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1、一目的要求：一目的要求： 学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的原理与方法。原理与方法。实验八实验八 凝胶过滤法分离蛋白质凝胶过滤法分离蛋白质1二原理二原理分子筛层析分子筛层析molecular-sieve chromatography凝胶过滤层析凝胶过滤层析gel-filtration chromatography分子排阻层析分子排阻层析molecular exclusion chromatographyn凝凝胶胶具具有有网网状状结结构构，小小分分子子物物质质能能进进入入其其内内部部，而而大大分分子子物物质质却却被被排排除除在在外外部部。当当混混合合溶溶液液过过
2、凝凝胶胶过过滤滤层层析析柱柱时时，溶溶液液中中的的物物质质按按不不同同分分子子量量筛筛分开。分开。2凝胶过滤介质凝胶过滤介质n不溶于水，在水中有较大膨胀度和较好的分子筛功能，不溶于水，在水中有较大膨胀度和较好的分子筛功能，多孔的网状结构。多孔的网状结构。n常用凝胶：常用凝胶： 葡聚糖凝胶（葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶）和琼脂糖凝胶（Sepharose），聚丙烯酰胺凝胶（），聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel P）。）。n凝胶因交联度不同凝胶因交联度不同,孔径不同，交联度越大，孔径越小。孔径不同，交联度越大，孔径越小。n蛋白质分子直径蛋白质分子直径 凝胶孔径时，被排阻在外，小于孔凝胶孔
3、径时，被排阻在外，小于孔径者则进入凝胶。径者则进入凝胶。3交联葡聚糖凝胶（交联葡聚糖凝胶（Sephadex）n葡聚糖和葡聚糖和3-氯氯-1，2环氧丙烷以醚键相互交联形成。环氧丙烷以醚键相互交联形成。n按交联度大小分按交联度大小分8种型号，种型号，G值代表不同交联度。值代表不同交联度。n Sephadex G-10，15，25，50，75，100，150，200n数字表示每克干胶膨胀时吸水量的数字表示每克干胶膨胀时吸水量的10倍。倍。 Sephadex G-25代表每克干胶膨胀时可以吸水代表每克干胶膨胀时可以吸水2.5克。克。456蠕动泵蠕动泵记录仪记录仪部分收集器部分收集器梯度制造仪梯度制造仪
4、层析柱层析柱检测仪检测仪洗脱液洗脱液7G值越小，交联度越大，网孔越小，吸水膨胀越小，只能值越小，交联度越大，网孔越小，吸水膨胀越小，只能分离相对分子量小的物质；分离相对分子量小的物质； G值越大，交联度越小，网孔越大，吸水膨胀越大，可以值越大，交联度越小，网孔越大，吸水膨胀越大，可以分离相对分子量大的物质；分离相对分子量大的物质；n分离范围分离范围Mr（肽和球蛋白）（肽和球蛋白）Sephadex G-25 1000-5000 Sephadex G 50 1500-30000Sephadex G 75 3000-70000 8凝胶过滤层析特点凝胶过滤层析特点n设备简单，操作方便设备简单，操作方便
5、n分离条件温和，样品回收率高分离条件温和，样品回收率高（100%）n实验重复性好实验重复性好9除盐除盐n选择孔径小，交联度大的凝胶。选择孔径小，交联度大的凝胶。nSephadex G-25 全排出的最小分子量为全排出的最小分子量为5000 nSephadex G 50 全排出的最小分子量为全排出的最小分子量为30000 （除盐的蛋白质分子量必须大于（除盐的蛋白质分子量必须大于30000，消除凝胶对蛋白质的，消除凝胶对蛋白质的滞留作用。）滞留作用。）n当分子量未知时，选择当分子量未知时，选择Sephadex G-25 10n洗脱时，大分子受阻小最先流出，小分子受阻大洗脱时，大分子受阻小最先流出，
6、小分子受阻大而最后流出，结果使大小不同的物质分离。用葡而最后流出，结果使大小不同的物质分离。用葡萄糖凝胶萄糖凝胶G-25或或G-50过柱的办法除盐，所用的过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。时间就比较短。n 用于分离及测定样品分子量：标准分子量样品，用于分离及测定样品分子量：标准分子量样品，logMW对洗脱体积作图对洗脱体积作图1112三、器材与试剂三、器材与试剂n120cm层析柱、自动部分收集器，蠕动泵层析柱、自动部分收集器，蠕动泵n葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶Sephadex-50n蒸馏水蒸馏水n 三角铁架三角铁架n 4mg/ml 蓝色葡聚糖溶液蓝色葡聚糖溶液(200万）万）n6mg/ml细胞色素
7、细胞色素C溶液溶液 （几万）（几万） 样品混合液样品混合液n2mg/ml重铬酸钾溶液（几百）重铬酸钾溶液（几百）13四、实验操作四、实验操作1、凝胶溶胀、凝胶溶胀n取取Sephadex G-50 15g，加，加500ml蒸馏水室温溶胀蒸馏水室温溶胀一天（或沸水浴中溶胀一天（或沸水浴中溶胀1h）。）。n待溶胀平衡后，倾去上层清液，包括细颗粒，然后再待溶胀平衡后，倾去上层清液，包括细颗粒，然后再放些蒸馏水搅乱，静置使凝胶下沉，再倾去上层清液，放些蒸馏水搅乱，静置使凝胶下沉，再倾去上层清液，至无细颗粒为止。至无细颗粒为止。 n不能剧烈搅拌，严禁用磁力搅拌器，否则易破碎，使不能剧烈搅拌，严禁用磁力搅拌
8、器，否则易破碎，使流速下降和分离效果降低。流速下降和分离效果降低。14实验操作实验操作2、装柱、装柱u取取120cm层析柱，底部出口套上乳胶塑料管，向层析柱内层析柱，底部出口套上乳胶塑料管，向层析柱内加蒸馏水加蒸馏水(赶走层析柱下过滤层死体积和接口处的气泡赶走层析柱下过滤层死体积和接口处的气泡)，在蒸，在蒸馏水高度约占层析柱高馏水高度约占层析柱高1/3时，关闭下端出口（用橡皮筋）。时，关闭下端出口（用橡皮筋）。u自顶部缓缓加入自顶部缓缓加入Sephadex-50悬液，待底部凝胶沉积悬液，待底部凝胶沉积1-2cm时，打开下端出口，凝胶加至离层析柱顶部约时，打开下端出口，凝胶加至离层析柱顶部约3c
9、m。u用蒸馏水过柱几遍，以稳定床体积用蒸馏水过柱几遍，以稳定床体积(不能让凝胶表面露出水面不能让凝胶表面露出水面)。u装柱时，凝胶柱内若有气泡或分离断层，可用玻棒搅动消除装柱时，凝胶柱内若有气泡或分离断层，可用玻棒搅动消除或重新装柱，装柱结束后凝胶表面应平整。或重新装柱，装柱结束后凝胶表面应平整。15n3、加样：、加样：n取取4mg/ml 蓝色葡聚糖溶液、蓝色葡聚糖溶液、6mg/ml细胞色素细胞色素C溶液、溶液、2mg/ml重铬酸钾溶液各重铬酸钾溶液各6滴混合滴混合-上柱样品。上柱样品。n打开下端出口，使表面的蒸馏水流出，直至恰好与表面相平打开下端出口，使表面的蒸馏水流出，直至恰好与表面相平（
10、不可使床面干掉），关闭下端出口，用滴管将上述样品缓（不可使床面干掉），关闭下端出口，用滴管将上述样品缓缓地加到床表面缓地加到床表面( 不要使平整的床表面搅动不要使平整的床表面搅动)。n打开下端出口，让样品进入床内，直至样品全部进凝胶柱，打开下端出口，让样品进入床内，直至样品全部进凝胶柱，关闭下端出口。关闭下端出口。n滴加蒸馏水使凝胶柱上端有滴加蒸馏水使凝胶柱上端有2cm水柱水柱 。实验操作实验操作164、洗脱和收集、洗脱和收集 n打开下端出口，让柱内液体缓慢流出，调节蠕动泵流打开下端出口，让柱内液体缓慢流出，调节蠕动泵流速，流速速，流速0.33ml/min (3分钟分钟1ml，不能让凝胶表不能
11、让凝胶表面露出水面面露出水面)。n设置部分收集器参数，每设置部分收集器参数，每3分钟收集分钟收集1管。管。n取小试管取小试管20支，每管收集支，每管收集1ml，观察三种颜色出现，观察三种颜色出现的管号，用的管号，用+，-或或5，4，3，2，1，0数字表示颜色数字表示颜色深浅。深浅。实验操作实验操作175、绘制洗脱曲线。、绘制洗脱曲线。n实验操作实验操作54321018凝胶再生和保存凝胶再生和保存nSephadex，Sepharose-多糖，微生物多糖，微生物-酶酶-水解糖苷键水解糖苷键n各种凝胶悬浮液加防腐剂或灭菌各种凝胶悬浮液加防腐剂或灭菌-冰箱（冰点冰箱（冰点以上）保存数月以上）保存数月n
12、防腐剂：防腐剂：0.02%叠氮化钠叠氮化钠n高压蒸汽灭菌：高压蒸汽灭菌：0.1MPa，30分钟分钟19长期保存长期保存n凝胶凝胶-低浓度酸或碱溶液短期浸泡低浓度酸或碱溶液短期浸泡-水反水反复洗涤去杂复洗涤去杂-过滤抽干过滤抽干-50%乙醇乙醇-70%-90%-95%乙醇逐步脱水，乙醇逐步脱水，60 80 C烘干烘干-装瓶保存装瓶保存n注意：溶胀凝胶不能直接高温烘烤注意：溶胀凝胶不能直接高温烘烤n 交联度越小，越难以脱水，可以将其较交联度越小，越难以脱水，可以将其较长时间浸泡在长时间浸泡在60-70%乙醇中脱水乙醇中脱水20五、注意事项五、注意事项n接头不漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造
13、成漏气、接头不漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液漏液n装柱要均匀，不要过松也不要过紧，流速不宜过快，避免压装柱要均匀，不要过松也不要过紧，流速不宜过快，避免压紧凝胶。但也不要过慢，使柱装得太松，导致层析过程中，紧凝胶。但也不要过慢，使柱装得太松，导致层析过程中，凝胶床高度下降。凝胶床高度下降。n始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。n绢布、塑料密封圈绢布、塑料密封圈21六、思考题六、思考题n根据实验中遇到的各种问题，总结做好本实验的经验根据实验中遇到的各种问题，总结做好本实验的经验与教训，完成实验报告。与教训，完成实验报告。n比较几种蛋白质分离方法的特点。比较几种蛋白质分离方法的特点。22
