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1、 端粒与端粒酶端粒与端粒酶Telomere and Telomerase端端 粒粒端粒端粒 是位于真核细胞线性染色体末端的是位于真核细胞线性染色体末端的特殊结构特殊结构, ,由一段重复串联的由一段重复串联的DNADNA序列与端序列与端粒结合蛋白构成；粒结合蛋白构成；端粒端粒具有稳定染色体具有稳定染色体, ,防止末端降解和融合防止末端降解和融合的功能；的功能；端粒的平均长度随细胞分裂次数的增多及端粒的平均长度随细胞分裂次数的增多及年龄的增长而变短年龄的增长而变短, ,端粒端粒DNADNA逐渐变短而消逐渐变短而消失失, ,可导可导 致染色体稳定性下降并导致衰老致染色体稳定性下降并导致衰老。端粒与端
2、粒酶是当今生物学研究的热点。端粒与端粒酶是当今生物学研究的热点。端粒是位于真核细胞染色体末端的核酸蛋白端粒是位于真核细胞染色体末端的核酸蛋白复合体复合体,其功能在于维持染色体的稳定性和完整性。其功能在于维持染色体的稳定性和完整性。端粒酶是一种核酸核蛋白酶端粒酶是一种核酸核蛋白酶,能以自身的能以自身的RNA为模板合成端粒的重复序列为模板合成端粒的重复序列,以维持端粒长度的稳以维持端粒长度的稳定性。定性。许多研究表明许多研究表明,端粒、端粒酶的功能失调将影端粒、端粒酶的功能失调将影响细胞的生物学行为，包括细胞周期的稳定性、细响细胞的生物学行为，包括细胞周期的稳定性、细胞增殖、癌变、凋亡、衰老。胞增
3、殖、癌变、凋亡、衰老。端粒的发现端粒的发现1938 MullerX-rayDrosophila 末端极少发生缺失和倒位末端极少发生缺失和倒位推测染色体两端存在特殊结推测染色体两端存在特殊结构，使染色体趋于稳定构，使染色体趋于稳定.并定名为并定名为Telomere1938 B.McClintock顶端缺失染色体易于融合，而正常染色体不易连接。顶端缺失染色体易于融合，而正常染色体不易连接。推测染色体末端具有特殊端粒结构。推测染色体末端具有特殊端粒结构。七十年代七十年代端粒分子组成确定端粒分子组成确定八十年代八十年代端粒酶的发现端粒酶的发现九十年代九十年代端粒酶与细胞衰老、癌症的关系端粒酶与细胞衰老
4、、癌症的关系二零零九年二零零九年诺贝尔奖诺贝尔奖伊丽莎白伊丽莎白布兰克波恩、卡罗尔布兰克波恩、卡罗尔格雷德、格雷德、 杰克杰克绍斯塔绍斯塔端粒的结构与功能端粒的结构与功能ChromosomeChromosomeDNADNAGene 1Gene 1Gene 2Gene 2TelomeresTelomeresTelomeresTTTTA AGGGGGG1. 1.端粒的组成端粒的组成 端粒端粒DNADNA与端粒结合蛋白与端粒结合蛋白端粒端粒DNADNA 重复重复: : 端粒端粒DNADNA由高度重复短核苷酸序列组成。由高度重复短核苷酸序列组成。 人：人：-TTAGGG-TTAGGG-重复序列重复序列
5、 保守：保守： 为不含功能基因的简单、高度重复序列为不含功能基因的简单、高度重复序列, 在生物进化过程中具有高度保守性。在生物进化过程中具有高度保守性。 不同物种的端粒不同物种的端粒DNA 序列存在差异序列存在差异。 人类及其它脊椎动物染色体端粒的结构是5TTAGGG3的重复序列。体细胞的端粒有限长度（telomere restriction fragments TRFS）大多数明显短于生殖细胞，青年人的TRFs又显著长于年长者，提示TRFs随着细胞分裂或衰老，在不断变短，主要是由于DNA聚合酶不能完成复制成线性DNA末端所致。端端粒粒DNA由由两两条条互互相相配配对对的的DNA单单链链组组成
6、成,其其双双链链部部分分通通过过与与端端粒粒结结合合蛋蛋白白质质TRF1和和TRF2结结合合共共同同组组成成t环环(tloops)。这这种种t环环特特殊殊结结构构可可维维持持染染色色体体末末端端的的稳稳定定,保保持持染染色色体体及及其其内内部部基基因因的的完完整整性性,从从而而使使遗遗传传物物质质得得以以完完整整复复制制。缺缺少少端端粒粒的的染染色色体体不能稳定存在。不能稳定存在。端端粒粒DNA与与结结构构蛋蛋白白形形成成的的复复合合物物如如同同染染色色体体的的一一顶顶“帽帽子子”，它它既既可可保保护护染染色色体体不不被被降降解解，又又避避免免了了端端粒粒对对端端融融合合（end-endfus
7、ion）以以及及染染色色体体的的丧丧失失，同同时时端端粒粒能能帮帮助助细细胞胞识识别别完完整整染染色色体体和和受受损损染染色色体体。在在生生理理情情况况下下，端端粒粒作作为为细细胞胞“分分裂裂时时钟钟”能缩短，最终导致细胞脱离细胞周期。能缩短，最终导致细胞脱离细胞周期。端粒端粒DNA的长度的长度： 端粒端粒DNADNA的平均长度因物种而异。的平均长度因物种而异。 端粒端粒DNADNA的长度总是波动变化，随遗传或营养状态而改变。的长度总是波动变化，随遗传或营养状态而改变。人体中，随细胞分裂，会缓慢缩短。人体中，随细胞分裂，会缓慢缩短。Telomere length端粒端粒DNA重复重复序列序列T
8、四膜虫，四膜虫，酵母，酵母，植物，植物，蚕，蚕，人人 端粒结合蛋白端粒结合蛋白 与端粒与端粒DNADNA上的特异序列相结合的蛋白上的特异序列相结合的蛋白质称为端粒结合蛋白。质称为端粒结合蛋白。 人端粒重复序列结合因子人端粒重复序列结合因子( (TelomericTelomeric repeat factorrepeat factor，TRF)TRF)，包括，包括TRF1TRF1和和TRF2TRF2。 TRF1TRF1通过负反馈机制抑制端粒增长，通过负反馈机制抑制端粒增长，稳定端粒长度，其并不抑制端粒酶稳定端粒长度，其并不抑制端粒酶(telomerase)(telomerase)的表达而是抑制它
9、在端粒末的表达而是抑制它在端粒末端的行为端的行为 TRF1TRF1，是是一一个个60 60 kDkD的的蛋蛋白白，结结合合同同源源二二聚聚体体双双链链TTAGGGTTAGGG重重复复序序列列，包包含含一一个个C C端端螺螺旋旋- -转转折折- -螺螺旋旋区区和和一一个个DNADNA结合折叠同源区，结合折叠同源区，N N端是酸性区。端是酸性区。 TRF2TRF2，与与TRF1TRF1相似，但相似，但N N端碱性强。可端碱性强。可以防止染色体末端相互融合。以防止染色体末端相互融合。 两种蛋白在体外都专一与双链两种蛋白在体外都专一与双链TTAGGGTTAGGG重复序列结合，在体内则位于端粒。重复序列
10、结合，在体内则位于端粒。 人该环人该环DNA DNA 与与TRF1TRF1、TRF2TRF2结合，结合，TRF2TRF2参与参与T T环形成。环形成。“T T环环”保护保护3 3端对端对抗双链破坏的核酸酶作用。）抗双链破坏的核酸酶作用。）Telomere T-loop2. 2.端粒的功能端粒的功能端粒酶的结构与功能端粒酶的结构与功能端粒酶端粒酶是一种是一种RNA-RNA-蛋白质复合物，蛋白质复合物， 在在端端粒粒被被发发现现以以前前，人人们们就就推推测测生生殖殖细细胞胞之之所所以以能能世世代代相相传传，其其中中可可能能存存在在一一种种维维持持端端粒粒长长度度的的特特殊殊机机制制，体体细细胞胞可
11、可能能正正是是由由于于缺缺乏乏这这种种机机制制，它它的的染染色色体体末末端端才才面面临临着着致致死死性性缺缺失失（deletion）的的危危险险 。 因因 此此 在在 正正 常常 人人 体体 细细 胞胞 间间 永永 生生 化化 细细 胞胞（immortalizedcells）及及肿肿瘤瘤细细胞胞的的转转化化过过程程中中可可能能也也存存在在着着与与生生殖殖细细胞胞类类似似的的机机制制。这这些些细细胞胞怎怎样样保保持持细细胞胞具具有有继继续续分分裂裂或或长长期期分分裂裂的的能能力力呢呢？科科学学家家们们发发现现端端粒粒确确实实随随着着每每次次分分裂裂而而缩缩短短，但但也也会会被被新新合合成成的的端
12、端粒粒片片断断再再延延长长。科科学学家家们们怀怀疑疑，可可能能尚尚有有末末被被发发现现的的酶酶，该该酶酶具具有有标标准准的的DNA多多聚聚酶酶所所不不具具备备的的功功能能，能能使使已已缩缩短短的的端端粒粒延延长长，使使科科学学家家们们兴兴奋奋的的是是到到1984年年首首先先在在四四膜膜虫虫中中证证实实了了这这种种能能使使端粒延长的酶端粒延长的酶端粒酶的存在。端粒酶的存在。端粒酶的结构端粒酶的结构 端粒酶在结构上为一核糖核蛋白复合体端粒酶在结构上为一核糖核蛋白复合体, ,由由RNA RNA 和结合的蛋白质组成和结合的蛋白质组成, ,是是RNARNA依赖的依赖的DNA DNA 聚合酶。它是聚合酶。
13、它是一种特殊的能合成端粒一种特殊的能合成端粒DNADNA的酶的酶, ,通过明显的模板依赖通过明显的模板依赖方式每次添加一个核苷酸。方式每次添加一个核苷酸。 端粒酶实质上是一种特殊的逆转录酶端粒酶实质上是一种特殊的逆转录酶 端粒酶端粒酶RNA(hTRRNA(hTR) ) 端粒酶逆转录酶（端粒酶逆转录酶（TERTTERT） 端粒酶结合蛋白端粒酶结合蛋白（TEP） 1 1、端粒、端粒酶酶RNA(hTERTRNA(hTERT) ) 哺乳动物端粒酶哺乳动物端粒酶RNAs(hTRRNAs(hTR) )在许多组织的不同发育阶段在许多组织的不同发育阶段, ,甚至那些没有端粒酶活性的组织中广泛表达。甚至那些没有
14、端粒酶活性的组织中广泛表达。 体内端粒酶体内端粒酶RNARNA的存在对端粒酶功能至关重要，影响到的存在对端粒酶功能至关重要，影响到端粒酶端粒酶RNARNA的稳定性与突变的稳定性与突变, ,也可改变体内端粒长度，并可通也可改变体内端粒长度，并可通过改变端粒完整性或端粒结合因子的末端结合位点致细胞核过改变端粒完整性或端粒结合因子的末端结合位点致细胞核分裂后期细胞死亡分裂后期细胞死亡 。端粒酶端粒酶RNARNA转录模板转录模板 远端区远端区: :参与和底物的结合。参与和底物的结合。 近端区近端区: :能添加特定的核苷酸能添加特定的核苷酸, ,对底物识别并不重要。对底物识别并不重要。 模板边界区模板边
15、界区: :与端粒酶催化亚基与端粒酶催化亚基TERTTERT结合结合, ,也与端粒酶相关也与端粒酶相关因子因子Est1pEst1p和和Ku Ku 结合。结合。Telomerase RNAThe template regionMain TERT-bindingregionTemplate boundaryelement(TBE)TRE, Templaterecognition elementLow affinity TERTbinding sitesAnnu.Rev.Biochem2006, 75:493-5172 2、端粒酶逆转录酶、端粒酶逆转录酶(Telomerase reverse (Tel
16、omerase reverse transcriptase,TERTtranscriptase,TERT) ) 几乎所有存在端粒几乎所有存在端粒酶酶的机体均含有一的机体均含有一单单独的独的TERT TERT 基因基因, , 哺乳哺乳动动物物TERT TERT 的的转录转录由由许许多多转录转录因因子、激素和子、激素和细细胞外信号胞外信号严严格控制格控制。不同的不同的转录转录因因子子调节调节hTERThTERT在不同的在不同的细细胞内含物中的表达。癌基胞内含物中的表达。癌基因因c-mycc-myc是一个受特殊信号是一个受特殊信号调节调节的可的可诱导诱导癌基因癌基因, , 并可与并可与H HRasR
17、as、N NRasRas、多瘤病毒多瘤病毒MTMT、LT LT 等癌基等癌基因因协协同作用同作用, , 促促进细进细胞无限增殖胞无限增殖, , 获获得永生化并得永生化并发发生癌生癌变变。人端粒酶逆转录酶人端粒酶逆转录酶 （human Telomerase Reverse Transcriptase (TERT),） TERT gene : 3396bp, protein: 1131 氨基酸残基Crystal Structure of the Essential N-terminalof the telomerase reverse transcriptase (TEN) C-terminal
18、domain of TERTNature structureal & molecular biology 2006, 13: 218-225 c-mycc-myc 与与hTERThTERT Fujimoto Fujimoto等用等用c-mycc-myc 反反义义寡核甘酸寡核甘酸转转染白血病染白血病细细胞胞后后, , 这这些些细细胞胞中中端粒端粒酶酶活性均能被下活性均能被下调调, , 而而c-c-mycmyc 正正义义寡核甘酸无此作用。寡核甘酸无此作用。 WangWang等研究等研究发现发现c-mycc-myc在正常人乳腺上皮在正常人乳腺上皮细细胞和胞和二二倍体成倍体成纤维细纤维细胞中胞中诱导诱
19、导端粒端粒酶酶活性活性, , 并能延并能延长长这些这些细胞细胞的寿命。因此的寿命。因此认为认为癌基因癌基因c-mycc-myc为为一重要的端粒一重要的端粒酶酶激活激活剂剂。 存在于存在于hTERThTERT核心启核心启动动子中有两个重要的子中有两个重要的c-mycc-myc 结结合位点合位点(CACGTG,(CACGTG,亦被称亦被称为为E E 盒盒) )。c-mycc-myc 诱导诱导的的hTERThTERT 表达起始速度快表达起始速度快, ,不受不受细细胞增殖或胞增殖或额额外的蛋白外的蛋白合成的影响合成的影响, ,与与c-mycc-myc 引起的直接的引起的直接的转录转录激活一致。激活一致
20、。但癌基因但癌基因c-mycc-myc 不是唯一与不是唯一与hTERThTERT基因基因调节调节有关的有关的转转录录因子。因子。 近期研究表明近期研究表明,Sp1 ,Sp1 协协同同c-mycc-myc 激活激活hTERThTERT的的转录转录, ,可可能能还还有其他因子有其他因子, ,如如Bcl-2 Bcl-2 抗凋亡基因、抗凋亡基因、E6HPV16 E6HPV16 型蛋型蛋白白，以及以及经过经过一些一些蛋白激蛋白激酶酶的磷酸化使的磷酸化使hTERThTERT 上上调调。但。但在在诸诸多不同多不同类类型的瘤型的瘤细细胞中胞中, ,致致hTERThTERT上上调调的基本激活的基本激活剂剂是是c
21、-mycc-myc。 TERTTERT内的内的N-N-残基残基对对多种功能是重要的多种功能是重要的, , 包括与端粒包括与端粒酶酶RNARNA结结合、端粒合、端粒酶酶RNA RNA 装配和催化作用、与装配和催化作用、与p53 p53 的相的相互作用和互作用和细细胞永生化。胞永生化。 TERTTERT的的C-C-残基也在人残基也在人类类原始原始纤维纤维母母细细胞的永生化、胞的永生化、端粒端粒组组装的装的竞竞争、核仁内定位、引物争、核仁内定位、引物结结合和合和渐进渐进性延性延长长等方面起重要作用。等方面起重要作用。 3、端粒酶相关蛋白、端粒酶相关蛋白(TEP) 端粒酶相关蛋白端粒酶相关蛋白-1(T
22、EP1)-1(TEP1)是一多功能的是一多功能的RNA RNA 结合蛋白，结合蛋白，TEP1 TEP1 缺失导致缺失导致rRNArRNA 水平的显著降低以及水平的显著降低以及TEP1 TEP1 和和rRNArRNA 的丢失的丢失, ,但不导致端粒酶活性或端粒长度的紊乱。但不导致端粒酶活性或端粒长度的紊乱。 生存生存动动力神力神经细经细胞基因胞基因(SMN) (SMN) 产产物物热热休克蛋白（休克蛋白（hsphsp）90 90 、其他涉及到其他涉及到TERTTERT转录转录后修后修饰饰的的蛋白包括磷酸蛋白包括磷酸酶酶-A-A、AktAkt 、cAblcAbl 、p53 p53 和和PARPPAR
23、P。PinX1 PinX1 与人与人TERTTERT体外共表达体外共表达时时抑制人端粒抑制人端粒酶酶活性。活性。 芽殖酵母蛋白芽殖酵母蛋白Est1p Est1p 和和Est3p Est3p 这两个蛋白与体内端这两个蛋白与体内端粒酶的功能有关。粒酶的功能有关。Est1p Est1p 足以使端粒延长。但是足以使端粒延长。但是, ,在无在无Est1pEst1p存在的情况下存在的情况下Est2p-Cdc13pDBD融合也足以维持融合也足以维持端粒长度。端粒长度。人端粒酶人端粒酶RNA( human Telomerase RNA (hTR or TERC). hTR : 451 nt, Telomera
24、se is composed of both RNA and proteinTelomeraseTelomerase is aspecializedreversetranscriptase,contains bothRNA andProteinScience 1997, 276: 561-567端粒酶端粒酶RNA(hTRRNA(hTR) )端粒酶逆转录酶端粒酶逆转录酶（TERTTERT）端粒酶结合蛋白端粒酶结合蛋白（TEP）端粒酶端粒酶RNARNA是第一个被克隆的端粒酶是第一个被克隆的端粒酶组分。组分。端粒酶端粒酶RNARNA含有与同源端粒含有与同源端粒DNADNA序列序列TTAGGGTTAG
25、GG的互补序列的互补序列, ,核糖核酸酶核糖核酸酶H H切割此模板区切割此模板区, ,能使体外消除端粒酶能使体外消除端粒酶延长端粒的功能。延长端粒的功能。人人类类TERTTERT（hTERThTERT）基因基因为为一一单单拷拷贝贝基因基因, ,定位于定位于5p15. 33 ,5p15. 33 ,具有具有7 7个保守序列个保守序列结结构域构域单单元和端粒元和端粒酶酶特异性特异性结结构域构域单单元元T T。破坏破坏TERT TERT 将消除端粒将消除端粒酶酶活性并致端粒活性并致端粒缩缩短。短。TEP1TEP1、生存生存动动力神力神经细经细胞基因胞基因(SMN) (SMN) 产产物物、 hsp90h
26、sp90 、 PinX1PinX1、 Est1p Est1p 和和Est3pEst3p THE END REPLICATION PROBLEM TELOMERASEIf cells dont have telomerase, what happens with telomeres after many cells divisions?端粒酶延长端粒端粒酶延长端粒DNAInchworn modelTelomere T-loopTelomeresarepackagedintoauniquestructure-aT-loopGreen=Telomere-specificproteinsT-loops
27、eenintheelectronmicroscopeTelomeresStructural elements of a eukaryotic chromosome(5)(TxGy)n (3)(AxCy)nThe TxGy strand in telomeres folds back upon itself, forming G quadruplexes.Metal ion (K+) binding is required to form a stable structure.TelomeresStructural elements of a eukaryotic chromosome(5)(T
28、xGy)n (3)(A xCy)nJ. Mol Biol. (2002), 320, 911-924TelomeresJ. Mol Biol. (2002), 320, 911-924 端端粒粒酶酶活活性性的的测测定定 端端粒粒酶酶的的特特殊殊性性使使端端粒粒酶酶活活性性的的测测定定在在研研究究中中显显得得尤尤为为重重要要。基基本本测测定定方方法法是是通通过过测测定定细细胞胞提提取取物物将将端端粒粒重重复复片片段段加加到到一一个个合合成成的的寡聚脱氧核苷酸引物寡聚脱氧核苷酸引物33端的能力进行的。端的能力进行的。（1 1）TRAPTRAP法法模模拟拟端端粒粒结结构构设设计计单单链链DNADNA
29、引引物物TSTS，端端粒粒酶酶催催化化加加上上6 6核核苷苷酸酸重重复复序序列列，然然后后用用重重复复序序列列互互补补引引物物CXCX对对合合成成产产物物PCRPCR扩扩增增，电电泳泳差差6ntDNA6ntDNA条条带带。早早期期方方法法，只只能能定定性。性。（2 2）TRAP-TRAP-同位素图谱同位素图谱 上上述述反反应应体体系系加加入入32P32P标标记记ATPATP，32P-TS32P-TS引引物物，PCRPCR扩增后电泳，放射自显影，扫描定量扩增后电泳，放射自显影，扫描定量。（3 3）TRAP-TRAP-非同位素图谱非同位素图谱组组织织裂裂解解液液稀稀释释，TRAPTRAP法法分分析
30、析，溴溴乙乙锭锭染染色色根根据据6bp6bp梯梯形形条条带带在在高低浓度出现，半定量分析。高低浓度出现，半定量分析。（4 4）PCR-ELISAPCR-ELISA法法按按TRAPTRAP法法延延伸伸引引物物，PCRPCR扩扩增增，与与地地高高辛辛标标记记重重复复序序列列探探针针杂杂交交，杂杂交交产产物物通通过过生生物物素素标标记记引引物物固固定定于于抗抗生生物物素素包包被被微微孔孔板板上上，过过氧氧化化酶酶结结合合地地高高辛辛抗抗体体检检测测PCRPCR产产物物。产产生生有有色色产产物物，定量。定量。（5 5）PCR-PCR-荧光法荧光法用用荧荧光光标标记记引引物物TSTS和和CXCX，进进行
31、行TRAPTRAP延延伸伸、PCRPCR、电电泳泳。荧荧光光分分析析定定量量。进进行行TRAPTRAP延延伸伸、PCRPCR，扩扩增增产产物物结结合合能能选选择择结结合合双双链链DNADNA的的超超敏敏荧荧光光染染料料，测测定定电电泳泳荧荧光光强强度度，分分析析产产生生DNADNA量量与与端端粒酶活性正比。半定量。粒酶活性正比。半定量。 端粒及端粒酶端粒及端粒酶 与衰老的关系与衰老的关系 端端粒粒缩缩短短是是触触发发衰衰老老的的分分子子钟钟。 大大多多数数正正常常体体细细胞胞中中不不能能检检测测到到端端粒粒酶酶的的活活性性。端端粒粒随随细细胞胞分分裂裂每每次次丢丢失失50-20050-200个
32、个碱碱基基。CookeCooke等等认认为为，正正常常体体细细胞胞中中端端粒粒酶酶未未被被活活化化，导导致致端端粒粒DNADNA缩缩短短。可可能能最最终终制制约约细细胞胞增增殖殖能能力力。几几千千个个碱碱基基的的端端粒粒DNADNA丢丢失失后后，细细胞胞就就停停止止分分裂裂而而衰衰老老。最最有有力力的的证证据据是是BodnarBodnar等等的的工工作作。将将人人端端粒粒酶酶基基因因导导入入正正常常细细胞胞，使使端端粒粒酶酶异异常常表表达达。端端粒粒序序列异常延长，细胞旺盛增殖，寿命大大延长。列异常延长，细胞旺盛增殖，寿命大大延长。 Telomere Length (humans)Number
33、 of Doublings2010Cellular (replicative) SenescenceNormal Somatic Cells(Telomerase Negative)Telomere also provide a means for counting cell division: telomeres shorten with each cycleTelomeres shorten from 10-15 kb(germ line) to 3-5 kb after 50-60 doublings(average lengths of TRFs)Cellular senescence
34、 is triggered whencells acquire one or a few critically short telomeres. 端粒缩短可引发细胞老化的机制端粒缩短可引发细胞老化的机制可能有可能有3种情况种情况 端粒端粒DNA的缩短释放了端粒结合转录因子，的缩短释放了端粒结合转录因子，该因子进而激活衰老诱导基因或灭活细胞该因子进而激活衰老诱导基因或灭活细胞周期进行所必需的某些基因；周期进行所必需的某些基因； 诱导诱导DNA损伤的反应，导致细胞周期受损伤的反应，导致细胞周期受阻；阻； 端粒的缩短引起免疫功能下降，端粒的缩短引起免疫功能下降，Pommier” 早在早在1997年就
35、观察到，受年就观察到，受HIV感感染的高度免疫缺陷病人外周血单核细胞的染的高度免疫缺陷病人外周血单核细胞的端粒长度急剧缩短。端粒长度急剧缩短。大量的实验数据证明，端粒、端粒酶与衰老之间存大量的实验数据证明，端粒、端粒酶与衰老之间存在相关性。在相关性。在多数体细胞中，老年个体的端粒长度较年轻个体在多数体细胞中，老年个体的端粒长度较年轻个体短的多，某些细胞如短的多，某些细胞如T、B淋巴细胞中的端粒酶活性淋巴细胞中的端粒酶活性随年龄的增加而下降随年龄的增加而下降 。年轻个体细胞中端粒酶活性随年龄的增长而下降年轻个体细胞中端粒酶活性随年龄的增长而下降 。 需要无限分裂能力的谱系细胞、干细胞的端粒长度需
36、要无限分裂能力的谱系细胞、干细胞的端粒长度较长，且具有较高的端粒酶活性；而大多数具有有较长，且具有较高的端粒酶活性；而大多数具有有限增生能力的体细胞的端粒较短，不表达活性仅低限增生能力的体细胞的端粒较短，不表达活性仅低度表达端粒酶活性度表达端粒酶活性 。增生能力强的细胞及永生细胞表达端粒酶活性，即增生能力强的细胞及永生细胞表达端粒酶活性，即使同一组织的不同部分，其分裂能力也与端粒酶的使同一组织的不同部分，其分裂能力也与端粒酶的活性呈正比。活性呈正比。 端粒酶阴性的细胞在引入端粒酶后，可维持端粒的端粒酶阴性的细胞在引入端粒酶后，可维持端粒的长度，细胞增生能力加强，甚至细胞永生化长度，细胞增生能力
37、加强，甚至细胞永生化 Telomere Length Declines035651,5003,0008,000Age (years)Telomere length Telomere length in base pairsin base pairs(human white (human white blood cells)blood cells)Telomerase activity is repressed in somatic cells of Telomerase activity is repressed in somatic cells of multicelluarmulticel
38、luar organisms resulting in a gradual organisms resulting in a gradual shortening of the chromosome with each cell shortening of the chromosome with each cell generation. As this shortening reaches informational generation. As this shortening reaches informational DNA, the cells senesce and die. DNA
39、, the cells senesce and die. 细胞分裂细胞分裂端粒阈值端粒阈值长短细胞分裂次数与端粒长短呈正比细胞分裂次数与端粒长短呈正比细胞分裂细胞分裂端粒阈值端粒阈值端粒长短端粒长短端粒酶活端粒酶活Harley(1989)端粒的重复片段为探针检测端粒的重复片段为探针检测胎儿细胞株胎儿细胞株婴儿细胞株婴儿细胞株青年细胞株青年细胞株老年细胞株老年细胞株年龄年龄小大端粒长度端粒长度早老性侏儒症的端粒明显较正常人短早老性侏儒症的端粒明显较正常人短“多莉多莉”的衰老的衰老研究端粒（记时器）丢失的速率研究端粒（记时器）丢失的速率/年，预测人类的寿命年，预测人类的寿命 XX XY why?X
40、X XY why?PCDPCD机制、癌细胞的无限繁殖机制、癌细胞的无限繁殖Inmostsomatictissues,telomeraseisexpressedatverylowlevelsornotatall-ascellsdivide,telomeresshortenTelomeraseandSenescenceShorttelomeresmaybeasignalforcellstosenesce(stopdividing) 在早老患者中有一个过早的端粒缩短，进而在早老患者中有一个过早的端粒缩短，进而缩短的端粒允许染色体融合，这些现象与年老患缩短的端粒允许染色体融合，这些现象与年老患者的细胞
41、中或培养的老化细胞中染色体组型衰老者的细胞中或培养的老化细胞中染色体组型衰老异常的高发生率密切相关。既然端粒酶活性表达异常的高发生率密切相关。既然端粒酶活性表达能稳定端粒的长度，使端粒在细胞复制过程中不能稳定端粒的长度，使端粒在细胞复制过程中不会丢失，细胞衰老的进程也能被阻止，从而寿命会丢失，细胞衰老的进程也能被阻止，从而寿命延长延长这正是人们研究的端粒酶与抗衰老关系这正是人们研究的端粒酶与抗衰老关系的新热点。的新热点。 端端粒粒酶酶延延长长端端粒粒长长度度以以减减慢慢细细胞胞衰衰老老最最早早的的证证据据来来自自BodnarBodnar等等的的研研究究，19981998年年其其在在Scienc
42、eScience上上刊刊文文报报道道：将将人人的的端端粒粒酶酶基基因因导导入入端端粒粒酶酶阴阴性性的的正正常常人人体体细细胞胞中中激激活活其其表表达达并并培培养养细细胞胞，然然后后与与未未导导入入该该基基因因的的细细胞胞比比较较，发发现现前前者者端端粒粒明明显显增增长长，细细胞胞分分裂裂旺旺盛盛，细细胞胞寿寿命命比比后后者者大大大大延延长长，更更令令人人关关注注的的是是细细胞胞并并无无肿肿瘤瘤样样改改变变。KudoKudo等等报报道道端端粒粒酶酶活活性性和和细细胞胞凋凋亡亡可可作作为为伴伴有或不伴有子宫内发育延迟的胎盘衰老的标志有或不伴有子宫内发育延迟的胎盘衰老的标志。 MattsonMatt
43、son等亦认为在研究神经细胞分化和存活中等亦认为在研究神经细胞分化和存活中激活端粒酶与激活端粒酶与TERTTERT功能，能较好地避免神经细胞死功能，能较好地避免神经细胞死亡，还可以促进神经细胞在各种神经元退化性病变亡，还可以促进神经细胞在各种神经元退化性病变条件下的恢复。条件下的恢复。 阿尔茨海默病（阿尔茨海默病（Alzheimers diseaseAlzheimers disease，ADAD）是是一种常见于老年人的神经系统退化性疾病，其患者一种常见于老年人的神经系统退化性疾病，其患者的脑血管壁中可分离出致的脑血管壁中可分离出致ADAD神经元退行性病变的神经元退行性病变的- -淀淀粉样蛋白。
44、粉样蛋白。 ZhuZhu等利用反义技术和端粒酶抑制剂引发胎鼠海等利用反义技术和端粒酶抑制剂引发胎鼠海马区神经细胞中马区神经细胞中TERTTERT的功能抑制，发现显著增加了的功能抑制，发现显著增加了由由- -淀粉样蛋白肽引起的细胞凋亡；淀粉样蛋白肽引起的细胞凋亡； 嗜铬细胞瘤细胞中嗜铬细胞瘤细胞中TERTTERT的过量表达会降低此种的过量表达会降低此种细胞凋亡。细胞凋亡。其原因是其原因是TERTTERT功能降低的神经细胞在暴露于功能降低的神经细胞在暴露于- -淀淀粉蛋白中能增强其氧化性并使线粒体功能发生障粉蛋白中能增强其氧化性并使线粒体功能发生障碍，因而引起细胞凋亡。碍，因而引起细胞凋亡。TER
45、TTERT在神经退行性病变在神经退行性病变实验模型中展现出有神经保护性功能，提示在神实验模型中展现出有神经保护性功能，提示在神经细胞中若能提高端粒酶的活性可能会抑制与衰经细胞中若能提高端粒酶的活性可能会抑制与衰老相关的神经退行性病变，如老相关的神经退行性病变，如ADAD和脑老化的发生和脑老化的发生等。等。 端粒缩短加快可在许多病变中观察到端粒缩短加快可在许多病变中观察到: :如如Down Down 综合征、综合征、Werner Werner 综合征、毛细管扩张失调综合征、毛细管扩张失调症症 、先天性角化不良等、先天性角化不良等, ,虽然有些遗传异常和端虽然有些遗传异常和端粒缺陷的关系还不清楚粒
46、缺陷的关系还不清楚, ,但可能的原因有但可能的原因有: : 端粒核酸外切酶活性和端粒核酸外切酶活性和( (或或) )有效利用的增加。有效利用的增加。端粒过度丢失。端粒过度丢失。在发育或出生后端粒补偿机制的不足在发育或出生后端粒补偿机制的不足( (端粒酶端粒酶或正性或正性ALTALT样功能样功能) )。 端粒缩短加速可由于环境的应急介导的端粒缩短加速可由于环境的应急介导的DNA DNA 损损害或对这些损害敏感度增加所致。不管何种原因害或对这些损害敏感度增加所致。不管何种原因, ,端粒缩短速率增加可致增殖组织的早衰特征端粒缩短速率增加可致增殖组织的早衰特征, ,但但也促进由于致瘤突变而获得增殖活性
47、提高的克隆也促进由于致瘤突变而获得增殖活性提高的克隆过分生长。过分生长。 细胞的死亡过程分为两个阶段细胞的死亡过程分为两个阶段, , 当端粒缩短至一关键性当端粒缩短至一关键性长度长度2-4kb2-4kb时时, ,染色体的稳定性就会遭到破坏染色体的稳定性就会遭到破坏, ,细胞开始衰老细胞开始衰老进入进入M M1期（期（mortalitystage1M M1）。在）。在M1期细胞对生长因子等期细胞对生长因子等失去反应，产生失去反应，产生DNA合成蛋白抑制因子，细胞周期检查点合成蛋白抑制因子，细胞周期检查点（cellcyclecheckpoints）发送周期停止信号，发送周期停止信号，DNA合成停止
48、，合成停止，DNA DNA 断裂断裂, ,活化活化p53 p53 依赖或非依赖或非p53 p53 依赖的依赖的DNA DNA 损伤途径。并损伤途径。并诱导诱导CDKCDK抑制物如抑制物如p21 ,p27p21 ,p27产生产生, ,导致细胞导致细胞G1G1期生长停滞期生长停滞, ,最最终走向死亡。如果这一过程中一些癌基因终走向死亡。如果这一过程中一些癌基因SV40T抗原、抗原、PRB PRB , ,或或p53 ,p16 p53 ,p16 等抑癌基因失活等抑癌基因失活, ,丧失正常功能丧失正常功能, ,均能使均能使M1期期的机制被抑制使细胞逃逸的机制被抑制使细胞逃逸M1期，继续生长获得额外的增殖
49、能期，继续生长获得额外的增殖能力，此时端粒酶仍为阴性，端粒继续缩短，经过力，此时端粒酶仍为阴性，端粒继续缩短，经过20-30次分裂次分裂后，最终到达后，最终到达M2期。细胞由于端粒过短期。细胞由于端粒过短, ,基因不稳定基因不稳定, ,绝大多绝大多数细胞死亡数细胞死亡, ,只有极少数细胞由于端粒酶活性的上调或重新只有极少数细胞由于端粒酶活性的上调或重新激活激活, ,端粒的功能得到恢复端粒的功能得到恢复, ,基因重获稳定基因重获稳定, ,使细胞超越使细胞超越M M2期期, ,成为永生化细胞。成为永生化细胞。端粒酶被抑制端粒酶被抑制正常人体细胞正常人体细胞端粒丢失端粒丢失M1期阻滞期阻滞SV40T
50、抗原抗原细胞分裂停止细胞分裂停止Rb、P53与病毒蛋白结合、突变与病毒蛋白结合、突变M1M2期间隔期间隔永生化永生化双着丝粒形成双着丝粒形成M2期退化期退化染色体失稳染色体失稳端粒酶被激活端粒酶被激活细胞凋亡细胞凋亡端粒酶在人体细胞永生性转化中端粒酶在人体细胞永生性转化中端粒、端粒酶与肿瘤端粒酶活化是肿瘤的显著特征端粒酶活化是肿瘤的显著特征 尽管有研究认为端粒长度维持还可以借助于非尽管有研究认为端粒长度维持还可以借助于非端粒酶依赖模式，即端粒替代延长（端粒酶依赖模式，即端粒替代延长（altematirealtematire Lengthening of telomere ALTLengthen
51、ing of telomere ALT）机制，但其存在机制，但其存在上并不能否认永生化细胞中端粒酶的重要作用。自上并不能否认永生化细胞中端粒酶的重要作用。自从从19941994年年KimKim等创立等创立TRAPTRAP法检测端粒酶活性以来，法检测端粒酶活性以来，越来越多的文献证明端粒酶活性在大多数人类原发越来越多的文献证明端粒酶活性在大多数人类原发性肿瘤标本及肿瘤衍生细胞系中可被检测到。美国性肿瘤标本及肿瘤衍生细胞系中可被检测到。美国学者在学者在400多例来源于多例来源于12种不同组织的原发肿瘤病种不同组织的原发肿瘤病例中，肿瘤组织的端粒酶阳性率高达例中，肿瘤组织的端粒酶阳性率高达84.8，
52、而肿，而肿瘤周围组织或良性病变中阳性率仅为瘤周围组织或良性病变中阳性率仅为4.4。附表附表人体组织中端粒酶活性人体组织中端粒酶活性肿瘤部位/类型 与肿瘤邻近正常组织/良性病变 肿瘤组织（%）肺3/68（4.4%）109/136（80.1%）乳腺2/28（7.1%）19/24（79.6%）前列腺1/18（5.6%）23/27（85.1%）结肠0/45（0）22/23（95.6%）肝1/1（100%）卵巢0/8（0）7/7（100%）肾0/55（0）40/55（72.7%）神经母细胞瘤 0/17（0）94/100（94%）血液（淋巴瘤，CLL ALL） 21/23（91.3%）脑6/8（75%）其
53、它（头顶部，Wilms瘤） 8/93（8.6%） 24/26 (92.3) 合计 14/332 （4.2%） 365/430 (84.8) ShayShay等报道了几年不同学者对肿瘤端粒酶探讨的等报道了几年不同学者对肿瘤端粒酶探讨的检测结果，总结了正常组织（检测结果，总结了正常组织（196196例），原位癌（例），原位癌（410410例），恶性肿瘤（例），恶性肿瘤（20312031例）和癌旁组织（例）和癌旁组织（690690例）的例）的端粒酶的阳性率，它们分别是端粒酶的阳性率，它们分别是0.5%0.5%、30%30%、85%85%和和11%11%。在前列腺癌、乳腺、胰腺、肺、肝的早期癌中端粒酶
54、在前列腺癌、乳腺、胰腺、肺、肝的早期癌中端粒酶的阳性率为的阳性率为85.0%85.0%95.0%95.0%，而对应的癌旁或良性病变，而对应的癌旁或良性病变组织中，端粒酶基本上不能检出或活性极微弱。组织中，端粒酶基本上不能检出或活性极微弱。SumidaSumida等的研究结果表明等的研究结果表明, ,端粒酶在各种肿瘤中的阳端粒酶在各种肿瘤中的阳性率分别为性率分别为: :口腔鳞状细胞癌口腔鳞状细胞癌80 %80 %90%,90%,食道癌食道癌87%,87%,胃癌胃癌85%,85%,肺癌肺癌80.1%,80.1%,肝癌肝癌85%,85%,乳腺癌乳腺癌85%,85%,肾癌肾癌71%,71%,胰胰腺癌腺
55、癌95%,95%,端粒酶阳性率与肿瘤发生之间表现出良好的端粒酶阳性率与肿瘤发生之间表现出良好的相关性。相关性。Orlando等对泌尿系统恶性肿瘤进行了深入的等对泌尿系统恶性肿瘤进行了深入的流行病学调查流行病学调查,结果发现肾癌组织中端粒酶阳性率结果发现肾癌组织中端粒酶阳性率为为69%(345/497),正常肾组织为正常肾组织为2%(7/344);膀胱癌组膀胱癌组织中端粒酶阳性率为织中端粒酶阳性率为90%(342/381),正常组织为正常组织为27%(36/134);膀胱癌患者尿液中端粒酶阳性率为膀胱癌患者尿液中端粒酶阳性率为65%(436/675),膀胱灌洗液中端粒酶阳性率为膀胱灌洗液中端粒酶
56、阳性率为72%(131/182),而正常人为而正常人为9%(47/486);前列腺癌组织前列腺癌组织中端粒酶阳性率为中端粒酶阳性率为80%(266/332),邻近组织为邻近组织为38%(32/83),前列腺上皮瘤为前列腺上皮瘤为16%(4/25),良性前列良性前列腺肥大为腺肥大为8%(11/129)。85%90%的人肿瘤细胞中可以检测到端粒的人肿瘤细胞中可以检测到端粒酶活性酶活性,而正常细胞中却没有或活性很低。人们推而正常细胞中却没有或活性很低。人们推测肿瘤细胞逃避衰老持续增殖是端粒酶激活或端测肿瘤细胞逃避衰老持续增殖是端粒酶激活或端粒维持机制改变的结果。粒维持机制改变的结果。一般认为一般认为
57、,端粒酶的激活是恶性肿瘤发生过程端粒酶的激活是恶性肿瘤发生过程中的一个后期事件中的一个后期事件,使肿瘤细胞的端粒不再进行性使肿瘤细胞的端粒不再进行性缩短而得以维持缩短而得以维持,避免了细胞正常的复制避免了细胞正常的复制-衰亡机衰亡机制的制约而获得永生性制的制约而获得永生性,这是恶性肿瘤细胞显著的这是恶性肿瘤细胞显著的生物学特征之一生物学特征之一,是癌变机制中一个十分重要的环是癌变机制中一个十分重要的环节节。对细胞端粒功能的观察和推测的最显著的特征对细胞端粒功能的观察和推测的最显著的特征是发生端粒长度的维持是发生端粒长度的维持,甚至在离开常规的激活时甚至在离开常规的激活时端粒长度维持机制端粒长度
58、维持机制(TMM)的延长的延长,使初期细胞突破衰使初期细胞突破衰老屏障后癌变。发生的原因老屏障后癌变。发生的原因,最可能为过度的端粒最可能为过度的端粒酶激活在细胞癌变中端粒长度的保留或增加酶激活在细胞癌变中端粒长度的保留或增加,允许允许在致瘤突变发生时异常克隆的扩展。在致瘤突变发生时异常克隆的扩展。一些端粒酶阴性的癌症通过一种或几种一些端粒酶阴性的癌症通过一种或几种ALT途途经维持端粒的长度。端粒酶或经维持端粒的长度。端粒酶或ALT机制存在于绝大机制存在于绝大多数肿瘤细胞中以通过添加端粒重复序列而维持端多数肿瘤细胞中以通过添加端粒重复序列而维持端粒的长度。粒的长度。 在一些肿瘤中也观察到一些端
59、粒缩短的现象，在一些肿瘤中也观察到一些端粒缩短的现象，可能的机制是由于细胞分裂的增加端粒缩短，导致可能的机制是由于细胞分裂的增加端粒缩短，导致异常修复事件使染色体发生端端融合。端端融合的异常修复事件使染色体发生端端融合。端端融合的后果是在随后的细胞分裂过程中发生染色体断裂后果是在随后的细胞分裂过程中发生染色体断裂, ,进而导致遗传不稳定和肿瘤易感性。进而导致遗传不稳定和肿瘤易感性。以端粒酶为靶标的抗癌药物研究以端粒酶为靶标的抗癌药物研究在在85%85%以上的肿瘤细胞和组织中高度表达端粒酶，以上的肿瘤细胞和组织中高度表达端粒酶，因此端粒酶是一个较理想的抗肿瘤药物靶标。因此端粒酶是一个较理想的抗肿
60、瘤药物靶标。(1)(1)使用端粒酶抑制剂后使用端粒酶抑制剂后, ,肿瘤细胞端粒缩短直至足肿瘤细胞端粒缩短直至足以对增殖产生负面效应以对增殖产生负面效应, ,这种时间上的滞后与起始端这种时间上的滞后与起始端粒的长度有关；粒的长度有关；(2)(2)至少在理论上肿瘤细胞存在抗端粒酶抑制剂或不至少在理论上肿瘤细胞存在抗端粒酶抑制剂或不依赖端粒酶的端粒维持机制的可能；依赖端粒酶的端粒维持机制的可能；(3)(3)端粒酶抑制剂对人表达端粒酶的体细胞可能有作端粒酶抑制剂对人表达端粒酶的体细胞可能有作用用, ,例如造血干细胞、生殖细胞、表皮基层细胞和肠例如造血干细胞、生殖细胞、表皮基层细胞和肠腺管细胞腺管细胞,
61、 ,但这种作用可能很小但这种作用可能很小, ,因为新生组织的干因为新生组织的干细胞比肿瘤细胞的端粒要长得多。在细胞静止期细胞比肿瘤细胞的端粒要长得多。在细胞静止期, ,端端粒不缩短粒不缩短, ,端粒酶几乎没有活性。端粒酶几乎没有活性。 端粒酶抑制剂对肿瘤细胞和端粒酶阳性的端粒酶抑制剂对肿瘤细胞和端粒酶阳性的正常细胞的作用是不同的正常细胞的作用是不同的: :肿瘤细胞对端粒酶抑肿瘤细胞对端粒酶抑制剂很敏感制剂很敏感, ,作用一定时间后细胞出现生长抑制作用一定时间后细胞出现生长抑制或凋亡或凋亡; ; 生殖细胞在端粒酶抑制剂的作用下生殖细胞在端粒酶抑制剂的作用下, ,端粒长端粒长度稍有缩短度稍有缩短,
62、 ,然后继续生长然后继续生长, ,端粒不再缩短端粒不再缩短; ; 干细胞与端粒酶阴性的细胞相比干细胞与端粒酶阴性的细胞相比, ,其端粒缩其端粒缩短的速度慢得多短的速度慢得多, ,经端粒酶抑制剂作用后经端粒酶抑制剂作用后, ,干细干细胞中端粒缩短的速度有所加快胞中端粒缩短的速度有所加快, ,一旦去除抑制剂一旦去除抑制剂, ,端粒缩短的速度又降低。端粒缩短的速度又降低。端粒酶抑制剂的研究进展端粒酶抑制剂的研究进展一、以端粒酶酶一、以端粒酶酶RNA为靶标为靶标通过阻断端粒酶通过阻断端粒酶RNA的模板作用对端粒酶活性的抑的模板作用对端粒酶活性的抑制制1、反义寡核苷酸是端粒酶抑制剂研究领域中的热点,它是
63、与靶RNA配对的一段短链DNA。按碱基配对原理与靶RNA形成杂合体,被动和主动地抑制RNA的转录。 2、核酶对端粒酶活性的抑制，核酶是具有特殊核酸内切酶活性的小分子RNA，通过催化中心的反义序列识别靶位。核酶有望成为广谱，低毒，高效的抗癌新药。二、抑制端粒酶逆转录酶活性二、抑制端粒酶逆转录酶活性1、hTERT突变突变在体内和体外实验中,hTERT突变后端粒酶活性均明显被抑制。端粒酶抑制剂诱导端粒进行性缩短,当细胞端粒缩短到临界点时细胞进入凋亡期。2、逆转录酶抑制剂、逆转录酶抑制剂(reversetranscriptaseinhibitors,RTI)由于端粒酶是RNA依赖的DNA聚合酶,所以R
64、TI可以成为肿瘤治疗药物。其中对于齐多夫定的研究最多。3 3、靶向、靶向hTERThTERT mRNA mRNA的的ASODNASODN针对hTERTmRNA 设计的ASODN 能选择性地与靶基因杂交,阻断靶基因的表达。三、三、G四联体的稳定四联体的稳定端粒3端突出链富含鸟苷,在体外可形成四链DNA结构,称为G四联体。形成G四联体后端粒酶活性受到抑制。因此,能稳定G四联体的药物就可能是有效的端粒酶抑制剂。已发现很多此类化合物,这些药物可以抑制端粒酶,但尚无缩短端粒的报道。四、小分子抑制剂四、小分子抑制剂 通过分子结构模拟软件进行拟合分析，或通过其他高通量模式快速筛选端粒酶的小分子抑制剂是近年来
65、发展较快的一个领域,此方法是基于化学结构的生物信息学策略去搜寻先导化合物,用这一策略已发现了几个端粒酶抑制剂(例如FJ5002) ,但其作用机制尚不清楚。Li et al, Cancer Res 2004; Li et al, 2005; Bagheri et al 2006 Telomerase knock-down in cancer cellsRAPIDLY inhibits cancer cell growthp53 is not required for thisNO telomere uncapping or DNA damage responseMetastasis is red
66、ucedHOW?RAPIDLY downregulates cell cycle and tumor progression genesGlucose metabolism downregulated Cell differentiation program induced? Very short telomeres lead to chromosomal instability by cycles of BRIDGE BREAKAGE FUSIONAnaphase bridges End-to-end fusionTelomere shortening123VIDEODicentric ch
67、romosome in a metaphase spread of cells from a human pancreatic carcinoma cell line (centromes in pink)MORE cell divisionssenescenceWith more telomerase, less loss of DNA each cell divisioncelldivisionsFastersenescenceWith less telomerase, more loss of DNA each cell divisionTelomeres and DiseaseCAD,
68、 Myocardial InfarctionDiabetesVascular dementiaObesity, insulin resistanceAlzheimers DiseaseRheumatoid ArthritisBone DensitySamani et al, Lancet, 2001; Brouilette et al, 2003; Arterioscler Thromb Vasc Biol 2003; Sampson, 2006, Diabetes Care; von Zglinicki, 2000, Lab Invest. Jeanclos et al, 2000, Hyp
69、ertension; Valdes et al, . Lancet 2005; Gardner, 2005, Circulation; Valdes et al, 2006, Osteoporosis Int. Steer et al., 2007 Annals Rheum Disease; Cawthon, 2003, LancetThree Markers of Cellular Aging Telomerase activityTelomere lengthCellular Oxidative stress Psychological Stress, Risks of Cardiovas
70、cular Disease and Telomeres/Telomerase/Oxidative StressTelomere maintenance and risk of cardiovascular diseaseIn the largest epidemiological study of risk factors for cardiovascular disease, six prominent factors were shown to be: smoking poor lipid profilehigh blood pressurediabetesabdominal obesit
71、ypsychological stress(Yusef et al, Lancet 2004:304). A link in vivoIn the largest epidemiological study of risk factors for cardiovascular disease, six prominent factors were shown to be: smoking poor lipid profilehigh blood pressurediabetesabdominal obesitypsychological stress(Yusef et al, Lancet 2
72、004:304). Chronic stress was associated with three markers of cellular agingLower telomerase activityHigher oxidative indexShorter telomere length Telomere maintenance and risk of cardiovascular disease*Epel et al, 2004*A link in vivoIn the largest epidemiological study of risk factors for cardiovas
73、cular disease, six prominent factors were shown to be: smoking poor lipid profilehigh blood pressurediabetesabdominal obesitypsychological stress(Yusef et al, Lancet 2004:304). smoking cholesterol/blood lipids resting cardiovascular activityfasting insulin and glucoseadipositypsychological stressChr
74、onic stress was associated with three markers of cellular agingLower telomerase activityHigher oxidative indexShorter telomere length Telomere maintenance and risk of cardiovascular disease*Epel et al, 2004*A link in vivoIn the largest epidemiological study of risk factors for cardiovascular disease
75、, six prominent factors were shown to be: smoking poor lipid profilehigh blood pressurediabetesabdominal obesitypsychological stress(Yusef et al, Lancet 2004:304). smoking cholesterol/blood lipids resting cardiovascular activityfasting glucoseadipositypsychological stressStress was associated with t
76、hree markers of cellular agingLower telomerase activityHigher oxidative indexTelomere length Telomere maintenance and risk of cardiovascular disease*Epel et al, 2006A link in vivoExample: Telomerase and whether currently smokingp 10kb10kb）, ,随细胞有随细胞有丝分裂，端粒缩短是个缓慢的过程，这种情况下端丝分裂，端粒缩短是个缓慢的过程，这种情况下端粒酶抑制剂是
77、否有效尚待进一步证实。粒酶抑制剂是否有效尚待进一步证实。二、研究展望二、研究展望 大量实验表明，端粒酶可有效地调控端粒的大量实验表明，端粒酶可有效地调控端粒的长度，而端粒的长度直接对细胞的增殖或凋亡起作长度，而端粒的长度直接对细胞的增殖或凋亡起作用，从而决定人体寿命的长短。随着对端粒、端粒用，从而决定人体寿命的长短。随着对端粒、端粒酶结构和端粒酶激活及调节机制的深入研究酶结构和端粒酶激活及调节机制的深入研究, ,端粒端粒酶与人类衰老和肿瘤发生、发展的关系将进一步明酶与人类衰老和肿瘤发生、发展的关系将进一步明确确; ; 如何将端粒酶检测作为肿瘤诊断标记仍是今后如何将端粒酶检测作为肿瘤诊断标记仍是
78、今后研究的方向。研究的方向。 同时进一步探讨端粒、端粒酶和衰老因素、长同时进一步探讨端粒、端粒酶和衰老因素、长寿因素之间的关系，以及开展克隆人端粒基因等科寿因素之间的关系，以及开展克隆人端粒基因等科研课题对于研究人体衰老与抗衰老有着十分重要的研课题对于研究人体衰老与抗衰老有着十分重要的意义。意义。第三节第三节 端粒酶细胞周期中细胞增殖、凋亡的影响端粒酶细胞周期中细胞增殖、凋亡的影响一、端粒酶对细胞周期的影响一、端粒酶对细胞周期的影响端粒酶活性与细胞周期密切相关。细胞周期所端粒酶活性与细胞周期密切相关。细胞周期所处阶段不同处阶段不同,端粒酶活性亦不同端粒酶活性亦不同,端粒酶活性与细胞端粒酶活性与
79、细胞周期周期CDK-CKIs网络调控系统有关网络调控系统有关。实验发现永生。实验发现永生化细胞株在细胞周期各个时相都有端粒酶活性化细胞株在细胞周期各个时相都有端粒酶活性,而而静息细胞中活性降低静息细胞中活性降低,随着肿瘤细胞进入随着肿瘤细胞进入G1/S期期,端端粒酶活性逐渐升高粒酶活性逐渐升高,在复制在复制S期端粒酶活性最高期端粒酶活性最高,而而在在G2/M期端粒酶活性逐渐丧失期端粒酶活性逐渐丧失,当培养细胞处于无当培养细胞处于无血清而进入血清而进入G0期时期时,端粒酶活性不受影响。在人乳端粒酶活性不受影响。在人乳腺癌中腺癌中,端粒酶的高活性水平伴有端粒酶的高活性水平伴有cylinD或或cyc
80、linE的高表达的高表达,某些周期蛋白可能参与端粒酶活性的调某些周期蛋白可能参与端粒酶活性的调控控。各种基因毒性或环境应激所致细胞各种基因毒性或环境应激所致细胞DNA双链双链破坏时可使野生型破坏时可使野生型p53活化活化,进而引起细胞周期停进而引起细胞周期停滞或诱导细胞凋亡滞或诱导细胞凋亡,使细胞得以避免表型恶性转化。使细胞得以避免表型恶性转化。端粒双链端粒双链DNA的破坏是否也能活化的破坏是否也能活化p53依赖的信依赖的信号传导通路呢号传导通路呢?kusumoto等在构建的端粒酶和等在构建的端粒酶和p53单或双缺陷鼠体内研究证实单或双缺陷鼠体内研究证实,端粒端粒DNA的丢失可的丢失可以诱导活
81、化以诱导活化p53和和p21WAF1,并导致细胞周期停滞，并导致细胞周期停滞，而而p53的缺失则可促进端粒序列的丢失的缺失则可促进端粒序列的丢失,增大染色增大染色体的融合频率。端粒功能的缺失以及相继出现的体的融合频率。端粒功能的缺失以及相继出现的基因不稳定与基因不稳定与p53缺陷相协同而激活细胞恶性转化缺陷相协同而激活细胞恶性转化过程。过程。二、端粒酶对细胞增殖的影响二、端粒酶对细胞增殖的影响 曾一度认为端粒酶活性是细胞恶变或永生的标志曾一度认为端粒酶活性是细胞恶变或永生的标志, ,然而然而, ,不但在正常组织的永生化细胞不但在正常组织的永生化细胞( (如造血干细胞、精如造血干细胞、精子子)
82、,) ,而且在非永生的、正常生理状态下增殖活跃的细而且在非永生的、正常生理状态下增殖活跃的细胞胞( (如受抗原刺激的如受抗原刺激的T T及及B B淋巴细胞、口腔和食道粘膜上淋巴细胞、口腔和食道粘膜上皮、皮肤基底层角质形成细胞、宫颈上皮、小肠上皮皮、皮肤基底层角质形成细胞、宫颈上皮、小肠上皮) ) 也可检出端粒酶活性。但也可检出端粒酶活性。但LehnerLehner 等用定量等用定量RT-PCR RT-PCR 法在法在子宫内膜癌、增生期子宫内膜、分泌期子宫内膜及萎缩子宫内膜癌、增生期子宫内膜、分泌期子宫内膜及萎缩性子宫内膜检测到性子宫内膜检测到hTERThTERT mRNA mRNA 表达值差异
83、显著。可见表达值差异显著。可见, ,不同增殖程度的子宫内膜均表达端粒酶活性不同增殖程度的子宫内膜均表达端粒酶活性, ,但其程度但其程度不同。因此不同。因此, ,借助端粒酶定性检测判断良恶性增殖借助端粒酶定性检测判断良恶性增殖, ,其意其意义明显不如定量检测。义明显不如定量检测。已有多次报道已有多次报道:改变实验条件可使多种端粒酶活改变实验条件可使多种端粒酶活性阴性细胞表达端粒酶活性性阴性细胞表达端粒酶活性,并获得永生并获得永生;反之反之,抑制抑制某些增殖活跃组织的端粒酶活性能抑制细胞增殖。某些增殖活跃组织的端粒酶活性能抑制细胞增殖。另有人发现另有人发现:端粒酶通过调节端粒长度和生长促端粒酶通过
84、调节端粒长度和生长促进因子基因表达来影响细胞增殖进因子基因表达来影响细胞增殖。提示端粒酶是细胞。提示端粒酶是细胞生长、增殖中的重要机制。生长、增殖中的重要机制。但少数永生化的肿瘤细胞株和一些软组织肿瘤但少数永生化的肿瘤细胞株和一些软组织肿瘤虽然没有端粒酶活性虽然没有端粒酶活性,但仍有较长端粒但仍有较长端粒,提示还存在提示还存在不依赖端粒酶的端粒延长机制不依赖端粒酶的端粒延长机制。此外用识别此外用识别hTR3端不同序列的三种核酶作用端不同序列的三种核酶作用于肿瘤细胞于肿瘤细胞,4周内端粒酶活性降低周内端粒酶活性降低,端粒缩短端粒缩短,增殖增殖速度没有改变。速度没有改变。其他研究如黑素瘤细胞其他研
85、究如黑素瘤细胞,8周内端粒酶活性降低周内端粒酶活性降低,但是传代超过但是传代超过20代后代后,端粒长度不缩短端粒长度不缩短,细胞持续增细胞持续增殖。说明除了端粒、端粒酶引起细胞增殖的作用外，殖。说明除了端粒、端粒酶引起细胞增殖的作用外，还有其他引起细胞的增殖机制。还有其他引起细胞的增殖机制。三、三、端粒酶对细胞凋亡的影响端粒酶对细胞凋亡的影响启动凋亡的某些基因位于端粒结构附近启动凋亡的某些基因位于端粒结构附近,完整的端完整的端粒结构可以抑制这些基因的表达粒结构可以抑制这些基因的表达,而维持端粒长度主而维持端粒长度主要依赖于端粒酶。要依赖于端粒酶。Holt等在实验中发现等在实验中发现,通过异位表
86、达端粒酶通过异位表达端粒酶,而使端而使端粒长度保持稳定的某些正常细胞对凋亡的抵抗力增强；粒长度保持稳定的某些正常细胞对凋亡的抵抗力增强；用实验方法使端粒酶阳性细胞端粒延长用实验方法使端粒酶阳性细胞端粒延长,子代细胞生子代细胞生存和抗凋亡能力将增强；端粒酶阳性永生化细胞要比存和抗凋亡能力将增强；端粒酶阳性永生化细胞要比端粒酶阴性永生化细胞有更强的抗凋亡生存能力。这端粒酶阴性永生化细胞有更强的抗凋亡生存能力。这些与两个主要的凋亡途径些与两个主要的凋亡途径核内钙依赖核酸内切酶诱核内钙依赖核酸内切酶诱导途径和导途径和Caspese家族中家族中IL-1B转换酶活化途径存在缺转换酶活化途径存在缺陷有关。此外陷有关。此外,研究发现诱导研究发现诱导hTERT显性突变显性突变,降低降低肿瘤细胞内源性端粒酶活性肿瘤细胞内源性端粒酶活性,肿瘤细胞端粒将持续缩肿瘤细胞端粒将持续缩短短,继之异常有丝分裂增多继之异常有丝分裂增多,并最终出现大量凋亡细胞。并最终出现大量凋亡细胞。
