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1、大豆蛋白的提取与含量测定大豆蛋白的提取与含量测定指导老师指导老师指导老师指导老师王国彦王国彦王国彦王国彦序言序言蛋白质化学实验蛋白质化学实验蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质是是是是一一一一切切切切生生生生物物物物体体体体内内内内重重重重要要要要的的的的组组组组成成成成成成成成份份份份，蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质是是是是由由由由二二二二十十十十多多多多种种种种氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸以以以以肽肽肽肽键键键键相相相相互互互互联联联联接接接接而而而而成成成成的的的的复复复复杂杂杂杂的的的的高高高高分分分分子子子子化化化化合合合合物物物物，溶溶溶溶于于于于水水水水时时时时形形形形成成成成亲亲亲亲水水水水胶胶胶胶
2、体体体体溶溶溶溶液液液液。在在在在酸酸酸酸碱碱碱碱和和和和酶酶酶酶的的的的作用下，蛋白质被水解成胶胨肽最后形成氨基酸。作用下，蛋白质被水解成胶胨肽最后形成氨基酸。作用下，蛋白质被水解成胶胨肽最后形成氨基酸。作用下，蛋白质被水解成胶胨肽最后形成氨基酸。蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质分分分分子子子子依依依依靠靠靠靠氢氢氢氢键键键键、盐盐盐盐键键键键等等等等副副副副价价价价键键键键维维维维持持持持一一一一定定定定的的的的空空空空间间间间构构构构型型型型。在在在在各各各各种种种种物物物物理理理理化化化化学学学学因因因因素素素素影影影影响响响响下下下下，由由由由于于于于副副副副价价价价键键键键的的的的破破破破
3、裂裂裂裂，使使使使其其其其空空空空间间间间结结结结构构构构遭遭遭遭受受受受不不不不同同同同程程程程度度度度的的的的破破破破坏坏坏坏，蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的物物物物理理理理化化化化学学学学性性性性质质质质和和和和生生生生物物物物学学学学活活活活性性性性也也也也随随随随着着着着改改改改变变变变。该该该该现现现现象象象象称称称称为为为为蛋蛋蛋蛋白质的变性。白质的变性。白质的变性。白质的变性。蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质分分分分子子子子是是是是含含含含有有有有酸酸酸酸性性性性基基基基团团团团和和和和碱碱碱碱性性性性基基基基团团团团的的的的两两两两性性性性电电电电解解解解质质质质，在在在在等等等等
4、电电电电点点点点时时时时，蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质分分分分子子子子的的的的酸酸酸酸性性性性基基基基团团团团和和和和碱碱碱碱性性性性基基基基团团团团的的的的解解解解离离离离度度度度相相相相等等等等，成成成成为为为为带带带带有有有有正正正正负负负负电电电电荷荷荷荷相相相相等等等等的的的的两两两两性性性性离离离离子子子子，在在在在电电电电场场场场中中中中不不不不向向向向两两两两极极极极移移移移动动动动，并并并并且且且且极极极极易易易易沉沉沉沉淀淀淀淀。氨氨氨氨基基基基酸酸酸酸组组组组成成成成不不不不同同同同的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质，具具具具有有有有不不不不同同同同的的的的等等等等电电电电点点
5、点点。根根根根据据据据在在在在一一一一定定定定条条条条件件件件下下下下（如如如如PHPH，离离离离子子子子强强强强度度度度等等等等）它它它它们们们们所所所所带带带带电电电电荷荷荷荷的的的的数数数数量量量量和和和和种种种种类类类类，分分分分子子子子的的的的大大大大小小小小及及及及形形形形状状状状等等等等方方方方面面面面的的的的差差差差异异异异，可可可可以以以以采采采采用用用用电电电电泳泳泳泳，离离离离子子子子交交交交换换换换柱柱柱柱层层层层析析析析等方法对它们进行分离分析。等方法对它们进行分离分析。等方法对它们进行分离分析。等方法对它们进行分离分析。许许许许多多多多物物物物理理理理化化化化学学学
6、学因因因因素素素素可可可可以以以以改改改改变变变变蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质在在在在水水水水中中中中的的的的溶溶溶溶解解解解度度度度，产产产产生生生生可可可可逆逆逆逆或或或或不不不不可可可可逆逆逆逆沉沉沉沉淀淀淀淀，这这这这些些些些因因因因素素素素（如如如如增增增增加加加加溶溶溶溶液液液液的的的的离离离离子子子子强强强强度度度度，降降降降低低低低溶溶溶溶液液液液的的的的介介介介电电电电常常常常数数数数，调调调调节节节节溶溶溶溶液液液液的的的的PHPH等等等等）以以以以及及及及一一一一些些些些沉沉沉沉淀淀淀淀剂剂剂剂和和和和胶胶胶胶附附附附剂剂剂剂也也也也常常常常用用用用来来来来分分分分离离离离，
7、提提提提纯纯纯纯蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质或或或或除除除除去去去去蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质。为为为为了了了了更更更更好好好好地地地地使使使使同同同同学学学学们们们们运运运运用用用用和和和和掌掌掌掌握握握握好好好好理理理理论论论论和和和和实实实实践践践践相相相相结结结结合合合合，把把把把学学学学到到到到的的的的理理理理论论论论应应应应用用用用到到到到实实实实验验验验中中中中，本本本本系系系系列列列列实实实实验验验验安安安安排排排排是是是是从从从从一一一一种种种种生生生生物物物物中中中中提提提提取取取取蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质，通通通通过过过过各各各各种种种种物物物物理理理理化化化化学学学学性性性性
8、质质质质使使使使其其其其得到纯化，得到蛋白质，并进行浓度测定，计算其收率。得到纯化，得到蛋白质，并进行浓度测定，计算其收率。得到纯化，得到蛋白质，并进行浓度测定，计算其收率。得到纯化，得到蛋白质，并进行浓度测定，计算其收率。 蛋白质性质与应用技术关系图蛋白质性质与应用技术关系图蛋白质酸碱酶极性电荷离子交换层析电泳形状分子量离心凝胶层析肽 氨基酸疏水性亲水性低层析 一、大豆蛋白的提取大豆蛋白的提取 目的要求目的要求目的要求目的要求1、掌握大豆蛋白的提取原理和方法掌握大豆蛋白的提取原理和方法掌握大豆蛋白的提取原理和方法掌握大豆蛋白的提取原理和方法2 2 、计算粗提产率、计算粗提产率、计算粗提产率、
9、计算粗提产率2 2、学习计算蛋白质收率、学习计算蛋白质收率、学习计算蛋白质收率、学习计算蛋白质收率 实验原理实验原理实验原理实验原理大豆中含有丰富的蛋白质、根据其性质不同，可以分为水溶蛋大豆中含有丰富的蛋白质、根据其性质不同，可以分为水溶蛋大豆中含有丰富的蛋白质、根据其性质不同，可以分为水溶蛋大豆中含有丰富的蛋白质、根据其性质不同，可以分为水溶蛋白、盐溶蛋白、醇溶蛋白、碱溶蛋白。将豆粉依次用上述溶剂提白、盐溶蛋白、醇溶蛋白、碱溶蛋白。将豆粉依次用上述溶剂提白、盐溶蛋白、醇溶蛋白、碱溶蛋白。将豆粉依次用上述溶剂提白、盐溶蛋白、醇溶蛋白、碱溶蛋白。将豆粉依次用上述溶剂提取，并用有机溶剂沉淀，可制得
10、各部分蛋白质的干粉。本实验主取，并用有机溶剂沉淀，可制得各部分蛋白质的干粉。本实验主取，并用有机溶剂沉淀，可制得各部分蛋白质的干粉。本实验主取，并用有机溶剂沉淀，可制得各部分蛋白质的干粉。本实验主要是水溶提取大豆蛋白。要是水溶提取大豆蛋白。要是水溶提取大豆蛋白。要是水溶提取大豆蛋白。称出提出蛋白质的重量，已知原料重量，可以求出蛋白质的收率。称出提出蛋白质的重量，已知原料重量，可以求出蛋白质的收率。称出提出蛋白质的重量，已知原料重量，可以求出蛋白质的收率。称出提出蛋白质的重量，已知原料重量，可以求出蛋白质的收率。 试剂和器材试剂和器材1 1、试剂、试剂、试剂、试剂（1 1）10%10%NaclN
11、acl（2 2）0.2%0.2%NaoHNaoH（3 3）75%75%乙醇乙醇乙醇乙醇（4 4）6 6mol/LHCLmol/LHCL（5 5）1mol/LHCL1mol/LHCL（6 6）1mol/L1mol/LNaoHNaoH2 2、器材、器材、器材、器材（1 1）离心机）离心机）离心机）离心机（2 2）烧杯）烧杯）烧杯）烧杯 （3 3）滴管）滴管）滴管）滴管（4 4）PHPH试纸等试纸等试纸等试纸等 操作方法操作方法1 1、水抽提水抽提水抽提水抽提将将将将豆豆豆豆粉粉粉粉5 5g g用用用用约约约约4040毫毫毫毫升升升升左左左左右右右右的的的的蒸蒸蒸蒸馏馏馏馏水水水水少少少少量量量量多
12、多多多次次次次的的的的添添添添加加加加搅搅搅搅拌拌拌拌 ， 常常常常 温温温温 下下下下 搅搅搅搅 拌拌拌拌 抽抽抽抽 提提提提 1515minmin， 3800r/min3800r/min离离离离 心心心心1515minmin，取上清液，如上清液不清澈再经过滤。取上清液，如上清液不清澈再经过滤。取上清液，如上清液不清澈再经过滤。取上清液，如上清液不清澈再经过滤。取上清液取上清液取上清液取上清液1 1毫升稀释毫升稀释毫升稀释毫升稀释5050倍留做蛋白测定。倍留做蛋白测定。倍留做蛋白测定。倍留做蛋白测定。其其其其余余余余清清清清液液液液加加加加入入入入等等等等体体体体积积积积在在在在冰冰冰冰箱箱
13、箱箱中中中中预预预预冷冷冷冷的的的的丙丙丙丙酮酮酮酮，用用用用滴滴滴滴管管管管少少少少量量量量多多多多次次次次慢慢慢慢慢慢慢慢滴滴滴滴加加加加（搅搅搅搅拌拌拌拌）6 6mol/Lmol/L和和和和11mol/Lmol/L HCLHCL，调调调调PH4.55.0PH4.55.0，3800r/min3800r/min，离离离离心心心心1515minmin，收收收收集集集集沉沉沉沉淀淀淀淀物物物物，反反反反复复复复用用用用丙丙丙丙酮酮酮酮搅搅搅搅拌拌拌拌洗洗洗洗涤涤涤涤离离离离心心心心2 2次次次次，得得得得到到到到粉粉粉粉末末末末状状状状蛋蛋蛋蛋白白白白质干粉，称重，计算粗产率。质干粉，称重，计算
14、粗产率。质干粉，称重，计算粗产率。质干粉，称重，计算粗产率。蛋白质产物重量蛋白质产物重量蛋白质产物重量蛋白质产物重量蛋白质产率蛋白质产率蛋白质产率蛋白质产率=100%=100%原料总重量原料总重量原料总重量原料总重量思考题思考题思考题思考题1 1、用用用用丙丙丙丙酮酮酮酮沉沉沉沉淀淀淀淀蛋蛋蛋蛋白白白白时时时时，为为为为何何何何要要要要调调调调PH4.55.0PH4.55.0？2 2、大豆中哪类蛋白含量最多？大豆中哪类蛋白含量最多？大豆中哪类蛋白含量最多？大豆中哪类蛋白含量最多？Folin酚法测定蛋白质浓度见第二实验部分酚法测定蛋白质浓度见第二实验部分酚法测定蛋白质浓度见第二实验部分酚法测定蛋
15、白质浓度见第二实验部分Folin酚法测定蛋白质含量酚法测定蛋白质含量目的要求目的要求目的要求目的要求掌握掌握掌握掌握FolinFolin酚法测定蛋白浓度的原理和方法酚法测定蛋白浓度的原理和方法酚法测定蛋白浓度的原理和方法酚法测定蛋白浓度的原理和方法蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质浓浓浓浓度度度度可可可可以以以以从从从从它它它它们们们们的的的的物物物物理理理理化化化化学学学学性性性性质质质质，如如如如比比比比重重重重、紫紫紫紫外外外外吸吸吸吸收收收收，折折折折射射射射率率率率等等等等测测测测定定定定而而而而得得得得知知知知；或或或或用用用用化化化化学学学学方方方方法法法法，如如如如定定定定氮氮氮氮、双双
16、双双缩缩缩缩脲脲脲脲反反反反应应应应，FolinFolin酚酚酚酚试试试试剂剂剂剂反反反反应应应应等等等等方方方方法法法法来来来来计计计计算算算算。也也也也可可可可以以以以用用用用染染染染色色色色法法法法，如如如如氨氨氨氨基基基基黑黑黑黑，考考考考马马马马斯斯斯斯亮亮亮亮蓝蓝蓝蓝法法法法测测测测定定定定。还还还还可可可可以以以以用用用用荧荧荧荧光光光光激激激激发发发发法法法法，氰氰氰氰胺胺胺胺，放放放放射射射射性性性性同同同同位位位位素素素素计计计计数数数数等等等等灵灵灵灵敏敏敏敏度度度度较较较较高高高高的的的的方方方方法法法法。在在在在这这这这些些些些方方方方法法法法中中中中，其其其其中中中
17、中双双双双缩缩缩缩脲脲脲脲法法法法和和和和FolinFolin酚酚酚酚法法法法是是是是一一一一般般般般实实实实验验验验室室室室中中中中常常常常用用用用的的的的方方方方法法法法，它它它它们们们们操操操操作作作作简简简简便便便便，迅迅迅迅速速速速，不不不不需需需需要要要要复复复复杂杂杂杂而而而而昂昂昂昂贵贵贵贵的的的的仪仪仪仪器器器器。FolinFolin酚酚酚酚法法法法灵灵灵灵敏敏敏敏度度度度高高高高，比比比比双双双双缩缩缩缩脲脲脲脲法法法法灵灵灵灵敏敏敏敏100100倍。倍。倍。倍。原理原理原理原理FolinFolin酚法是所用试剂是由两部分组成，试剂甲相当于双缩脲试剂，蛋白质酚法是所用试剂是
18、由两部分组成，试剂甲相当于双缩脲试剂，蛋白质酚法是所用试剂是由两部分组成，试剂甲相当于双缩脲试剂，蛋白质酚法是所用试剂是由两部分组成，试剂甲相当于双缩脲试剂，蛋白质中的肽键在碱性条件下可与铜离子起显色反应。试剂乙中的磷钼酸和磷钨中的肽键在碱性条件下可与铜离子起显色反应。试剂乙中的磷钼酸和磷钨中的肽键在碱性条件下可与铜离子起显色反应。试剂乙中的磷钼酸和磷钨中的肽键在碱性条件下可与铜离子起显色反应。试剂乙中的磷钼酸和磷钨酸在碱性条件下不稳定，易被酚类还原而呈兰色（钼兰和钨兰混合物）。酸在碱性条件下不稳定，易被酚类还原而呈兰色（钼兰和钨兰混合物）。酸在碱性条件下不稳定，易被酚类还原而呈兰色（钼兰和钨
19、兰混合物）。酸在碱性条件下不稳定，易被酚类还原而呈兰色（钼兰和钨兰混合物）。 由由由由于于于于蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质中中中中含含含含有有有有带带带带酚酚酚酚基基基基的的的的酪酪酪酪氨氨氨氨酸酸酸酸还还还还原原原原呈呈呈呈兰兰兰兰色色色色，溶溶溶溶液液液液兰兰兰兰色色色色的的的的深深深深浅浅浅浅与与与与蛋蛋蛋蛋白白白白浓浓浓浓度度度度有有有有较较较较好好好好的的的的线线线线性性性性关关关关系系系系。因因因因此此此此用用用用FolinFolin酚法测定蛋白质含量，灵敏度较高。酚法测定蛋白质含量，灵敏度较高。酚法测定蛋白质含量，灵敏度较高。酚法测定蛋白质含量，灵敏度较高。样样样样品品品品中中中中含
20、含含含酚酚酚酚类类类类化化化化合合合合物物物物及及及及柠柠柠柠檬檬檬檬酸酸酸酸均均均均有有有有干干干干扰扰扰扰作作作作用用用用，如如如如果果果果样样样样品品品品酸酸酸酸度度度度较较较较高高高高则则则则显显显显色色色色较较较较浅浅浅浅，要要要要提提提提高高高高碳碳碳碳酸酸酸酸钠钠钠钠一一一一氢氢氢氢氧氧氧氧化化化化钠钠钠钠的的的的浓度。此法也可测定溶液中酪氨酸和色氨酸的浓度。浓度。此法也可测定溶液中酪氨酸和色氨酸的浓度。浓度。此法也可测定溶液中酪氨酸和色氨酸的浓度。浓度。此法也可测定溶液中酪氨酸和色氨酸的浓度。FolinFolin酚酚酚酚法法法法有有有有不不不不少少少少具具具具有有有有操操操操作
21、作作作方方方方法法法法，但但但但基基基基本本本本原原原原理理理理都都都都是是是是一一一一个个个个，只只只只是是是是在在在在各各各各溶溶溶溶液液液液的的的的浓浓浓浓度度度度及及及及填填填填加加加加量量量量上上上上，保保保保温温温温的的的的温温温温度度度度及及及及保保保保温温温温时时时时间间间间上上上上有有有有所所所所不不不不同同同同而而而而已已已已，本本本本实实实实验验验验所所所所介介介介绍绍绍绍的的的的是是是是本本本本室室室室常常常常用用用用的的的的，灵敏度较高的操作方法。灵敏度较高的操作方法。灵敏度较高的操作方法。灵敏度较高的操作方法。 试剂和器材试剂和器材1 1、材料：、材料：、材料：、材
22、料：本本本本实实实实验验验验所所所所提提提提取取取取大大大大豆豆豆豆蛋蛋蛋蛋白白白白水水水水提提提提取取取取液液液液，经经经经合合合合适适适适稀稀稀稀释释释释至至至至可可可可测测测测定范围。定范围。定范围。定范围。2 2、试剂：、试剂：、试剂：、试剂：（1 1）0.030.03mol/LPH7.8mol/LPH7.8的磷酸缓冲液。的磷酸缓冲液。的磷酸缓冲液。的磷酸缓冲液。（2 2）200200g/mlg/ml的标准酪（牛血清）蛋白溶液。的标准酪（牛血清）蛋白溶液。的标准酪（牛血清）蛋白溶液。的标准酪（牛血清）蛋白溶液。（3 3）FolinFolin试剂甲：（俗称碱性铜试剂）：试剂甲：（俗称碱性
23、铜试剂）：试剂甲：（俗称碱性铜试剂）：试剂甲：（俗称碱性铜试剂）：1010g gNaoHNaoH溶于溶于溶于溶于400400mlml水中，再加水中，再加水中，再加水中，再加5050gNagNa2 2COCO3 3；称称称称 取取取取 0.50.5g g酒酒酒酒 石石石石 酸酸酸酸 钾钾钾钾 钠钠钠钠 溶溶溶溶 于于于于 8080mlHmlH2 2OO中中中中 ， 再再再再 加加加加0.250.25gCuSOgCuSO4 4；以以以以上上上上两两两两溶溶溶溶液液液液混混混混合合合合定定定定容容容容到到到到500500mlml，冰冰冰冰箱箱箱箱保存可用一个月。保存可用一个月。保存可用一个月。保存可
24、用一个月。4 4、FolinFolin试试试试剂剂剂剂乙乙乙乙：在在在在2 2升升升升磨磨磨磨口口口口回回回回流流流流装装装装置置置置的的的的烧烧烧烧瓶瓶瓶瓶内内内内，加加加加钨钨钨钨酸酸酸酸钠钠钠钠（NaWONaWO4 4 2H2H2 2OO）100g100g，钼钼钼钼酸酸酸酸钠钠钠钠（NaMoONaMoO 2M2M2 2OO）25g25g，蒸蒸蒸蒸馏馏馏馏水水水水700700mlml，85%85%的的的的磷磷磷磷酸酸酸酸5050mlml，浓浓浓浓盐盐盐盐酸酸酸酸100100mlml，充充充充分分分分混混混混合合合合后后后后，小小小小火火火火回回回回流流流流1010小小小小时时时时，再再再再
25、加加加加硫硫硫硫酸酸酸酸锂锂锂锂（LiLi2 2SOSO4 4）150g150g，蒸蒸蒸蒸馏馏馏馏水水水水5050mlml及及及及数数数数滴滴滴滴溴溴溴溴。然然然然后后后后开开开开口口口口沸沸沸沸腾腾腾腾1515minmin，以以以以驱驱驱驱除除除除过过过过量量量量的的的的溴溴溴溴，冷冷冷冷却却却却后后后后定定定定容容容容到到到到10001000mlml，过过过过滤滤滤滤后后后后呈呈呈呈金金金金黄黄黄黄色色色色，于于于于棕棕棕棕色色色色并中保存，可使用多年。并中保存，可使用多年。并中保存，可使用多年。并中保存，可使用多年。上上上上述述述述制制制制备备备备的的的的FolinFolin试试试试剂剂
26、剂剂乙乙乙乙的的的的贮贮贮贮备备备备液液液液浓浓浓浓度度度度一一一一般般般般在在在在2 2mol/Lmol/L左左左左右右右右，几几几几种种种种操操操操作作作作方方方方案案案案都都都都是是是是把把把把FolinFolin试试试试剂剂剂剂乙乙乙乙稀稀稀稀释释释释至至至至1 1mol/Lmol/L的的的的酸酸酸酸度度度度作作作作为为为为应应应应用用用用液液液液，我我我我们们们们是是是是把把把把贮贮贮贮备备备备液液液液于于于于作作作作用用用用前前前前稀稀稀稀释释释释1818倍倍倍倍，使使使使之之之之浓浓浓浓度度度度为为为为0.10.1mol/Lmol/L略略略略高高高高。这这这这种种种种稀稀稀稀释释
27、释释1818倍倍倍倍后后后后的的的的FolinFolin试试试试剂剂剂剂乙乙乙乙就就就就是是是是下下下下文文文文称称称称之之之之为为为为应应应应用用用用液液液液，FolinFolin试试试试剂剂剂剂乙乙乙乙贮贮贮贮备备备备液液液液浓浓浓浓度度度度的的的的标标标标定定定定，一一一一般般般般是是是是以以以以酚酚酚酚酞酞酞酞为为为为指指指指示示示示剂剂剂剂，用用用用FolinFolin试试试试剂剂剂剂乙乙乙乙去去去去滴滴滴滴定定定定1 1mol/Lmol/L左左左左右右右右的的的的标标标标准准准准NaOHNaOH溶溶溶溶液液液液，当当当当溶溶溶溶液液液液颜颜颜颜色色色色由由由由红红红红变变变变为为为
28、为紫紫紫紫灰灰灰灰色色色色，再再再再突突突突然然然然变变变变成成成成黑黑黑黑绿绿绿绿既既既既为为为为终终终终点点点点。如如如如果果果果用用用用NaOHNaOH去去去去滴滴滴滴定定定定FolinFolin乙乙乙乙，终终终终点点点点不不不不太太太太好好好好掌掌掌掌握握握握，溶液的颜色是由浅黄色变为浅绿色，再变为灰紫色为终点。溶液的颜色是由浅黄色变为浅绿色，再变为灰紫色为终点。溶液的颜色是由浅黄色变为浅绿色，再变为灰紫色为终点。溶液的颜色是由浅黄色变为浅绿色，再变为灰紫色为终点。3、器材：、器材：试管试管10支支试管架一个试管架一个移液管：（移液管：（5ml、1ml）移液管架移液管架洗瓶洗瓶恒温水浴
29、恒温水浴723型分光光度计型分光光度计 操作方法操作方法1 1、标准曲线的制作：、标准曲线的制作：、标准曲线的制作：、标准曲线的制作：标准酪蛋白溶液：用标准酪蛋白溶液：用标准酪蛋白溶液：用标准酪蛋白溶液：用0.030.03mol/Lmol/L的磷酸缓冲液溶解的酪的磷酸缓冲液溶解的酪的磷酸缓冲液溶解的酪的磷酸缓冲液溶解的酪蛋白，浓度为蛋白，浓度为蛋白，浓度为蛋白，浓度为200200g/mlg/ml。用一支用一支用一支用一支0.50.5mlml移液管分别取移液管分别取移液管分别取移液管分别取上述标准酪蛋溶液上述标准酪蛋溶液上述标准酪蛋溶液上述标准酪蛋溶液0 0ml, ml, 0.1ml0.1ml，
30、0.2ml0.2ml，0.4ml0.4ml，0 0.6ml.6ml，0.8ml0.8ml，1.0ml1.0ml各加到一支试管中去，将此吸管用各加到一支试管中去，将此吸管用各加到一支试管中去，将此吸管用各加到一支试管中去，将此吸管用0.030.03mol/LPH7.8mol/LPH7.8的磷酸缓冲液，反复洗净，再用同一的磷酸缓冲液，反复洗净，再用同一的磷酸缓冲液，反复洗净，再用同一的磷酸缓冲液，反复洗净，再用同一支移液管（防止未经标定吸量管的相对误差的影响）取支移液管（防止未经标定吸量管的相对误差的影响）取支移液管（防止未经标定吸量管的相对误差的影响）取支移液管（防止未经标定吸量管的相对误差的影
31、响）取上述缓冲液将每支试管中的溶液补加至上述缓冲液将每支试管中的溶液补加至上述缓冲液将每支试管中的溶液补加至上述缓冲液将每支试管中的溶液补加至1 1mlml。再在另一再在另一再在另一再在另一支试管中加入支试管中加入支试管中加入支试管中加入1 1mlml缓冲液作空白对照。于上述试管中各缓冲液作空白对照。于上述试管中各缓冲液作空白对照。于上述试管中各缓冲液作空白对照。于上述试管中各加入加入加入加入1 1mlFolinmlFolin试剂甲并不时地进行振荡，试剂甲并不时地进行振荡，试剂甲并不时地进行振荡，试剂甲并不时地进行振荡，1010minmin后再加后再加后再加后再加入后入后入后入后1 1inin
32、试剂乙的应用液试剂乙的应用液试剂乙的应用液试剂乙的应用液4 4毫升。立既摇匀放入毫升。立既摇匀放入毫升。立既摇匀放入毫升。立既摇匀放入5555水溶水溶水溶水溶中保湿中保湿中保湿中保湿5 5minmin。取出后用自来水冷却取出后用自来水冷却取出后用自来水冷却取出后用自来水冷却1 1minmin。于波长于波长于波长于波长650650nmnm进行比色测定各管的进行比色测定各管的进行比色测定各管的进行比色测定各管的ODOD值，以蛋白质的浓度为值，以蛋白质的浓度为值，以蛋白质的浓度为值，以蛋白质的浓度为横坐标，横坐标，横坐标，横坐标，ODOD值为纵坐标，既可得到标准曲线。值为纵坐标，既可得到标准曲线。值
33、为纵坐标，既可得到标准曲线。值为纵坐标，既可得到标准曲线。 FolinFolin- -酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作：酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作：酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作：酚法测定蛋白质含量工作曲线的制作：取取取取7 7支试管（干燥的）按下表顺序分别加入各种试剂并进支试管（干燥的）按下表顺序分别加入各种试剂并进支试管（干燥的）按下表顺序分别加入各种试剂并进支试管（干燥的）按下表顺序分别加入各种试剂并进行反应和测定行反应和测定行反应和测定行反应和测定 试管号试管号试管号试管号1 12 23 34 45 56 67 7蛋白质标准液（蛋白质标准液（蛋白质标准液（蛋白质标准液（mlml
34、）（mg)mg)0 0000.10.10.020.020.20.20.040.040.40.40.080.080.60.60.120.120.80.80.160.161.01.00.20.2PH7.8PH7.8的的的的bufferbuffer（mlml）110.90.90.80.80.60.60.40.40.20.20 0FolinFolin- -甲试剂甲试剂甲试剂甲试剂 （mlml）1 11 11 11 11 11 11 1于室温下不停地振荡于室温下不停地振荡于室温下不停地振荡于室温下不停地振荡1010minminFolinFolin- -乙应用液乙应用液乙应用液乙应用液（mlml）4 44
35、 44 44 44 44 44 4立即摇匀，在立即摇匀，在立即摇匀，在立即摇匀，在5555恒温水浴中保温恒温水浴中保温恒温水浴中保温恒温水浴中保温5 5minmin，用流水冷却用流水冷却用流水冷却用流水冷却1 1minmin后，测后，测后，测后，测A A650650A A650650值值值值2 2、样样样样品品品品测测测测定定定定：取取取取两两两两支支支支试试试试管管管管（平平平平行行行行）各各各各加加加加入入入入待待待待测测测测的的的的蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质样样样样品品品品液液液液1 1mlml（不不不不加加加加bufferbuffer），其其其其他他他他操操操操作作作作同同同同工工工工作
36、作作作曲曲曲曲线线线线（可可可可取取取取两两两两支支支支试试试试管管管管编编编编号号号号8 8、9 9，与与与与工工工工作作作作曲曲曲曲线线线线同同同同时时时时进行反应和比色测定）进行反应和比色测定）进行反应和比色测定）进行反应和比色测定）；试管号试管号试管号试管号89蛋白质稀释液（蛋白质稀释液（蛋白质稀释液（蛋白质稀释液（mlml）（mg)mg)11PH7.8PH7.8的的的的bufferbuffer（mlml）00FolinFolin- -甲试剂甲试剂甲试剂甲试剂 （mlml）11于室温下不停地振荡于室温下不停地振荡于室温下不停地振荡于室温下不停地振荡1010minminFolinFoli
37、n- -乙应用液（乙应用液（乙应用液（乙应用液（mlml）44立即摇匀，在立即摇匀，在立即摇匀，在立即摇匀，在5555恒温水浴中保温恒温水浴中保温恒温水浴中保温恒温水浴中保温5 5minmin，用流水冷却用流水冷却用流水冷却用流水冷却1 1minmin后，后，后，后，测测测测A A650650A A650650值值值值3.蛋白质浓度的计算：蛋白质浓度的计算：A A650650值对应的值对应的值对应的值对应的mgmg数数数数( (Pr)Pr)Pr(mg/ml)=稀释倍数Pr溶液的ml数思考题思考题思考题思考题1 1、采用、采用、采用、采用FolinFolin的酚法测定样品的蛋白质含量时，的酚法测定样品的蛋白质含量时，的酚法测定样品的蛋白质含量时，的酚法测定样品的蛋白质含量时，样品中的什么物质对测定结果有干扰？样品中的什么物质对测定结果有干扰？样品中的什么物质对测定结果有干扰？样品中的什么物质对测定结果有干扰？2 2、作为标准蛋白的酪蛋白在应用时有何要求。、作为标准蛋白的酪蛋白在应用时有何要求。、作为标准蛋白的酪蛋白在应用时有何要求。、作为标准蛋白的酪蛋白在应用时有何要求。
