转基因生物第十三周星期五上午

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1、1转基因生物转基因生物第四章第四章Transgenic biology龚青龚青 副教授副教授基因基因: : 是一个特定的是一个特定的DNADNA片段片段 ，编码一种，编码一种特定的多肽或蛋白质，是遗传信息的功能特定的多肽或蛋白质，是遗传信息的功能单位单位n一般一般说来，从来，从细菌到哺乳菌到哺乳动物的全物的全部生命有机体，它部生命有机体，它们的基因都是由的基因都是由DNADNA构成的。由于所有生物的构成的。由于所有生物的DNADNA的的基本基本结构是一致的，因此，来自两构是一致的，因此，来自两种生命形种生命形态的基因可以融的基因可以融为一体。一体。n由此可由此可见，基因的，基因的DNADNA共

2、性，是共性，是进行行基因工程的重要理基因工程的重要理论基基础之一。之一。 nDNADNA分子是分子是遗传物物质和基因的和基因的载体。体。基因是基因是细胞中所有的胞中所有的RNARNA及蛋白及蛋白质分分子的子的“蓝图”。n一旦基因一旦基因发生突生突变，那么由它指，那么由它指导合成的蛋白合成的蛋白质也将随之也将随之发生生变化，化，甚至可能甚至可能导致活性的致活性的丧失。失。1）转基因：转基因：将人工分离和修饰过的基因导入到将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组中。生物体基因组中。2）转基因技术（转基因技术（Transgene technology）：）：指指利用分子生物学技术，将某些生物的基因

3、转移利用分子生物学技术，将某些生物的基因转移到到其它其它物种中，改造生物的遗传物质，并使其物种中，改造生物的遗传物质，并使其在性状、营养和消费品质等方面向人类需要的在性状、营养和消费品质等方面向人类需要的目标转变目标转变。转基因技术转基因技术自然选择自然选择人工定向改造人工定向改造 转基因技术转基因技术 将希望转入的基因注射到小鼠的受精卵的细胞核中，使注射将希望转入的基因注射到小鼠的受精卵的细胞核中，使注射的的DNA整合到受精卵的基因组中。然后将该卵细胞注射（移植）整合到受精卵的基因组中。然后将该卵细胞注射（移植）到宿主鼠的子宫中，使其发育，产下子代小鼠，从子代鼠中提取到宿主鼠的子宫中，使其发

4、育，产下子代小鼠，从子代鼠中提取DNA样品，检测外源基因（转移基因）是否整合到了子代鼠中。样品，检测外源基因（转移基因）是否整合到了子代鼠中。成功成功移植移植不成功不成功移植移植探针检测到转移基因探针检测到转移基因将将注射外源基因的注射外源基因的卵移植到宿主鼠子卵移植到宿主鼠子宫中宫中向向受精卵受精卵中注射外中注射外源基因源基因 通常都是将提取的通常都是将提取的DNA用限制性内切酶进行酶切，然用限制性内切酶进行酶切，然后电泳，将电泳后凝胶上的核酸物质转移到薄膜（硝酸纤后电泳，将电泳后凝胶上的核酸物质转移到薄膜（硝酸纤维素薄膜）上，用探针检测是否存在转移基因。探针是能维素薄膜）上，用探针检测是否

5、存在转移基因。探针是能够与转移基因结合的一段单链够与转移基因结合的一段单链DNA或或RNA。 著名的转基因鼠实验是让小鼠携带额外的生长激素基著名的转基因鼠实验是让小鼠携带额外的生长激素基因，结果接受了外源生长激素基因的受精卵发育的小鼠的因，结果接受了外源生长激素基因的受精卵发育的小鼠的体重是正常小鼠体重的两倍。体重是正常小鼠体重的两倍。 利用苏云金芽孢杆菌在利用苏云金芽孢杆菌在西红柿细胞西红柿细胞DNA内引入一段内引入一段基因，这段基因能够编码出基因，这段基因能够编码出对毛毛虫有毒性的蛋白，抑对毛毛虫有毒性的蛋白，抑制虫害。制虫害。 抗毛毛虫西红柿抗毛毛虫西红柿正正常常鼠鼠转入生长转入生长激素

6、基因激素基因的小鼠的小鼠转基因微生物转基因微生物：分解石油的假单孢杆菌等：分解石油的假单孢杆菌等转基因动物转基因动物：转基因牛、猪、鸡、鲤鱼等：转基因牛、猪、鸡、鲤鱼等 转基因植物转基因植物：转基因大豆、转基因抗虫棉、：转基因大豆、转基因抗虫棉、转基因玉米、转基因水稻、转基因抗除草剂农作物转基因玉米、转基因水稻、转基因抗除草剂农作物等等转基因生物转基因生物转基因动物转基因动物转基因植物转基因植物转基因动物转基因动物：以实验方法将外源基因导入动以实验方法将外源基因导入动物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的物染色体基因组内稳定整合并能遗传给后代的一类动物一类动物。第一节第一节 转基因动物转基因

7、动物特点特点分子及细胞水平操作，组织及动物整体分子及细胞水平操作，组织及动物整体水平表达水平表达转基因动物的研究历史转基因动物的研究历史1974年，美国学者年，美国学者Jaenisch首次应用显微镜首次应用显微镜注射法获得转基因小鼠。注射法获得转基因小鼠。 1981年，美国科学家成功地将外源基因导年，美国科学家成功地将外源基因导入动物胚胎，创立了转基因动物技术。入动物胚胎，创立了转基因动物技术。1982年获得转基因小鼠。年获得转基因小鼠。 1982年，年，Palmiter将大鼠的生长激素基因导将大鼠的生长激素基因导入小鼠受精卵中，获得体重是对照组入小鼠受精卵中，获得体重是对照组2倍的倍的“超级

8、鼠超级鼠”。 1985年，年，Wagner等利用拼接有新霉素抗性基等利用拼接有新霉素抗性基因的逆转录病毒感染胚胎干细胞（因的逆转录病毒感染胚胎干细胞（ES细胞），细胞），获得嵌合体小鼠，为利用获得嵌合体小鼠，为利用ES细胞制备转基因小细胞制备转基因小鼠开辟了先河。鼠开辟了先河。转转基基因因超超级级鼠鼠1982年，英国的年，英国的自然自然杂志发表了一篇文章：杂志发表了一篇文章：有两个美国实验小组利用转基因技术，将有两个美国实验小组利用转基因技术，将大鼠生大鼠生长激素重组基因长激素重组基因导入到导入到小鼠小鼠受精卵中，培育出具受精卵中，培育出具快速生长效应的快速生长效应的“转基因超级鼠转基因超级鼠

9、”。转基因鼠比。转基因鼠比与它同胎所生的小鼠生长速度快与它同胎所生的小鼠生长速度快23倍，体积大倍，体积大一倍。一倍。1989年，意大利学者用精子作为载体转移目年，意大利学者用精子作为载体转移目的基因，成功地获得了纯系转基因小鼠。的基因，成功地获得了纯系转基因小鼠。 1987年，世界上第一只商业化转基因绵羊在年，世界上第一只商业化转基因绵羊在英国著名的罗斯林研究所诞生。这只转基因母英国著名的罗斯林研究所诞生。这只转基因母羊的乳汁中可以分泌羊的乳汁中可以分泌-抗胰蛋白酶，含量高达抗胰蛋白酶，含量高达30毫克毫克/升。升。 1997年年2月，英国罗斯林研究所维尔穆特博月，英国罗斯林研究所维尔穆特博

10、士科研组公布体细胞克隆羊士科研组公布体细胞克隆羊“多利多利”培育成功。培育成功。 1999年年2月，上海遗传研究所宣布转基因试月，上海遗传研究所宣布转基因试管牛管牛“滔滔滔滔”诞生，其体内被检测到带有人的诞生，其体内被检测到带有人的血清白蛋白基因，这项成果被评为当年血清白蛋白基因，这项成果被评为当年“中国中国十大科技进展十大科技进展”之一。之一。 1997年年10月，英国罗斯林研究所月，英国罗斯林研究所（Roslin）宣布已成功克隆出宣布已成功克隆出3只携带有人凝只携带有人凝血因子血因子基因转染绵羊。基因转染绵羊。 二、基本原理二、基本原理获取外源目的基因获取外源目的基因实验动物的受精卵或着床

11、前的胚胎细胞中实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中目的基因整合到基因组中目的基因整合到基因组中 再植入受体动物输卵管再植入受体动物输卵管(子宫子宫) 揭示外源基因的功能揭示外源基因的功能 显微注射等显微注射等基因转移方法基因转移方法发育成携带有外源基因的转基因动物发育成携带有外源基因的转基因动物 培育优良的动物品种培育优良的动物品种 转基因技术操作的具体流程转基因技术操作的具体流程（一）目的基因的设计（一）目的基因的设计 转基因可分为转基因可分为随机整合型基因随机整合型基因和和基因敲除（基因敲除（gene gene knockoutknockout）型载体基因型载体基因。随机整合型基因要求结构

12、完随机整合型基因要求结构完整，整，包括包括5 5上游启动子区和上游启动子区和3 3下游区等，多用基因下游区等，多用基因组文库筛选或人为改造基因，改造基因可选择不同的组文库筛选或人为改造基因，改造基因可选择不同的启动子来控制外源基因表达的组织特异性。启动子来控制外源基因表达的组织特异性。基因敲除基因敲除（gene knockoutgene knockout）型载体基因要设计与待剔除基因型载体基因要设计与待剔除基因的同源性的载体基因。的同源性的载体基因。三、转基因的基本方法三、转基因的基本方法（二）重（二）重组载体的构建体的构建 选择合适的基因合适的基因载体，要求体，要求载体序列不干体序列不干扰外

13、源外源基因的表达、能接受外源基因的表达、能接受外源DNA、稳定、定、对宿主宿主细胞无胞无威威胁。（三）重（三）重组载体的体外体的体外验证（in vitroin vitro） 重重组载体的正确性体的正确性验证，如拷，如拷贝数、数、连接方向等。接方向等。对于于连有有组织特异性启特异性启动子或局部体子或局部体细胞胞转染的染的载体体需先在同需先在同类型的体外离体培养型的体外离体培养细胞中初步胞中初步验证表达特表达特性。性。（四）基因（四）基因转移移 1 1）化学法）化学法 2 2）物理法）物理法 3 3）生物法）生物法 （五）（五）转基因基因动物模型的物模型的验证从基因从基因组、mRNA、蛋白、蛋白质

14、和整体表型和整体表型各个各个层次次进行行验证。用核酸用核酸杂交、聚合交、聚合酶链反反应、免疫印迹、免疫印迹杂交、交、酶联免疫法、免疫免疫法、免疫荧光法和光法和Western杂交法等多种方交法等多种方法法，筛选出有外源基因整合的出有外源基因整合的阳性阳性动物物，传代后代后检测外源基因在外源基因在转基因基因动物中的物中的表达表达情况，情况，对外源基因表外源基因表达达产物的生物活性和生化性物的生物活性和生化性质进行行鉴定定，以及，以及检查转基因基因动物的生理功能和是否出物的生理功能和是否出现某些疾病症状的表型某些疾病症状的表型等。等。（六）组建转基因系（六）组建转基因系 第一代转基因动物是半合子转基

15、因动物，因为第一代转基因动物是半合子转基因动物，因为外源基因仅在一条染色体上稳定整合。只有通过选外源基因仅在一条染色体上稳定整合。只有通过选种选配，将两个半合子转基因动物成功交配，才能种选配，将两个半合子转基因动物成功交配，才能得到得到纯合子转基因动物纯合子转基因动物，建立转基因动物家系，外，建立转基因动物家系，外源源DNADNA才能在后代中稳定遗传。才能在后代中稳定遗传。 1 1、显微注射法、显微注射法：以单细胞受精卵为靶细胞，以单细胞受精卵为靶细胞，利用利用显微注射技术显微注射技术将将构建好的构建好的外源外源DNADNA直接直接注注射到射到受精卵的原核受精卵的原核内，再把内，再把接受接受注

16、射注射的受精的受精卵移入假孕母体输卵管卵移入假孕母体输卵管，使之发育成正常的，使之发育成正常的幼仔，幼仔，获得转基因动物个体。获得转基因动物个体。 目前应用较广泛，最早最经典的方法目前应用较广泛，最早最经典的方法。 操作技术性很强，受过严格训练的专业人操作技术性很强，受过严格训练的专业人员操作，发育成转基因动物的受精卵也只占员操作，发育成转基因动物的受精卵也只占注射卵的注射卵的5。因此用增大微注射受精卵的数。因此用增大微注射受精卵的数目的办法提高成功率。目的办法提高成功率。转基因的主要技术转基因的主要技术 1） 显显 微微 注注 射射 法法microinjection 它它是是创创造造转转基基

17、因因动物的有效途径动物的有效途径。microinjectionn 显微注射法将外源基因导入生殖细胞和体系胞显微注射法将外源基因导入生殖细胞和体系胞后，后，在染色体上的整合位置是随机的在染色体上的整合位置是随机的n 外源基因外源基因甲基化程度甲基化程度在胚胎发育过程中会影响在胚胎发育过程中会影响其活性其活性n 某些外源基因的表达程度可受到个体细胞某些外源基因的表达程度可受到个体细胞正常正常调节机制调节机制的控制的控制n 由于受到宿主组织分化的影响，由于受到宿主组织分化的影响，外源基因还具外源基因还具有一定的组织特异性有一定的组织特异性显微注射法获得转基因鼠的成活率显微注射法获得转基因鼠的成活率

18、优点：点：外源外源DNADNA大小基本不受限制（大小基本不受限制（1-50kb1-50kb）；）；导入入过程直程直观；无需无需载体体 缺点：缺点：设备昂昂贵、环节较多多对操作人操作人员有有较高的技高的技术要求要求效率低（尤其是大家畜）效率低（尤其是大家畜）对卵子卵子伤害大，胚胎存活率低害大，胚胎存活率低转基因沉默基因沉默2 2、胚胎干细胞、胚胎干细胞（ESES细胞）法细胞）法ESES细胞是早期胚胎的内胞是早期胚胎的内细胞胞团经过体外体外培养建立起来的多潜能培养建立起来的多潜能细胞系。胞系。它是一种含正常二倍体染色体的具有它是一种含正常二倍体染色体的具有发育全能性的细胞。发育全能性的细胞。可以在

19、体外进行人工培养，扩增，并可以在体外进行人工培养，扩增，并能以克隆的形式保存。能以克隆的形式保存。 将将携带携带有有外源基因的外源基因的ES细胞细胞注注射射入入动动物的早期胚胎内，物的早期胚胎内，将来出生的动物的生殖将来出生的动物的生殖系统就有可能整合上系统就有可能整合上外源基因。外源基因。再通过再通过杂杂交交繁育得到繁育得到纯合目的基因纯合目的基因的个体的个体，即为即为转转基因动物。基因动物。 目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应目前，胚胎干细胞介导法在小鼠上应用比较成熟，在大动物上应用较晚。用比较成熟，在大动物上应用较晚。 优点：点：1.1.外源基因整合情况的可控性高外源基因整合情况的可控性高

20、, ,可可预先在先在细胞水胞水平平检测外源基因的拷外源基因的拷贝数、定位、表达的水平数、定位、表达的水平及插入的及插入的稳定性定性2.2.外源基因外源基因导入入ESES细胞的方法多胞的方法多样，如逆，如逆转录病病毒感染法、毒感染法、电击法等，法等，细胞胞鉴定及定及筛选方便方便 缺点：缺点： 1. ES1. ES细胞系建立及培养困胞系建立及培养困难 2. 2. 维持持ESES细胞的未分化及多向分化潜能不易胞的未分化及多向分化潜能不易 将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成将目的基因重组到逆转录病毒载体上，制成高滴度病毒颗粒，人为感染着床前后的胚胎（也高滴度病毒颗粒，人为感染着床前后的胚胎（也可直

21、接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细可直接将胚胎与能释放逆转录病毒的单层培养细胞共同培养以达到感染目的胞共同培养以达到感染目的), ), 获得转基因动物获得转基因动物的方法。的方法。目前这种方法主要应用于鸡胚胎操作。目前这种方法主要应用于鸡胚胎操作。3 3、逆转录病毒感染法、逆转录病毒感染法反转录病毒感染法的载体的构建反转录病毒感染法的载体的构建提取病毒未整合的环状形式提取病毒未整合的环状形式DNA；将环状将环状DNA克隆到适当的载体中；克隆到适当的载体中；选择适当的酶将病毒结构蛋白编码区切除；选择适当的酶将病毒结构蛋白编码区切除；将外源目的基因克隆到载体中将外源目的基因克隆到载体中通过物理

22、方法将重组通过物理方法将重组DNA分子转入包装细胞分子转入包装细胞 反转录病毒载体的工作原理：反转录病毒载体的工作原理：寄生在受体细胞中的重组病毒由寄生在受体细胞中的重组病毒由于没有包装信号，能生产病病毒于没有包装信号，能生产病病毒RNA和所有蛋白质，但不能和所有蛋白质，但不能包装成病毒颗粒；病毒载体转化受体细胞后，载体上的包装信包装成病毒颗粒；病毒载体转化受体细胞后，载体上的包装信号将使包装蛋白把载体包装成为侵染生的病毒颗粒。号将使包装蛋白把载体包装成为侵染生的病毒颗粒。 优点：点： 受精卵携受精卵携带外源基因的阳性率高外源基因的阳性率高 外源基因多外源基因多单拷拷贝整合整合 操作操作简单，

23、避免注射法，避免注射法对卵子的卵子的损害害 宿主范宿主范围广广 可同可同时感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高感染大量胚胎，感染率及胚胎存活率高 缺点：缺点： 容容纳大小有限大小有限 潜在致癌性潜在致癌性, ,载体复体复杂 整合率不高整合率不高, ,胚胎自我保胚胎自我保护机制机制对其有抗性其有抗性4、体细胞核移植方法、体细胞核移植方法： 将外源基因导入到体细胞中，将外源基因导入到体细胞中，将外源基因导入到体细胞中，将外源基因导入到体细胞中，筛选、培养筛选、培养、扩扩增，增，用这种细胞的细胞核进行用这种细胞的细胞核进行用这种细胞的细胞核进行用这种细胞的细胞核进行核移植，核移植，核移植，核移植，即即

24、即即把把把把体细胞体细胞核核核核植入一个植入一个植入一个植入一个去了核的卵母细胞去了核的卵母细胞去了核的卵母细胞去了核的卵母细胞中，融合并激活，将中，融合并激活，将中，融合并激活，将中，融合并激活，将重重重重构构胚胚胚胚胎胎进行体外培养或者植入同步化的假孕动物进行体外培养或者植入同步化的假孕动物进行体外培养或者植入同步化的假孕动物进行体外培养或者植入同步化的假孕动物的输卵管。的输卵管。的输卵管。的输卵管。 优点：优点：n转基因效率显著超过显微注射转基因效率显著超过显微注射n可以方便的建立生产畜群可以方便的建立生产畜群n可以预测基因表达水平可以预测基因表达水平n可以使用定点整合目标基因的技术可以

25、使用定点整合目标基因的技术n对体细胞进行基因改造后，用于核移植可以对体细胞进行基因改造后，用于核移植可以提高转基因的效率，具有提高转基因的效率，具有“ES细胞途径细胞途径”的的全部优点，且物种适用面广。全部优点，且物种适用面广。缺点：缺点：n 技技术上上难度大，成功率极低，度大，成功率极低，n 胚胎死亡率高，胚胎死亡率高，n 非一般非一般实验室可以开展。室可以开展。 直接以精子直接以精子为载体的体的转基因方法：将成熟精子与基因方法：将成熟精子与外源共培养，成熟精子与外源外源共培养，成熟精子与外源DNADNA预培养之后培养之后使精子有能力携使精子有能力携带外源外源DNADNA进入卵子中，使之受精

26、，入卵子中，使之受精，并使外源并使外源DNADNA整合到染色体中。整合到染色体中。 目前国目前国际上只有上只有1 1例成功模型，国内也很少有相例成功模型，国内也很少有相关关报道，精子道，精子载体法很少被体法很少被应用。用。 5、精子载体法、精子载体法染色体及基因水平：斑点杂交、染色体及基因水平：斑点杂交、SouthernSouthern杂交、杂交、PCRPCR转录水平：转录水平：NorthernNorthern杂交杂交蛋白质水平：蛋白质水平：WesternWestern印迹印迹转基因动物中外源基因的检测转基因动物中外源基因的检测 转基因动物研究存在的问题转基因动物研究存在的问题转基因动物的低效

27、性转基因动物的低效性转入基因造成宿主基因突变问题转入基因造成宿主基因突变问题转入基因的表达问题转入基因的表达问题病毒转基因研究存在的问题病毒转基因研究存在的问题转基因动物模型与预期不符问题转基因动物模型与预期不符问题乳腺生物反应器的问题乳腺生物反应器的问题社会问题社会问题转基因动物研究出现的问题转基因动物研究出现的问题1 1、制作、制作转基因基因动物效率低：物效率低：如如显微注射法生微注射法生产转基因基因动物小鼠、大鼠、兔、牛、猪、物小鼠、大鼠、兔、牛、猪、绵羊，羊，转基因阳性率基因阳性率分分别为26%26%、44%44%、15%15%、0.7%0.7%、0.9%,0.9%0.9%,0.9%。

28、2 2、外源基因在宿主基因、外源基因在宿主基因组中的行中的行为难以控制：以控制：转基因基因随机整合随机整合于于动物基因物基因组中，有可能引起宿主中，有可能引起宿主细胞染色胞染色体的插入突体的插入突变，可造成插入位点的基因片段的，可造成插入位点的基因片段的丢失及失及位移，也可能激活正常情况下位移，也可能激活正常情况下处于关于关闭的基因。其的基因。其结果果导致致转基因阳性个体出基因阳性个体出现不育、胚胎死亡、流不育、胚胎死亡、流产、畸形等异常畸形等异常现象。象。3 3、转基因表达水平低：基因表达水平低：许多多转基因的表达水平受到宿基因的表达水平受到宿主染色体上整合位点的影响，出主染色体上整合位点的

29、影响，出现异位表达，影响异位表达，影响转基因的表达能力，从而使大部分基因的表达能力，从而使大部分转基因表达水平基因表达水平较低低转基因动物的应用转基因动物的应用一、转基因动物在生命科学基础研究中的应用一、转基因动物在生命科学基础研究中的应用研究基因的结构与功能研究基因的结构与功能研究基因的组织特异性表达研究基因的组织特异性表达研究发育相关基因的表达与调控研究发育相关基因的表达与调控克隆在发育中起重要作用的基因克隆在发育中起重要作用的基因基因多级调节系统的研究基因多级调节系统的研究细胞功能研究细胞功能研究基基因因敲敲除除（gene knock out），是是指指对对一一个个结结构构已已知知但但功

30、功能能未未知知的的基基因因，从从分分子子水水平平上上设设计计实实验验，将将该该基基因因去去除除，或或用用其其它它顺顺序序相相近近基基因因取取代代，然然后后从从整整体体观观察察实实验验动动物物，推推测测相相应应基基因因的的功功能能。这这与与早早期期生生理理学学研研究究中中常常用用的的切切除除部部分分观察整体观察整体推测功能的三部曲思想相似。推测功能的三部曲思想相似。 基因敲除的技术路线如下：基因敲除的技术路线如下：（1）构建重组基因载体）构建重组基因载体（2）用电穿孔、显微注射等方法把重组）用电穿孔、显微注射等方法把重组DNA转入受体转入受体细胞核内细胞核内（3）用选择培养基筛选已击中的细胞）用

31、选择培养基筛选已击中的细胞（4）将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物，）将击中细胞转入胚胎使其生长成为转基因动物，对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。对转基因动物进行形态观察及分子生物学检测。 二、转基因动物在医药研究领域中的应用二、转基因动物在医药研究领域中的应用研究病毒性疾病研究病毒性疾病研究建立人类疾病的转基因动物模型研究建立人类疾病的转基因动物模型转基因动物与基因治疗转基因动物与基因治疗生产天然活性药物蛋白生产天然活性药物蛋白 1 1、转基因动物是对多种生命现象本质深入了、转基因动物是对多种生命现象本质深入了解的工具。如研究基因的结构与功能的关系、解的工具。如研究基因的结构与

32、功能的关系、细胞发育的潜能性、细胞核与细胞质的相互细胞发育的潜能性、细胞核与细胞质的相互关系、胚胎发育调控、肿瘤、神经与发育等。关系、胚胎发育调控、肿瘤、神经与发育等。n2 2、可用来建立多种疾病的动物模型，进而、可用来建立多种疾病的动物模型，进而研究这些疾病的发病机理及治疗方法。如研究这些疾病的发病机理及治疗方法。如代谢病高歇氏代谢病高歇氏( (GaucherGaucher) )病转基因小鼠的应病转基因小鼠的应用。用。n3 3、转基因动物技术可由于改造动物的基、转基因动物技术可由于改造动物的基因组而改良其经济性状，提高经济效益。因组而改良其经济性状，提高经济效益。n4 4、转基因动物可作为医

33、用或食用蛋白的、转基因动物可作为医用或食用蛋白的生物反应器。如转基因山羊抗凝血酶生物反应器。如转基因山羊抗凝血酶IIIIII、转基因绵羊、转基因绵羊 1-1-抗胰蛋白酶、转基因兔抗胰蛋白酶、转基因兔的的 - -葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶。n5 5、通过转基因动物可以生产人体或动物进行、通过转基因动物可以生产人体或动物进行器官或组织移植时所需的器官和组织。如家畜器官或组织移植时所需的器官和组织。如家畜胎儿神经细胞可替代人类神经细胞用于帕金森胎儿神经细胞可替代人类神经细胞用于帕金森症的治疗。症的治疗。n第三军医大学西南医院将转基因乳猪皮用于皮第三军医大学西南医院将转基因乳猪皮用于皮肤移植。猪器官的体积和

34、形状以及肤移植。猪器官的体积和形状以及DNADNA基本与基本与人类相似，是理想的肾、心、肝等器官供应者，人类相似，是理想的肾、心、肝等器官供应者，但存在免疫排斥，可通过转基因技术和克隆技但存在免疫排斥，可通过转基因技术和克隆技术培育大量不术培育大量不含免疫排斥的转基因克隆猪含免疫排斥的转基因克隆猪的器的器官。官。n乳腺生物反乳腺生物反应器的研究器的研究1987年，年，Gordon首次首次报道小鼠乳腺中表达道小鼠乳腺中表达tPA蛋白。至今国蛋白。至今国际上上转基因羊、基因羊、转基因牛等基因牛等的成功的成功报道道实例已有例已有10多种，生多种，生产出抗胰蛋白出抗胰蛋白酶、乳、乳铁蛋白、人凝血蛋白因

35、子蛋白、人凝血蛋白因子、蛋白、蛋白质C等等药用蛋白。国外用蛋白。国外经济学家学家预期，期，10年后，年后，转基因基因动物生物生产的的药物物销售售额超超过250亿美元。美元。基因药物生产基因药物生产n基因基因药物生物生产第一第一阶段是段是细菌基因工程，第二菌基因工程，第二阶段是段是动物物细胞基因工程，第三胞基因工程，第三阶段是段是转基因基因动物物乳腺生物反乳腺生物反应器。器。n 三、三、转基因基因动物研究物研究进展展n1 1、英格兰罗斯林研究所、英格兰罗斯林研究所(Roslin)1997(Roslin)1997年成年成功培育转基因绵羊，其乳汁中含有人的凝功培育转基因绵羊，其乳汁中含有人的凝血因子

36、血因子IXIX，用来治疗血友病；含有的用来治疗血友病；含有的 - -抗抗胰蛋白酶可治疗北美肺气肿。胰蛋白酶可治疗北美肺气肿。n2 2、日本培育的转基因鸡含有白血病阻止因子，、日本培育的转基因鸡含有白血病阻止因子，可能成为生产抗癌药品的可能成为生产抗癌药品的“动物工厂动物工厂”。n3 3、湖北省农科院魏庆信研究员、湖北省农科院魏庆信研究员20002000年培育转年培育转基因猪，能合成人血清白蛋白，为治疗因失血、基因猪，能合成人血清白蛋白，为治疗因失血、创伤、癌症等引起的休克、水肿等提供医用血创伤、癌症等引起的休克、水肿等提供医用血清白蛋白开辟了新途径。清白蛋白开辟了新途径。n4 4、华中农业大学

37、和中国农业大学合作，用转、华中农业大学和中国农业大学合作，用转基因小鼠乳腺表达人瘦蛋白的研究。基因小鼠乳腺表达人瘦蛋白的研究。n5 5、用转基因技术生产的基因工程小鼠已经达到、用转基因技术生产的基因工程小鼠已经达到很高的水平。如将特定的外源基因插入小鼠的基很高的水平。如将特定的外源基因插入小鼠的基因组，可得到转基因小鼠因组，可得到转基因小鼠(transgenic mice)(transgenic mice)；将小鼠的基因组中特定内源基因定点突变，可得将小鼠的基因组中特定内源基因定点突变，可得到基因剔除小鼠到基因剔除小鼠(gene knockout mice)(gene knockout mic

38、e)；将小将小鼠的基因组中特定内源基因进行定向重组，可得鼠的基因组中特定内源基因进行定向重组，可得到基因替换小鼠到基因替换小鼠(gene (gene knockinknockin mice) mice)。为医为医学研究提供了丰富的动物模型。如学研究提供了丰富的动物模型。如BALB/C-HSF1BALB/C-HSF1用于热休克研究、用于热休克研究、Smad3Smad3用于研究粘膜免疫缺陷用于研究粘膜免疫缺陷和骨性关节炎等。和骨性关节炎等。n6 6、转基因研究已经渗透到医学、遗传学、发育、转基因研究已经渗透到医学、遗传学、发育生物学、畜牧学等领域。生物学、畜牧学等领域。 转基因动物的应用前景转基因

39、动物的应用前景1 1、研究外源基因在动物整体水平的表达调控、研究外源基因在动物整体水平的表达调控规律。规律。2 2、转基因动物疾病模型可用来进行疾病发病、转基因动物疾病模型可用来进行疾病发病学和治疗性研究学和治疗性研究3 3、改善动物生产性能，提高动物育种效率。、改善动物生产性能，提高动物育种效率。4 4、改变动物基因使其表现型更适合人类需要，、改变动物基因使其表现型更适合人类需要，用转基因动物生产一些人类所需的生物活性物用转基因动物生产一些人类所需的生物活性物质。质。第二节第二节 转基因植物转基因植物n转基因植物基因植物(transgenicplant)：是指利用：是指利用重重组DNA技技术

40、将克隆的将克隆的优良目的基因良目的基因导入植入植物物细胞或胞或组织中中进行表达，从而行表达，从而获得新性状得新性状的植物。的植物。n这一技一技术使基因交流的范使基因交流的范围无限无限扩大，可将大，可将从从细菌、病毒、菌、病毒、动物、物、远缘植物、人工合成植物、人工合成的的基因基因导入植物，所以其入植物，所以其应用前景十分广用前景十分广阔 一、基本方法一、基本方法获取外源目的基因，获取外源目的基因，克隆到表达载体克隆到表达载体培养受体细胞，如培养悬浮细胞培养受体细胞，如培养悬浮细胞将转化细胞进行适当培养将转化细胞进行适当培养筛选阳性转化细胞筛选阳性转化细胞转基因植株的鉴定转基因植株的鉴定 电击法

41、、基因枪法、显微注射法电击法、基因枪法、显微注射法培植阳性转化植株培植阳性转化植株抗抗虫虫基基因因 1. 技术路线技术路线目的基因分离目的基因分离植物表达载体的构建植物表达载体的构建受体材料的准备受体材料的准备遗传转化遗传转化转化组织转化组织组织脱分化组织脱分化转化植株筛选转化植株筛选炼苗炼苗 1.目的基因的分离目的基因的分离n（1）已知基因的）已知基因的获得得n化学合成法化学合成法nPCR扩增增n（2）未知基因的）未知基因的获得得n构建基因构建基因组文文库，筛选目的基因目的基因n构建构建cDNA文文库，筛选目的基因目的基因nmRNA差异差异显示技示技术筛选差异表达基因差异表达基因n差异蛋白差

42、异蛋白质谱表达技表达技术筛选功能基因功能基因npGEM-T银杏叶银杏叶银杏叶银杏叶RNARNA提取提取提取提取反转录反转录cDNA全长全长cDNA的克隆的克隆克隆及测序克隆及测序两端引入酶切位点两端引入酶切位点双酶切双酶切定向克隆定向克隆导入农杆菌导入农杆菌 2.植物表达载体的构建植物表达载体的构建例例 pBI121-chs构建构建pBI121图谱图谱 3.遗传转化遗传转化n（1）间接接转化法化法农杆菌介杆菌介导转化法化法 n（2）直接）直接转化法化法n A、 基因基因枪转化法化法n B、 电击法法n C、花粉管通道法、花粉管通道法n D、 PEG介介导基因基因转化法化法v根癌农杆菌根癌农杆菌

43、 v(Agrobacterium tumefaciens),是一种革兰氏阴性土壤杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌,它含有它含有Ti质粒质粒,能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤能诱导被侵染的植物细胞形成肿瘤,即诱发冠瘿瘤即诱发冠瘿瘤.Ti质粒质粒(包括包括Ri质粒质粒)上有一段上有一段转移转移DNA,在农杆菌侵染宿主植物时在农杆菌侵染宿主植物时,这段这段DNA可以转移进植物细胞可以转移进植物细胞,并稳定地保并稳定地保留在植物细胞染色体中留在植物细胞染色体中,变为植物细胞新增加的一群基因变为植物细胞新增加的一群基因,最终能通过有性世代遗最终能通过有性世代遗传给子代传给子代 。v基因枪转化法由美国基因枪转化

44、法由美国Cornell大大学的学的Sanfor (1987)提出提出,它的主要它的主要原理是将包含目的基因的载体包原理是将包含目的基因的载体包被在微小的金属微粒被在微小的金属微粒(钨粒或金粒钨粒或金粒)表面表面,通过高压驱动力加速微粒穿通过高压驱动力加速微粒穿透植物细胞壁透植物细胞壁,导入受体组织细胞导入受体组织细胞内内,然后通过组织培养再生出完整然后通过组织培养再生出完整的植株的植株.微粒上的外源微粒上的外源DNA进入细进入细胞后胞后,整合到染色体上并得到表达整合到染色体上并得到表达,从而实现基因的转化。从而实现基因的转化。v电电击击法法的的主主要要原原理理是是将将原原生生质质体体在在溶溶液

45、液中中与与DNA混混合合,然然后后利利用用高高压压电电脉脉冲冲作作用用,使使原原生生质质体体膜膜的的某某些些部部位位被被击击穿穿而而产产生生可可回回复复的的小小孔孔,外外源源DNA可可通通过过小小孔孔进进入入原原生生质质体体内内,而而且且不不影影响响经经电电击击处处理理的原生质体再生植物的能力的原生质体再生植物的能力. v花花粉粉管管通通道道法法是是利利用用开开花花植植物物授授粉粉后后形形成成的的花花粉粉管管通通道道,直直接接将将外外源源目目的的基基因因导导入入尚尚不不具具备备正正常常细细胞胞壁壁的的卵卵、合合子子或或早早期胚胎细胞期胚胎细胞,实现目的基因转化实现目的基因转化. nPEGPEG

46、介介导导基基因因转转化化的的主主要要原原理理是是聚聚乙乙二二醇醇(PEG)(PEG)、多多聚聚-L-L-鸟鸟核核苷苷酸酸( (pLOpLO) )、磷磷酸酸钙钙及及高高pHpH值值条条件件下下诱诱导导原原生生质质体体摄摄取取外外源源DNADNA分分子子。PEGPEG可可促促使使细细胞胞膜膜与与DNADNA间间接接触触与与粘粘连连, ,并并通通过过引引起起膜膜表表面面电电荷荷的的紊紊乱乱及及干干扰扰细细胞胞间间的的识识别别, ,利利于于细细胞胞膜膜间间的的融融合合以以及及外外源源DNADNA进进入原生质体入原生质体. . 表表1 几种植物转基因方法比较几种植物转基因方法比较转基因方法转基因方法转化

47、的优点转化的优点转化的缺点转化的缺点DNA间接转化间接转化法法农杆菌介导基农杆菌介导基因转移因转移受体种类，可以在原生质受体种类，可以在原生质体、蛋细胞和细胞团、组体、蛋细胞和细胞团、组织器官或整株等多级水平织器官或整株等多级水平上进行，方法成熟可靠，上进行，方法成熟可靠，简便易行，周期短，转化简便易行，周期短，转化率高；率高；转化双子叶植物为主。转化双子叶植物为主。大多数单子叶植物和裸大多数单子叶植物和裸子植物对农杆菌的侵入子植物对农杆菌的侵入不敏感，限制了该法在不敏感，限制了该法在禾谷类作物中的应用。禾谷类作物中的应用。转化体常出现转化体常出现“嵌合嵌合”现象，需在严格条件下现象，需在严格

48、条件下加以选择以淘汰未转化加以选择以淘汰未转化细胞细胞DNA直接转化法直接转化法1）基因枪转化法）基因枪转化法2） 电击法电击法3） PEG介导基因介导基因转化法转化法4）花粉管通道法）花粉管通道法无宿主限制，适用于各种无宿主限制，适用于各种单、双子叶植物，操作简单、双子叶植物，操作简单单转化效率低，需要专门转化效率低，需要专门设备（电击仪、显微操设备（电击仪、显微操作仪或基因枪），多数作仪或基因枪），多数需要原生质体与愈伤组需要原生质体与愈伤组织，周期太长（电击法）织，周期太长（电击法） 4.转化组织转化组织 农杆菌介导之叶盘转化法农杆菌介导之叶盘转化法带有转化基因的农杆菌活化带有转化基因的

49、农杆菌活化受体植物受体植物叶盘叶盘侵染侵染共培养共培养筛选培养筛选培养诱导成苗诱导成苗预培养叶盘，预培养叶盘，或愈伤组织或愈伤组织5.炼苗炼苗6.转基因苗的筛选与鉴定转基因苗的筛选与鉴定培养培养过程中利用程中利用标记基因基因筛选标记基因标记基因选择标记基因选择标记基因(Slective gene)报告基因报告基因(Report gene)抗生素类选择基因抗生素类选择基因抗除草剂类选择基因抗除草剂类选择基因生物安全性标记类选择基因生物安全性标记类选择基因-D-葡萄糖酸苷酶基因葡萄糖酸苷酶基因(Gus)荧光素酶基因荧光素酶基因(Luc)氯霉素乙酰转移酶基因氯霉素乙酰转移酶基因(Cat)绿色荧光蛋白

50、基因绿色荧光蛋白基因(Gfp)例例 Gus检测检测原理：原理：葡萄糖酸苷酶基因（葡萄糖酸苷酶基因（GusGus），），催化催化葡萄糖苷酯类物质水解。其中很葡萄糖苷酯类物质水解。其中很多水解产物具有发色团或形成荧光物质。多水解产物具有发色团或形成荧光物质。例：组织化学法测定例：组织化学法测定GusGus活性活性 作用底物为作用底物为X-X-glucgluc, ,产物是一种不可溶的产物是一种不可溶的5,5-5,5-二溴，二溴，4,4-4,4-二氯靛蓝；二氯靛蓝；转基因植物的转基因植物的PCR检测检测外源基因整合的外源基因整合的PCR-Southern杂交交检测外源基因表达的外源基因表达的RT-PC

51、RSouthernSouthern杂交过程杂交过程杂交过程杂交过程外源基因导入植物的方法外源基因导入植物的方法（1）农杆菌介杆菌介导的基因的基因转移移n自然界中存在着根癌自然界中存在着根癌农杆菌，含有杆菌，含有Ti质粒粒，约200-250kb。将表达某蛋白。将表达某蛋白质的的结构基因克隆到构基因克隆到Ti质粒的粒的T-DNA内，再用内，再用重重组质粒粒转化化农杆菌杆菌n当当农杆菌感染杆菌感染双子叶双子叶植物受植物受伤组织后，后，Ti质粒上的一粒上的一段段DNA可被整合到植物的染色体上，并随染色体一可被整合到植物的染色体上，并随染色体一起复制，在一定的条件下可以起复制，在一定的条件下可以长成新生

52、的植株。并将成新生的植株。并将这种性状种性状传给子代子代n农杆菌是一种天然的植物杆菌是一种天然的植物遗传转化体系化体系 。外源基因外源基因（2）基因枪法）基因枪法n利用基因利用基因枪的装置，将的装置，将钨粉或金粉与外源粉或金粉与外源DNA吸附制成吸附制成“子子弹”，通，通过高高压放放电将将“子子弹”加速到加速到482m/s，金属粒子能穿透植物，金属粒子能穿透植物细胞壁，胞壁，击发一次可将成千上万个一次可将成千上万个带有外源有外源DNA的金属的金属粒子同粒子同时射入完整的射入完整的细胞或器官。胞或器官。n优点：点：单子叶和双子叶都可使用子叶和双子叶都可使用n缺点：成本高，操作麻缺点：成本高，操作

53、麻烦。二、转基因植物在医学上的应用二、转基因植物在医学上的应用n植物基因工程技植物基因工程技术生生产药用蛋白：如用蛋白：如1型糖尿病型糖尿病是一种自身免疫性疾病。利用植物是一种自身免疫性疾病。利用植物转基因技基因技术，将将谷氨酸脱谷氨酸脱羧酶等自身免疫抗原基因等自身免疫抗原基因转入植物入植物细胞内，表达相胞内，表达相应抗原，通抗原，通过口服食用此口服食用此转基基因植物因植物诱导机体机体产生免疫耐受，生免疫耐受，为免疫干免疫干预1型型糖尿病的糖尿病的发生与生与发展提供一条新的防治途径展提供一条新的防治途径优点：点：植物是真核生物，可在自身植物是真核生物，可在自身细胞内完成胞内完成蛋白的翻蛋白的翻

54、译后加工，使生后加工，使生产的的药物更利于人体物更利于人体吸收；吸收； 大幅度降低生大幅度降低生产成本，提高成本，提高产量。量。n转基因植物可成基因植物可成为新的疫苗来源，植物病毒也成新的疫苗来源，植物病毒也成为人人类疫苗的可能来源。疫苗的可能来源。 优点点: 植物病毒植物病毒对动物不致病，利用植物病毒表达物不致病，利用植物病毒表达抗原蛋白的片段，以抗原蛋白的片段，以诱导哺乳哺乳动物免疫系物免疫系统发生生反反应。n转基因植物基因植物还可以生可以生产单抗，有公司已用抗，有公司已用转基因基因大豆生大豆生产出出单抗抗BR96，作，作为化化疗药物的靶向物的靶向载体治体治疗乳腺癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌和肺癌，目前正癌、卵巢癌和肺癌，目前正处于于试验阶段。段。 三、存在问题三、存在问题1 1、食品安全问题：、食品安全问题：1 1）未知的可能副作用？）未知的可能副作用？2 2）外源基因在人体内表达？）外源基因在人体内表达？2 2、技术问题：、技术问题：1 1）成本；）成本；2 2）成功率；）成功率；3 3）基因组的有效整合、稳定遗传；）基因组的有效整合、稳定遗传；目目 录录The End