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1、第四章第四章 微生物的生长与环境条件微生物的生长与环境条件微生物的生长与环境条件微生物的生长与环境条件微生物的生长与环境条件一、微生物生长测定二、微生物的生长规律三、微生物的培养四、微生物生长的环境条件五、消毒与灭菌微生物的生长与环境条件第一节、微生物生长测定第一节、微生物生长测定一、测定单细胞微生物数量（一）总菌数测定法1.计数板测定法2.比浊法(二)活菌数测定法1.平板菌落计数法2.液体稀释测定法3.膜过滤计数法微生物的生长与环境条件二、测定微生物生长量和生理指标1.干重法2.蛋白质含量测定法3.其他生理指标测定法微生物的生长与环境条件(一)微生物数量的测定1、显微镜直接计数法使用细菌计数
2、板或血球计数板在显微镜下直接计数。优点：操作简便，计数直观。一、微生物生长量的测定微生物的生长与环境条件(一)微生物数量的测定2、稀释平板计数法对样品稀释培养，据形成的菌落数计数。优点：传统计数方法。对设备要求不高。一、微生物生长量的测定10-310-510-410-6微生物的生长与环境条件(一)微生物数量的测定、比浊计数法根据细菌悬浮液的吸光度测定其数量。优点：简便，直接。一、微生物生长量的测定微生物的生长与环境条件(二)微生物重量的测定1、称重法用离心或过滤的方法将菌体从培养基中分离、冼净，称湿重或干重。优点：简单可靠。一、微生物生长量的测定第二节微生物纯培养群体生长规律在活性污泥法中采用
3、的指标：（1）混合液悬浮固体(MLSS)（粗放测定）污泥干燥-称重(W1)（2）挥发性悬浮固体(MLVSS)（相对准确）上述已称重污泥-马福炉(500度2小时)-冷却-称重(W2)微生物的生长与环境条件(二)微生物重量的测定2、蛋白质含量测定法根据样品中菌体蛋白质含量计算微生物重量的方法。一、微生物生长量的测定原理：（1）微生物蛋白质含量稳定（2）氮是蛋白质的稳定成分(蛋白质量=6.25总含N量)优点：测定准确。微生物的生长与环境条件微生物的生长规律一、无分支单细胞微生物的群体生长规律（一）生长曲线1.延滞期2.对数期3.稳定期4.衰亡期（二）生长曲线对发酵生产的指导意义（略）微生物的生长与环
4、境条件根据细菌生长繁殖速率将生长曲线分四个阶段：第二节微生物纯培养群体生长规律缓慢期对数期稳定期衰亡期二、细菌分批培养群体生长规律微生物的生长与环境条件第二节微生物纯培养群体生长规律缓慢期（延迟期、滞留适应期）滞留适应期二、细菌分批培养群体生长规律特点：分裂迟缓、代谢活跃。产生原因：（2）细胞分裂必需因子的缺乏（1）接种时的机械损伤引微生物的生长与环境条件第二节微生物纯培养群体生长规律缓慢期（延迟期、滞留适应期）4、菌株的遗传性滞留适应期二、细菌分批培养群体生长规律研究滞留适期长短的意义？影响滞留适应期长短的因素1、培养基成分2、接种物菌龄3、接种量微生物的生长与环境条件第二节微生物纯培养群体
5、生长规律对数期（指数生长期）特点：（1）代谢活性强（2）世代时短而稳定对数生长期二、细菌分批培养群体生长规律微生物的生长与环境条件第二节微生物纯培养群体生长规律对数期（指数生长期）对数生长期二、细菌分批培养群体生长规律见教材P93Nt=2nN0n=3.33(lgNt-lgN0)G=t/n=0.301t/(lgNt-lgN0)n繁殖代数G世代时(每繁殖一代所需的时间)N0对数生长期开始微生物数量Nt对数生长期经过时间t后微生物数量微生物的生长与环境条件第二节微生物纯培养群体生长规律稳定期（最高生长量期）最高生长量期特点：1、细菌数量增加率为0。2、部分细菌大量积累代谢产物。细菌数量增加率为0的原
6、因?二、细菌分批培养群体生长规律微生物的生长与环境条件第二节微生物纯培养群体生长规律衰亡期特点：菌体活性降低、大量死亡；细胞畸变、自溶革兰氏染色不稳定衰亡期二、细菌分批培养群体生长规律微生物的生长与环境条件第三节微生物纯培养一、微生物纯培养的概念实验室条件下，由一个微生物细胞或一种细胞群繁殖得到的后代。微生物的生长与环境条件第三节微生物纯培养二、微生物纯培养技术纯培养基本步骤：稀释平皿法划线法单细胞挑取法纯培养方法(2)培养(1)分离微生物的生长与环境条件第三节微生物纯培养二、微生物纯培养技术1、稀释平板分离法：倾注平板法和涂布平板法。基本过程：（1）梯度稀释过程；（2）分离培养过程涂布倾注梯
7、度稀释过程10-110-210-310-410-510-6微生物的生长与环境条件第三节微生物纯培养二、微生物纯培养技术4)操作要点：无菌操作稀释平板分离法使用过程中的几个问题1)梯度稀释度的确定：需分离微生物在样品中的数量2)选择菌落接种的依据：a、菌落特征；b、菌体的特征3)微生物纯培养的标准：菌落特征一致性微生物的生长与环境条件2、单细胞挑取法：从待分离材料中挑取一个细胞来培养，从而获得纯培养的过程。第三节微生物纯培养二、微生物纯培养技术微生物的生长与环境条件3、平皿划线法(P图-)用接种环沾少许待分离的材料，在培养基表面进行多次平行划线，使微生物细胞分开生长以获得微生物纯培养的过程。第三
8、节微生物纯培养二、微生物纯培养技术微生物的生长与环境条件第三节微生物纯培养三、目标微生物纯培养筛选的基本思路、待分离样品的确定、培养基的选择、纯化过程环境条件的控制（温度、空气、P、抑制剂）（）微生物的生长与环境条件（一）纯培养的保存试管斜面培养基低温、干燥、隔绝空气第三节微生物纯培养四、纯培养的保存与复壮1、灭菌彻底2、棉塞大小要合适3、无菌操作保存过程的注意点：防止杂菌污染。微生物的生长与环境条件（二）纯培养的衰退与复壮第三节微生物纯培养四、纯培养的保存与复壮衰退的原因：衰老、变异衰退的表现：生长缓慢优良性状的丧失抗逆性下降衰退的预防：控制继代频率创造良好的培养条件采取有效的保存方式复壮狭
9、义（被动）广义（主动）复壮方法：选优汰劣微生物的生长与环境条件第四节微生物的生活环境极端环境条件对微生物的影响死亡环境条件一定范围的变化，影响形态生理生长繁殖温度O2氧化还原电位水分辐射化学药物pH影响微生物生长的主要环境因子微生物的生长与环境条件第四节微生物的生活环境一、温度1、温度对微生物生长的影响微生物的生长温度类型低温型中温型高温型温度对微生物生长的影响高温：蛋白质变性酶失活核糖体解体致死时间、致死温度低温：酶活性下降、新陈代谢缓慢微生物的三种基本温度最低生长温度最高生长温度最适生长温度微生物的生长与环境条件第四节微生物的生活环境2、高温灭菌一、温度高温灭菌湿热灭菌干热灭菌：干燥条件，
10、160维持1-2h。高压蒸汽灭菌法：密闭条件下，水加热蒸发形成高压的同时产生高温。利用高温杀死菌。巴斯德消毒法：采用60-70的温度处理15-30min的消毒方法。间歇灭菌法：100，30-60min冷却，37培养1d反复三次微生物的生长与环境条件第四节微生物的生活环境3、低温保藏一、温度菌种保存（试管斜面或孢子砂土管）食品保藏特例：流感杆菌、脑膜炎球菌微生物的生长与环境条件第四节微生物的生活环境二、氧气p94专性好氧菌Eh0.1V，而以0.3-0.4v为宜兼性厌氧菌Eh0.1v行好气呼吸厌氧菌Eh值0.1V以下耐氧菌微好氧菌微生物的生长与环境条件专专性好氧菌（性好氧菌（strict aero
11、be）必须在有分子氧的条件下才能生长，有完整的呼吸链，以分子氧作为最终氢受体，细胞含有超氧物歧化酶（SOD，superoxide dismutase）和过氧化氢酶。在有氧或无氧条件下均能生长，但有氧情况下生长得更好，在有氧时靠呼吸产能，无氧时接发酵或无氧呼吸产能；细胞含有SOD和过氧化氢酶。微好氧菌（微好氧菌（microaerophilic bacteria）只能较低的氧分压下才能正常生长，通过呼吸链并以氧为最终氢受体而产能兼性好氧菌（兼性好氧菌（facultative aerobe）微生物的生长与环境条件耐氧菌（耐氧菌（aerotolerant anaerobe）可在分子氧存在下可在分子氧存
12、在下进行行厌氧生活的氧生活的厌氧菌。生活不需氧菌。生活不需要氧，分子氧也要氧，分子氧也对它无毒害。不具有呼吸它无毒害。不具有呼吸链，依靠，依靠专性性发酵酵获得能量。得能量。细胞内存在胞内存在SOD和和过氧化物氧化物酶，但缺乏，但缺乏过氧化氧化氢酶。厌厌氧菌（氧菌（anaerobe）分子氧分子氧对它有毒害，短期接触空气，也会抑制其生它有毒害，短期接触空气，也会抑制其生长甚甚至致死；在空气或含有至致死；在空气或含有10%CO2的空气中，在固体培养基表的空气中，在固体培养基表面上不能生面上不能生长，只有在其深，只有在其深层的无氧或低氧化的无氧或低氧化还原原电势的的环境下才能生境下才能生长；生命活；生
13、命活动所需能量通所需能量通过发酵、无氧呼吸、酵、无氧呼吸、循循环光合磷酸化或甲光合磷酸化或甲烷发酵提供；酵提供；细胞内缺乏胞内缺乏SOD和和细胞胞色素氧化色素氧化酶，大多数，大多数还缺乏缺乏过氧化氧化氢酶。微生物的生长与环境条件第四节微生物的生活环境三、水分1、水分对微生物生长的影响：细菌最适水的活度值：0.93-0.99酵母菌最适水的活度值：0.88-0.91霉菌最适水的活度值：0.802、应用：干燥法保存物品食品的冷冻干燥水的活度小于0.60-0.70时休眠、部分出现细胞脱水、蛋白质变性(多数微生物)微生物的生长与环境条件第四节微生物的生活环境三、辐射辐射：能量通过空间传递的一种物理现象。
14、1、可见光：（400nm800nm）对微生物的作用：光氧化作用：有氧条件下，光线被细胞内色素吸收，使酶或其它敏感成分失活引起的微生物死亡。（3）光氧化作用。（1）能源（2）刺激担子菌子实体形成微生物的生长与环境条件2、紫外线：杀菌波长范围：240300nm杀菌力最强范围：255265nm三、辐射紫外线杀菌特点：穿透力弱，用作表面消毒或空气灭菌第四节微生物的生活环境微生物的生长与环境条件3、电离辐射第四节微生物的生活环境三、辐射高能电磁波照射后发生的电离作用。电离辐射对微生物的作用：粮食、果蔬、畜禽产品、饮料以及卫生材料杀菌处理低剂量(500伦琴)：促进生长、诱发变异高剂量（10万伦琴）：杀菌作
15、用实际应用：（X射线、射线等）微生物的生长与环境条件第四节微生物的生活环境四、化学药物1、重金属盐类杀菌机理：杀菌机理：与带阴电荷的菌体蛋白质结合使其变性（Hg、Ag盐，与细菌酶蛋白的巯基结合）2、有机化合物（酚、醇、醛）蛋白质变性损伤细胞壁和膜抑制酶系统(脱氢酶、氧化酶等)；微生物的生长与环境条件第四节微生物的生活环境四、化学药物杀菌机理：使蛋白质巯基氧化(成二硫基)2RSH+2XRSSR+2XH杀菌机理：漂白粉Ca(OCl)2及氯气：产生次氯酸盐和原子氧；碘：与酶分子中的酪氨酸结合。3、氧化剂（高锰酸钾、过氧化氢、过氧乙酸）4、卤素（Cl、I常见）微生物的生长与环境条件具有降低表面张力效应
16、的物质。第四节微生物的生活环境四、化学药物直接干扰病原微生物的生长繁殖并用于治疗感染性疾病的化学药物。（选择性的杀菌或抑菌）5、表面活性剂（新洁尔灭、消毒宁等）杀菌机理：影响细胞生长、分裂6、化学治疗剂抑制叶酸合成如：磺胺类药物等。杀菌机理：抑制蛋白质合成如：链霉素，红霉素、四环素、氯霉素等抑制肽聚糖合成如：青霉素，万古霉素等。微生物的生长与环境条件第五节：消毒与灭菌微生物的生长与环境条件几个基本概念几个基本概念灭菌（菌（sterilization）采用采用强烈的礼花因素是任何物体内外部的一切微生物永烈的礼花因素是任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生失其生长繁殖能繁殖能力的措施，称力的措施，
17、称为灭菌。菌。消毒（消毒（disinfection）采用采用较温和的理化因素，温和的理化因素，仅杀死物体表面或内部的一部分死物体表面或内部的一部分对人体有害的病原人体有害的病原菌，而菌，而对被被处理物体基本无害的措施，称理物体基本无害的措施，称为消毒。消毒。防腐（防腐（antisepsis）利用理化因素完全抑制霉腐微生物的生利用理化因素完全抑制霉腐微生物的生长繁殖，从而达到防止物品繁殖，从而达到防止物品发生霉腐生霉腐的措施，称的措施，称为防腐。防腐。化化疗（chemotheraphy）即化学治即化学治疗。利用具有高度。利用具有高度选择毒力的化学物毒力的化学物质抑制宿主体内病院微生物的抑制宿主体
18、内病院微生物的生生长繁殖，以达到治繁殖，以达到治疗该传染病的一种措施。染病的一种措施。微生物的生长与环境条件1、高温、高温灭菌（消菌（消毒）法毒）法是最常是最常用的物理方法。高用的物理方法。高温可引起蛋白温可引起蛋白质、核酸等活性大分子核酸等活性大分子氧化或氧化或变性失活而性失活而导致微生物死亡。致微生物死亡。 一、常用的一、常用的灭菌、消毒、抑菌及除菌的物理方法菌、消毒、抑菌及除菌的物理方法（一）温度（一）温度微生物的生长与环境条件干干热灭菌法（菌法（dry heat sterilization）焚焚烧法（法（incineration）：）：是将被是将被灭菌物品在火焰中燃菌物品在火焰中燃烧，
19、使所有的生物，使所有的生物质碳化。碳化。简单、彻底，但底，但对被被灭菌物品的破坏极大。适用于无菌物品的破坏极大。适用于无经济价价值的的物品物品灭菌，及不怕菌，及不怕烧的的实验器具，如接种器具，如接种环、镊子、子、试管或三角瓶口的管或三角瓶口的灭菌等。菌等。干燥干燥热空气空气灭菌法菌法(hot-air oven)：将物品放入烘箱内，然后升温至将物品放入烘箱内，然后升温至150170 ，维持持12小小时。适用于玻璃、陶瓷和金属物品的。适用于玻璃、陶瓷和金属物品的灭菌，菌，不适合液体不适合液体样品，及棉花、品，及棉花、纸张、纤维和橡胶和橡胶类物物质的的灭菌。菌。特点：由于空气特点：由于空气传热穿透力
20、差，菌体在脱水状穿透力差，菌体在脱水状态下不易下不易杀死，所以温度高、死，所以温度高、时间长。微生物的生长与环境条件湿湿热法法(moist heat sterilization) ：特点：温度低、特点：温度低、时间短、短、灭菌效果高菌效果高原因：原因： 1) 菌体内含水量越高，菌体内含水量越高，则凝固温度越低；凝固温度越低； 2) 蒸汽冷凝会放出潜蒸汽冷凝会放出潜热； 3) 饱和水蒸汽穿透力和水蒸汽穿透力强； 4) 湿湿热易破坏易破坏细胞内蛋白胞内蛋白质大分子的大分子的稳定定 性，主要破坏性，主要破坏氢键结构。构。微生物的生长与环境条件高高压压蒸汽蒸汽灭灭菌法菌法利用水的沸点随水蒸气利用水的沸
21、点随水蒸气压压力的增加而上升，以达到力的增加而上升，以达到100 以上高温以上高温灭灭菌的方法。菌的方法。 方法：方法：121（1kg/cm2或或15磅磅/英寸英寸2）维维持持1515-20min。 112（0.5.5kg/cm2或或8 8磅磅/英寸英寸2）2020-3 30min。 115 5（0.750.75kg/cm2或或1111磅磅/英寸英寸2）2020-3 30min。应应根据根据灭灭菌物品的性菌物品的性质质或成分或成分选择灭选择灭菌温度菌温度例如：例如：生理生理盐盐水、水、营营养养琼琼脂等培养基用脂等培养基用121 。 含葡萄糖、乳糖、氨基酸等培养基用含葡萄糖、乳糖、氨基酸等培养基
22、用112 。适用：适用：耐高温物品，玻璃耐高温物品，玻璃仪仪器、含水或不含水的物品。器、含水或不含水的物品。 微生物的生长与环境条件高 压 蒸 汽 灭 菌 锅注意事注意事项：排排净冷空气；冷空气；灭菌菌终了，了，缓慢降慢降压；灭菌菌结束，趁束，趁热取出物品。取出物品。微生物的生长与环境条件消毒p100微生物的生长与环境条件煮沸消毒法煮沸消毒法将水加将水加热热至至100，煮沸，煮沸15min30min，可，可杀杀死所有死所有营营养养细细胞和部分芽胞和部分芽孢孢，达到消毒物的目的。，达到消毒物的目的。巴斯德消毒法（巴斯德消毒法（Pasteurization）：）：用用较较低的温度来低的温度来杀杀死
23、其中的病源微生物，死其中的病源微生物，这样这样既保持既保持食品的食品的营营养养风风味，又味，又进进行了消毒行了消毒该该法一般是将待消毒的液体食品置于法一般是将待消毒的液体食品置于62处处理理3030min，然后迅，然后迅速冷却。即可达到消毒目的。速冷却。即可达到消毒目的。低温低温长时长时法法(Low temperature long time,LTLT)；62.930min处处理牛奶理牛奶高温瞬高温瞬时时法（法（Hightemperatureshorttime,HTST):71.615s处处理牛奶理牛奶超高温巴斯德超高温巴斯德灭灭菌法菌法(Ultrapasteurization):让让液体食品
24、停留液体食品停留在在140左右左右3-4s，急，急剧剧冷却至冷却至75，经经匀匀质质化后冷却至化后冷却至20。微生物的生长与环境条件间间歇歇灭灭菌法：菌法： 将待将待灭菌物品在菌物品在80-100蒸煮蒸煮15-60min，冷却后冷却后搁搁置室温（置室温（28-37）下）下过过夜，并重复以夜，并重复以上上过过程三遍以上。程三遍以上。其蒸煮其蒸煮过过程可程可杀杀死微生物的死微生物的营营养体，但不能养体，但不能杀杀死芽胞，室温死芽胞，室温过过夜促使残留的芽夜促使残留的芽孢孢萌萌发发成成营营养养体，再体，再经经蒸煮蒸煮过过程可程可杀杀死新的死新的营营养体；循养体；循环环三三次以上可保次以上可保证彻证彻
25、底底灭灭菌的目的。菌的目的。适用于不耐高温的物品适用于不耐高温的物品灭灭菌，如不适于高菌，如不适于高压灭压灭菌的特殊培养基、菌的特殊培养基、药药品的品的灭灭菌。菌。 缺点是麻缺点是麻烦烦、费时费时。微生物的生长与环境条件二、常用的控菌方法二、常用的控菌方法消毒消毒剂: :可以抑制或可以抑制或杀灭微生物，但微生物，但对人体也可能人体也可能产生有害作用的化学生有害作用的化学试剂.主要用主要用于抑制或于抑制或杀灭物体表面、器械、排泄物和物体表面、器械、排泄物和环境中的微生物。境中的微生物。防腐防腐剂: :可以抑制或阻止微生物生可以抑制或阻止微生物生长，但，但对人体或人体或动物体的毒性物体的毒性较低的
26、化学低的化学药剂.用于肌体表面，如皮肤、粘膜、用于肌体表面，如皮肤、粘膜、伤口等口等处防止感染，也有的用于食品、防止感染，也有的用于食品、饮料料药品的品的防腐作用。防腐作用。但但现时消毒消毒剂和防腐和防腐剂间的界限已并不很的界限已并不很严格格. .消毒防腐消毒防腐剂的作用机理的作用机理一般有下列三种方式一般有下列三种方式: :使微生物蛋白使微生物蛋白质凝固凝固变性性, ,发生沉淀生沉淀. .如酒精等如酒精等. .破坏菌体的破坏菌体的酶系系统, ,影响菌体代影响菌体代谢. .如如过氧化氧化氢等等. .降低微生物表面降低微生物表面张力力, ,增加增加细胞膜的通透性胞膜的通透性, ,使使细胞胞发生破裂或溶解生破裂或溶解. .如来如来苏儿等酚儿等酚类物物质. .（一）一）消毒消毒剂和防腐和防腐剂微生物的生长与环境条件常用的消毒防腐常用的消毒防腐剂及其及其应用用微生物的生长与环境条件常用的消毒防腐常用的消毒防腐剂及其及其应用用微生物的生长与环境条件常用的消毒防腐常用的消毒防腐剂及其及其应用用微生物的生长与环境条件
