管外壁扣容器外壳之间，则细胞附着于外壁上，培养液从管内流动，能透过管壁进行质热传递，中空纤维起着体内微血管的作用，有利细胞生长及其新陈代谢。已有多种中空纤维固定化细胞用于生产各种单克降抗体和

101、疫苗等。3.2.2包埋法 包埋法根据载体与方法不同，亦有凝胶包埋法和半透膜包埋法两种.(1)凝胶包埋法。用于动物细胞固定化的凝胶主要有琼脂糖凝胶、海藻酸钙凝胶和血纤蛋白等。琼脂糖包埋法是，将1一2.5的琼脂糖加热溶解后冷至3738,与一定量动物细胞混合后分布于石蜡油中.使温度湖37降至10左右，可得到直径为0.10.3mm的微球状固定化细胞，用于单克隆抗体、白细胞介素等的生产。海藻酸钙凝胶包埋法是，将动物细胞与一定浓度的海藻酸凝胶溶液混合均匀后，用注射器将混合液滴到一定CaCl2溶液中即成。 血纤蛋白包埋法是将动物细胞与血纤蛋白混合后加入凝血酶而固定化。 (2)半透膜包埋法。利用高分子聚合物形成的半透膜将动物细胞包埋形成微囊形固定化动物细胞。例如：先用海藻酸钙包埋动物细胞制成胶粒后，再在外面包一层聚Lys膜，然后放入柠檬酸钠溶液中去除海藻酸钙，便可获得由多聚Lys包埋的动物细胞。