《何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件》由会员分享，可在线阅读，更多相关《何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件（78页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、一、粘性末端的连接一、粘性末端的连接DNA连连接接酶酶把把相相互互靠靠近近的的5端端磷磷酸酸与与3-OH连到一起连到一起单酶切、双酶切单酶切、双酶切第一节第一节 DNA的体外重组的体外重组DNA的的体体外外重重组组：将将目目的的基基因因与与载载体体连连接接，这这种种重重新新组组合的合的DNA称为重组称为重组DNA。（一）（一） 直接连接直接连接T4 DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的只有粘性末端的110%。5 5 5 5 3 3 3 3 -OH-OH-P-PP-P-HO-HO-5 3 -OH-PP-HO-5 3 二、平末端（二、平末端（
2、blunt end）的连接）的连接（1）同聚加尾法）同聚加尾法 （二）（二） 人工加尾形成人工加尾形成 “粘性末端粘性末端” DNA末端转移酶末端转移酶能在没有模板的情况下给能在没有模板的情况下给DNA的的3-OH端端加上脱氧核苷酸。加上脱氧核苷酸。 原理：原理：分别给载体和插入片断加上分别给载体和插入片断加上互补的互补的核苷酸。核苷酸。 加尾碱基互补加尾碱基互补缺点：缺点：优点：优点：能把任何片能把任何片段连接起来段连接起来操作繁琐；操作繁琐；外源片段难以回收外源片段难以回收；同聚物尾巴影响外源同聚物尾巴影响外源基因表达。基因表达。非酶切位点（2）衔接物（）衔接物（linker）连接）连接L
3、inker：用化学合成法合成的一段用化学合成法合成的一段10-12bp的，具有一个或数的，具有一个或数个限制性内切酶识别位点的个限制性内切酶识别位点的平末端双链寡核苷酸平末端双链寡核苷酸GGAATTCC CCTTAAGGEcoR I linker：（二）（二） 人工加尾形成人工加尾形成 “粘性末端粘性末端” （1）多核苷酸激酶处理）多核苷酸激酶处理（2）T4连接酶连接连接酶连接（3）限制性内切酶消化）限制性内切酶消化（4）目的片段与载体连接）目的片段与载体连接（二）（二） 人工加尾形成人工加尾形成 “粘性末端粘性末端” （3 3）DNA接头接头 （adapter）连接法）连接法 adapter
4、一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-OH3 3HO-GGCC-p5 BamHI adapterP-P5p-GATCCCGG- GGCC-CCGG -GGCCCTAG-P5 接头与接头以粘末端连接，影响与接头与接头以粘末端连接，影响与DNA片段的连接片段的连接 优点：优点：连上后就能用。连上后就能用。 缺点：缺点：先先用用小小牛牛肠肠碱碱性性磷磷酸酸酶酶（CIP）处处理理接接头头，水水解解掉掉其其5端的磷酸，防止自我连接。端的磷酸，防止自我连接。 防止自我连接防止自我连接5p-GATCC
5、CGG- GGCC-CCGG GGCCCTAG-p5 Blunt-ended DNA5p-GATCCCGG-3 GGCC-p5 BamHI adapterP-P 5HO-GATCCCGG- GGCC CCGG -GGCCCTAG-OH5 5HO-GATCCCGG3 GGCC-OH5 nick缺口缺口nick缺口缺口HO-OHCIP处理处理T4 ligase虽然有缺口，但仍然能与虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接片断连接T4多核苷酸激酶处理使多核苷酸激酶处理使5磷酸化磷酸化三、三、PCR产物的连接产物的连接1.1.在引物的在引物的55端设计酶切位点端设计酶切位点符合载体的多克隆位点；符合载体的
6、多克隆位点；（1 1）设计原则）设计原则（2 2）带酶切位点的引物的结构）带酶切位点的引物的结构33端端151520bp20bp与模板互补；与模板互补； 55端内切酶识别序列端内切酶识别序列保护碱基保护碱基避免与所扩增的避免与所扩增的DNADNA片断内部酶切位点重复。片断内部酶切位点重复。三、三、PCR产物的连接产物的连接1.1.在引物的在引物的55端设计酶切位点端设计酶切位点请请设设计计一一对对PCR引引物物，在在N端端和和C端端分分别别加加一一个个EcoRI（GAATTC，保保护护碱碱基基GCA）和和BamHI酶酶切切位位点点（GGATCC，保保护护碱碱基基CGC），另另外外，各各含含有有
7、18个个同同该该基基因因同同源源的的核核苷苷酸酸，能能够够用用于于扩扩增增该该基基因因的的编编码码序序列列。写出写出P1和和P2的引物序列。的引物序列。 带酶切位点的带酶切位点的PCR产物产物GCAGAATTC PCR产物产物5-3 CCTAGGCGC PCR产物产物-5 3- CGTCTTAAGGGATCCGCGEcoR I位点位点BamH I位点位点AATTC PCR产物产物5-3 CCTAG PCR产物产物-5 3- GGEcoR I BamH I两头各有一个粘性末端！两头各有一个粘性末端！AAdNTPTTdTTPTaq DNA聚合酶聚合酶载体载体PCR产物产物TATA三、三、PCR产物
8、的连接产物的连接2. 2. 与与T T载体直接连接载体直接连接三、三、Gateway 载体构建系统载体构建系统 噬菌体位点特异性重组系统；噬菌体位点特异性重组系统；高效的实现高效的实现DNA序列在多种载体系统的转移。序列在多种载体系统的转移。入门克隆入门克隆改造过的各种表达载体改造过的各种表达载体三、三、Gateway 载体构建系统载体构建系统（1）创建入门克隆）创建入门克隆 BP反应：反应：attB+attP attL+attR，产物：入门克隆，产物：入门克隆入门克隆入门克隆改造过的各种表达载体改造过的各种表达载体三、三、Gateway 载体构建系统载体构建系统（2）构建表达克隆）构建表达克
9、隆 LR反应：反应：attL+attR attB+attP，产物：表达克隆，产物：表达克隆入门克隆入门克隆改造过的各种表达载体改造过的各种表达载体第二节第二节 重组体导入受体细胞重组体导入受体细胞一、重组一、重组DNA导入大肠杆菌导入大肠杆菌（一）转化（一）转化（transformation）大肠杆菌捕获大肠杆菌捕获质粒质粒DNA的过程。的过程。（三）转染（三）转染（transfection）受体菌直接捕获受体菌直接捕获噬菌体噬菌体DNA的过程。的过程。（二）转导（二）转导（transduction）借助借助噬菌体噬菌体把外源把外源DNA导入细菌的过程。导入细菌的过程。（一）转化（一）转化（t
10、ransformation）（1）热激法（）热激法（heat shock）（2）电转化法（）电转化法（electronporation）（3）PEG介导的原生质体转化介导的原生质体转化（4）接合转化）接合转化制备感受态细胞制备感受态细胞增加受体菌细胞膜的通透性增加受体菌细胞膜的通透性（1）热激法）热激法 目的目的目的目的感受态细胞：感受态细胞：处于能吸收处于能吸收外源外源DNA分子的生理状分子的生理状态的细胞态的细胞制备感受态细胞制备感受态细胞1、将将处处于于对对数数生生长长期期的的细细菌菌置置于于0的的CaCl2低低渗渗溶溶液液中中，细细胞膨胀成球形，处于感受态；胞膨胀成球形，处于感受态；2
11、、将将感感受受态态细细胞胞与与DNA混混合合，Ca2+与与DNA结结合合形形成成抗抗DNase的羟基的羟基-磷酸钙复合物，粘附于细胞表面；磷酸钙复合物，粘附于细胞表面；3、经、经42短时间热激处理，细胞吸收短时间热激处理，细胞吸收DNA复合物；复合物；4、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。、在培养基中生长数小时之后，球形细胞复原并增殖。（1）热激法）热激法 CaCl CaCl2 2法制备感受态细胞转化法制备感受态细胞转化法制备感受态细胞转化法制备感受态细胞转化DNADNA的原理的原理的原理的原理 10ng载体载体DNA100 L感受态细胞感受态细胞冰浴冰浴30min42 12min
12、加入加入1mL LB培养基培养基（Amp-）37振荡培养振荡培养1h10-100 L转化转化液涂液涂Amp平板平板吸附吸附DNA摄入摄入DNA操作步骤：操作步骤：（p140）转化率：转化率：106-108/ g DNA（2）电转化法）电转化法原原理理：在在高高压压脉脉冲冲下下，细细菌菌细细胞胞表表面面形形成成暂暂时时性性微微孔孔，重重组组DNA通通过过微微孔孔进进入入细细胞胞后后，脉脉冲冲结结束束，细胞恢复原状。，细胞恢复原状。实验简单，实验简单，不需要制备特殊的感受态细胞不需要制备特殊的感受态细胞 “感感受受态态”：清清洗洗处处理理，在在低低温温下下使使细细胞胞处处于于无无离离子子区区且且有
13、有甘甘油油或或蔗蔗糖糖等等保保护护剂剂的的悬悬液液中中，保保证证电电击过程中细胞不被击穿而死亡。击过程中细胞不被击穿而死亡。转化率：转化率：1091010/ g DNA（二）（二） 转导转导由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息的转移过程由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息的转移过程（三）（三） 转染转染噬菌体噬菌体DNA不经过蛋白包装成病毒颗粒，直接不经过蛋白包装成病毒颗粒，直接被感受态细胞捕获的过程。被感受态细胞捕获的过程。与转化无本质区别与转化无本质区别体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，形成噬菌斑。体外包装好的重组噬菌体感染受体菌，形成噬菌斑。每每 g DNA能形成能形成106个噬菌斑个噬菌斑 现
14、在把现在把DNA转移至动物细胞的过程也称转染转移至动物细胞的过程也称转染 体外包装过程 二、重组二、重组DNA导入真核细胞导入真核细胞（一）导入酵母细胞（一）导入酵母细胞1.1.原生质体转化原生质体转化2.2.碱金属离子介导的完整细胞转化碱金属离子介导的完整细胞转化3.3.PEG1000PEG1000转化法转化法4.4.电击法电击法（二）导入植物细胞（二）导入植物细胞（三）导入动物细胞（三）导入动物细胞1. 利用原生质体进行转化利用原生质体进行转化 酵母酵母原生质体原生质体感受态感受态酶去壁酶去壁CaCl2 PEG插入外源基因的载体插入外源基因的载体共转化：共转化：将两个以上的基因同时导入感受
15、态细胞的方法将两个以上的基因同时导入感受态细胞的方法转化转化转化细胞达原生质体总数的转化细胞达原生质体总数的1%2%，转化率受再生率影响，转化率受再生率影响共转化的原生质体占转化子总数的共转化的原生质体占转化子总数的25%33%何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件 酵母酵母0.1mol/L LiCl处理处理感受态感受态2. 2. 碱金属离子介导的完整细胞转化碱金属离子介导的完整细胞转化碱金属离子介导的完整细胞转化碱金属离子介导的完整细胞转化插入外源基因的载体插入外源基因的载体40% PEG 4000热激热激涂布选择性平板，筛选转化
16、子涂布选择性平板，筛选转化子 吸收线性吸收线性DNA能力明显大于环状能力明显大于环状DNA，两者相差，两者相差80倍倍转化率：转化率：103个个 / g DNA；共转化现象极少共转化现象极少何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件4. 4. 电击转化电击转化电击转化电击转化（1）适于原生质体和完整细胞）适于原生质体和完整细胞（2）转化率高，）转化率高，105个个 / g DNA（3）单链转化率高于双链）单链转化率高于双链3. PEG10003. PEG1000转化转化转化转化PEG处理酵母细胞，可获得类感受态，用于转化处理酵母细胞，可
17、获得类感受态，用于转化何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件二、重组二、重组DNA导入真核细胞导入真核细胞（一）导入酵母细胞（一）导入酵母细胞1.1.载体介导的转化（农杆菌介导）载体介导的转化（农杆菌介导）2.2.DNADNA直接导入（基因抢法、电击法等）直接导入（基因抢法、电击法等）3.3.种质系统法（花粉管通道法等）种质系统法（花粉管通道法等）（二）导入植物细胞（二）导入植物细胞（三）导入动物细胞（三）导入动物细胞何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件（二）导入植物细
18、胞（二）导入植物细胞1. 农杆菌介导的农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法质粒遗传转化方法将目的基因插入到载体将目的基因插入到载体的的T-DNA区，形成重组区，形成重组DNA何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件（二）导入植物细胞（二）导入植物细胞1. 农杆菌介导的农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法质粒遗传转化方法将将重重组组DNA转转入入含含有有Vir致病基因的农杆菌致病基因的农杆菌何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件（二）导入植物细胞（二）导入植物细胞1. 农杆菌介导的农
19、杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法质粒遗传转化方法通通过过农农杆杆菌菌侵侵染染植物外植体植物外植体何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件（二）导入植物细胞（二）导入植物细胞1. 农杆菌介导的农杆菌介导的Ti质粒遗传转化方法质粒遗传转化方法将将含含有有外外源源目目的的基基因因的的T-DNA整整合合到到植植物物细细胞胞基基因因组中，获得转基因植株组中，获得转基因植株何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件在饲养平皿的滤在饲养平皿的滤纸上培养纸上培养2天天叶叶盘盘法法的的具具体体操操
20、作作 何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件又称生物弹击法、微弹轰击法，借助高速金属微又称生物弹击法、微弹轰击法，借助高速金属微粒将粒将DNA分子引入活细胞的转化技术。分子引入活细胞的转化技术。DNA1.2 m钨弹头钨弹头 吸附吸附金属微粒加速，进入受体细胞金属微粒加速，进入受体细胞基因枪基因枪装入装入2. 2. 基因枪法（基因枪法（基因枪法（基因枪法（gene gungene gun） 外植体制备外植体制备轰击轰击外植体培养及选择外植体培养及选择何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛
21、选和鉴定课件件何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件具具体体操操作作 1. DNA1. DNA微弹的制备微弹的制备微弹的制备微弹的制备2. 2. 外植体的制备外植体的制备外植体的制备外植体的制备3. DNA3. DNA微弹轰击微弹轰击微弹轰击微弹轰击4. 4. 外植体的培养外植体的培养外植体的培养外植体的培养何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件植物细胞植物细胞原生质体原生质体纤维素酶纤维素酶和果胶酶和果胶酶DNA混合入混合入电击缓冲液电击缓冲液电击处理电击处理愈伤组织愈
22、伤组织幼苗幼苗分化分化3. 3. 电击法（电穿孔法）电击法（电穿孔法）电击法（电穿孔法）电击法（电穿孔法）选择培养选择培养何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件二、重组二、重组DNA导入真核细胞导入真核细胞（一）导入酵母细胞（一）导入酵母细胞1. 1. 磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法2. 2. 脂质体介导法脂质体介导法3. 3. 显微注射法显微注射法4. DEAE-4. DEAE-葡萄糖转染法葡萄糖转染法（二）导入植物细胞（二）导入植物细胞（三）导入动物细胞（三）导入动物细胞何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程
23、基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件原理：原理：（三）导入动物细胞（三）导入动物细胞1. 磷酸钙沉淀法磷酸钙沉淀法通通过过磷磷酸酸钙钙-DNA共共沉沉淀淀，将将外外源源基基因因导导入入哺乳动物细胞哺乳动物细胞依据不同的细胞类型，平皿上最多能有依据不同的细胞类型，平皿上最多能有10%的细胞能吸收的细胞能吸收DNA沉淀。沉淀。何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件操作简便，成本低廉、可大批量转染、对细胞毒性小、操作简便，成本低廉、可大批量
24、转染、对细胞毒性小、效果稳定，但效果稳定，但转染效率低转染效率低。何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件2. 2. 脂质体介导法脂质体介导法脂质体介导法脂质体介导法脂质体包埋脂质体包埋DNA，通过细胞膜进入细胞。，通过细胞膜进入细胞。何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件应用玻璃显微注射器，直接把外源应用玻璃显微注射器，直接把外源DNA注射到宿主注射到宿主细胞核里，使其整合
25、到染色体上。细胞核里，使其整合到染色体上。3. 3. 显微注射法显微注射法显微注射法显微注射法1）外源基因制备：线性化的质粒或目的片段）外源基因制备：线性化的质粒或目的片段2）收集受精卵：受孕后几小时内）收集受精卵：受孕后几小时内3）显微注射：将外源基因注入受精卵的）显微注射：将外源基因注入受精卵的雄原核雄原核4）受精卵移植）受精卵移植何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件二乙氨乙基（二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖为多聚阳离子试剂，能）
26、葡聚糖为多聚阳离子试剂，能促进哺乳动物细胞摄入外源促进哺乳动物细胞摄入外源DNA。4. DEAE-4. DEAE-葡萄糖转染法葡萄糖转染法葡萄糖转染法葡萄糖转染法葡聚糖葡聚糖葡聚糖葡聚糖何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件DEAE-dextran外源外源DNA细胞细胞混合混合DEAE-dextran对细胞有毒对细胞有毒，常采用低浓度长时间处理，常采用低浓度长时间处理吸吸附附到到细细胞胞表表面面后后被被细细胞胞吞吞入入，部部分分DNA可可以以进进入入到到细胞核里。细胞核里。4. DEAE-4. DEAE-葡萄糖转染法葡萄糖转染法葡萄
27、糖转染法葡萄糖转染法何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件三、转化率及影响因素三、转化率及影响因素转转化化率率（cfu / gDNA）：每每微微克克重重组组DNA转转化化后后，接接纳纳DNA分子的受体细胞的个数，即阳性克隆数。分子的受体细胞的个数，即阳性克隆数。（一）转化率的计算：（一）转化率的计算：转化率转化率 产生菌落的总数产生菌落的总数 / DNA的加入量的加入量 何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程
28、基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件三、转化率及影响因素三、转化率及影响因素例例：取取1l（0.1 ng/l）完完整整的的质质粒粒转转化化100l的的感感受受态态细细胞胞。向向转转化化反反应应液液中中加加入入900l培培养养液液，让让细细菌菌恢恢复复一一小小段段时时间间，取取100l铺铺板板。培培养养过过夜夜，产产生生1000个个菌菌落，转化率为多少？落，转化率为多少？转化率转化率1000 / 0.01 ng DNA = 108 cfu /g 何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件三、转化率及影响因素三、转化率及影响因素例例：某某一
29、一DNA重重组组实实验验的的重重组组率率为为20%，转转化化率率为为107 cfu / mg 天天然然载载体体，经经酶酶切切和和连连接接处处理理后后的的重重组组载载体体转转化化率率比比天天然然载载体体约约低低100倍倍，欲欲获获得得104个个重重组组克克隆隆，需要投入多少重组载体需要投入多少重组载体DNA进行重组实验？进行重组实验？104 107 cfu / mg 10-2 a 20% 重组载体重组载体 a = 0.5 mg何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件三、转化率及影响因素三、转化率及影响因素普通的亚克隆实验普通的亚克隆实验
30、：110 6 cfu/g DNA；更复杂的亚克隆更复杂的亚克隆：1107 cfu/g DNA，如有限量的，如有限量的DNA的转化，的转化，T-A克隆；克隆；构建文库构建文库： 1108 cfu/g DNA。何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件1）载体）载体DNA类型、大小；重组类型、大小；重组DNA浓度、纯度浓度、纯度2）受体细胞）受体细胞3）转化方法：同一转化方法）转化方法：同一转化方法技术参数技术参数影响转化率影响转化率（二）转化率的影响因素（二）转化率的影响因素三、转化率及影响因素三、转化率及影响因素何水林版基因工程基因的转
31、移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件一、载体表型选择法一、载体表型选择法二、根据插入基因的表型选择二、根据插入基因的表型选择三、三、DNADNA电泳检测法电泳检测法四、四、PCRPCR检测法检测法五、核酸杂交检测法五、核酸杂交检测法六、免疫化学检测法六、免疫化学检测法七、七、DNADNA序列分析序列分析第三节第三节 重组子的筛选与鉴定重组子的筛选与鉴定何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件1. 抗药性标记及其插入失活选择法抗药性标记及其插入失活选择法pBR322质粒上有两个抗性基因质粒上有两个
32、抗性基因: Tetr和和Ampr。 Tetr上有插入位点上有插入位点BamH I和和Sal I; Ampr上有插入位点上有插入位点Pst I。一、载体表型选择法一、载体表型选择法何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件2. 2. - -半乳糖苷酶显色反应选择法半乳糖苷酶显色反应选择法半乳糖苷酶显色反应选择法半乳糖苷酶显色反应选择法 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶 X-gal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛蓝氯靛蓝+深蓝色深蓝色何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件 -半乳糖苷酶使半乳
33、糖苷酶使X-gal分解成蓝色产物。分解成蓝色产物。何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件利用插入的外源基因的利用插入的外源基因的表达产物表达产物特性进行直接选择。特性进行直接选择。转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。突变型缺陷。二、根据插入基因的表型选择二、根据插入基因的表型选择1. 弥补缺陷弥补缺陷his-his+受体菌：受体菌：外源基因：外源基因：在不含组氨酸的在不含组氨酸的培养基中生长培养基中生长何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与
34、重组体的筛选和鉴定课件件例：抗生素抗性例：抗生素抗性抗性基因抗性基因载体载体外源外源DNA连接连接转化转化受体菌受体菌抗生素培养基平板抗生素培养基平板含抗生素抗性基因的含抗生素抗性基因的克隆才能生长克隆才能生长使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。2. 2. 增加新性状增加新性状增加新性状增加新性状何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。分子量大。1. 直接电泳检测法直接电泳检测法从转化后的菌体克隆中从转化后
35、的菌体克隆中分离质粒，电泳、比较分离质粒，电泳、比较其分子量。其分子量。三、三、 DNA电泳检测法电泳检测法 Marker载体载体重组重组克隆克隆何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件2. 酶切电泳筛选法酶切电泳筛选法根据外源根据外源DNA序列的限制性酶切图谱，选一两种内切酶序列的限制性酶切图谱，选一两种内切酶切割，电泳后比较电泳结果：切割，电泳后比较电泳结果：DNA带数和长度。带数和长度。一般用重组时的内切酶将外源一般用重组时的内切酶将外源DNA切出切出单单双双何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的
36、转移与重组体的筛选和鉴定课件件何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件四、四、PCR扩增检测法扩增检测法应用应用PCR反应扩增出预期反应扩增出预期DNA片断片断（1）从重组克隆中提取质粒（或）从重组克隆中提取质粒（或DNA）；）；（2）用外源）用外源DNA插入片断引物作插入片断引物作PCR；（3）凝胶电泳；）凝胶电泳；（4）是否有条带产生，条带大小是否正确。）是否有条带产生，条带大小是否正确。何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件五、核酸杂交检测法五、核酸杂交检测法 1.
37、Southern blotting从从宿宿主主细细胞胞中中提提取取DNA，用探针杂交。，用探针杂交。何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件2. Northern blotting2. Northern blotting主要检测插入片断主要检测插入片断是否被转录。是否被转录。从从宿宿主主细细胞胞中中提提取取RNA，用探针杂交。，用探针杂交。何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件3. Western blotting3. Western blotting在在蛋蛋白白质质凝凝胶
38、胶电电泳泳以以后后，用用转转膜膜和和免免疫疫的的方方法法检检测测胶胶上上的的蛋蛋白白质泳带。质泳带。（SDS-PAGE）点样电泳方向何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件膜膜胶胶蛋白蛋白 转膜转膜 杂交杂交待测蛋白待测蛋白硝酸纤硝酸纤维素膜维素膜一抗一抗 二抗二抗 检测检测3. Western blotting3. Western blotting何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件4. 4. 原位杂交筛选原位杂交筛选原位杂交筛选原位杂交筛选何水林版基因工程基因的转移与
39、重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件利利用用抗抗体体作作为为“探探针针”，检检测测产产生生外外源源DNA编编码码的的抗抗原原的的菌菌落落或或噬菌斑。噬菌斑。六、免疫化学检测法六、免疫化学检测法 对表达产物的检测。对表达产物的检测。蛋白蛋白蛋白蛋白“杂交杂交” 放射性抗体检测放射性抗体检测放射性抗体检测放射性抗体检测与菌落杂交相似与菌落杂交相似何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件DNA测测序序是是最最为为准准确确的的重重组组子子鉴鉴定定方方法法，可可以以鉴鉴定定重重组组克克隆隆序序列列是是否否准确
40、无误。准确无误。七、七、DNA序列分析序列分析 何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件（1 1）大）大）大）大肠肠杆菌的杆菌的杆菌的杆菌的 -D-D-葡萄糖葡萄糖葡萄糖葡萄糖醛醛酸糖苷酸糖苷酸糖苷酸糖苷酶酶酶酶 （ - -D-glucuronidaseD-glucuronidase，GUSGUS）；）；）；）； （2 2）细菌和萤火虫的）细菌和萤火虫的）细菌和萤火虫的）细菌和萤火虫的荧光素酶荧光素酶荧光素酶荧光素酶 （LuciferaseLuciferase）；）；）；）； （3 3）水母绿色荧光蛋白（）水母绿色荧光蛋白（）水母绿色
41、荧光蛋白（）水母绿色荧光蛋白（GFPGFP）基因）基因）基因）基因 （Green Fluorescent ProteinGreen Fluorescent Protein）。）。）。）。植物转化体报告基因（植物转化体报告基因（reporter gene)筛选筛选报报告告基基因因：基基因因载载体体上上引引入入的的一一些些可可证证明明载载体体已已经经进进入入宿宿主主细细胞胞，并并可可将将含含有有目目的的基基因因的的宿宿主主细细胞胞从从其其他他细细胞胞中中识识别区分甚至挑选出来的具有特殊标志意义的基因。别区分甚至挑选出来的具有特殊标志意义的基因。 何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水
42、林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件（1）获得目的基因获得目的基因；（2）目的基因与载体的酶切与连接；）目的基因与载体的酶切与连接； （3）将目的基因导入受体细胞；）将目的基因导入受体细胞；（4）转化受体细胞的大量繁殖；）转化受体细胞的大量繁殖；（5）目的基因的检测和表达。）目的基因的检测和表达。进行基因工程操作的一般步骤进行基因工程操作的一般步骤 ?何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件1、什什么么是是感感受受态态细细胞胞？简简述述CaCl2法法制制备备感感受受态态细细胞胞转化转化DNA的原理的原理 ？ 2、什什么么是是Ti质质粒粒？简简述述农农杆杆菌菌介介导导的的Ti质质粒粒遗遗传传转转化化方法。方法。 3、重组子筛选主要有哪些方法、重组子筛选主要有哪些方法 ？思思 考考 题题何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课何水林版基因工程基因的转移与重组体的筛选和鉴定课件件
