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1、实验室流式细胞仪单细胞分选技术1流式细胞仪分析技术应用流式流式细胞胞术(flow cytometry, FCM)是以流式是以流式细胞胞仪为检测手段的一手段的一项能快速、精确的能快速、精确的对单个个细胞理化特性胞理化特性进行多参数定量分析和分行多参数定量分析和分选的新技的新技术。 2流式细胞仪分析技术应用流式流式细胞胞术最大的特点是能在保持最大的特点是能在保持细胞及胞及细胞器或微粒的胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状构及功能不被破坏的状态下，下，通通过荧光探光探针的的协助，从分子水平上助，从分子水平上获取多种取多种信号信号对细胞胞进行定量分析或行定量分析或纯化分化分选。 细胞不被破坏，胞不被破坏
2、，测量快速、大量、准确、灵敏、定量量快速、大量、准确、灵敏、定量流式流式细胞胞术的特点的特点3流式细胞仪分析技术应用（1） 液流系液流系统（2） 光学系光学系统（3） 数据数据处理系理系统1.流式流式细胞胞仪的基本的基本结构：构：4流式细胞仪分析技术应用 通通过流式流式细胞胞仪进行行细胞分胞分选主要是在主要是在对具有某种特征的具有某种特征的细胞需胞需进一步培养和研究一步培养和研究时进行的。行的。细胞分胞分选原理原理5流式细胞仪分析技术应用细胞胞悬液形成液流柱液形成液流柱流流动室振室振动液流断裂成液滴液流断裂成液滴空白液滴空白液滴含含细胞的液滴胞的液滴弃去弃去偏偏转落入收集器落入收集器压电晶体晶
3、体产生生机械振机械振动不充不充电充充电（一）分（一）分选基本原理基本原理6流式细胞仪分析技术应用分分选速度：速度：单位位时间内分内分选的的细胞数量。与胞数量。与悬液液中中细胞的含量成正比。胞的含量成正比。分分选纯度：分度：分选出的目的出的目的细胞占所有收胞占所有收获细胞的胞的百分率。百分率。分分选收收获率：率：实际收收获的分的分选细胞与胞与设定通定通过测量点的分量点的分选细胞之胞之间的比率。与的比率。与纯度成反比。度成反比。分分选得率：从一群体得率：从一群体细胞胞悬液中分辨出目的液中分辨出目的细胞胞的的总量，再量，再经分分选后得到目的后得到目的细胞的胞的实际得率。得率。与分与分选速度成反比。速
4、度成反比。（二）分（二）分选的技的技术要求要求7流式细胞仪分析技术应用参数：参数：FS,SS,FL数据数据显示方式示方式 （单参数直方参数直方图 、双参数、双参数散点散点图 、二、二维等高等高图 、假三、假三维等高等高图 、三参数散点三参数散点图 ）设门分析技分析技术 第二第二节 数据的数据的显示与分析示与分析8流式细胞仪分析技术应用FS：反映：反映颗粒的大小粒的大小SS：反映：反映颗粒的内部粒的内部结构复构复杂程度程度FL：反映：反映颗粒被染上的粒被染上的荧光数量多少光数量多少一、一、 参数参数9流式细胞仪分析技术应用单参数直方参数直方图双参数直方双参数直方图:点点图二二维等高等高图假三假三
5、维等高等高图三参数直方三参数直方图多参数分析多参数分析直分析方直分析方图设门分析分析:REGION和和GATE设置置二、数据二、数据显示方式示方式10流式细胞仪分析技术应用由一由一维参数参数(散射光或散射光或荧光光)与与颗粒粒计数数(COUNT)构成，反映同构成，反映同样散射光或散射光或荧光光强度的度的颗粒数量的多少。粒数量的多少。（一）（一）单参数直方参数直方图11流式细胞仪分析技术应用单参数直方参数直方图细胞胞相相对数数量量12流式细胞仪分析技术应用双参数直方双参数直方图：纵轴和横和横轴分分别代表被代表被测量量细胞胞的两个的两个测量参数，根据量参数，根据这两个参数就可以确定两个参数就可以确
6、定细胞在胞在图上的表达位置。上的表达位置。双参数信号双参数信号通常采用通常采用对数信号，最常用的是点密数信号，最常用的是点密图，在，在图中，每个点代表一个中，每个点代表一个细胞，点胞，点图利用利用颗粒密度反映同粒密度反映同样散射光或散射光或荧光光强度的度的颗粒数量的粒数量的多少。多少。（二）双参数直方（二）双参数直方图13流式细胞仪分析技术应用1.双参数直方双参数直方图点点图绿色色荧光光强度度红色色荧光光强度度14流式细胞仪分析技术应用2. 二二维等高等高图由由类似地似地图上的等高上的等高线组成，其本成，其本质也是双参数也是双参数直方直方图。等高等高图上每一条上每一条连续曲曲线上具有相同的上具
7、有相同的细胞相胞相对或或绝对数，即数，即“等高等高”。曲曲线层次越高次越高(越里面的越里面的线) 所代表的所代表的细胞数愈多。胞数愈多。等高等高线越密集越密集则表示表示细胞数胞数变化率越大。化率越大。15流式细胞仪分析技术应用二二维等高等高图16流式细胞仪分析技术应用3. 假三假三维等高等高图17流式细胞仪分析技术应用（三）三参数直方（三）三参数直方图18流式细胞仪分析技术应用 多参数分析：当多参数分析：当细胞胞标记了多色了多色荧光，被激光，被激发光激光激发后，得到的后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要光信号和散射光信号可根据需要进行行组合分析。合分析。（四）流式（四）流式细胞胞仪的多参数
8、分析的多参数分析19流式细胞仪分析技术应用 Gate设置：指在某一置：指在某一张选定参数的直方定参数的直方图上，上，根据根据该图的的细胞群分布胞群分布选定其中想要分析的定其中想要分析的特定特定细胞群，并要求胞群，并要求该样本所有其他参数本所有其他参数组合的直方合的直方图只体只体现这群群细胞的分布情况。胞的分布情况。根据根据门的形状又分的形状又分为了了线性性门、矩形、矩形门、圆形形门、多、多边形形门、任意形状、任意形状门和十字和十字门。 三、三、设门分析技分析技术20流式细胞仪分析技术应用A 淋巴淋巴细胞胞B 单核核细胞胞C 中性粒中性粒细胞胞A、B、C均均为任意任意门21流式细胞仪分析技术应用
9、线性性门22流式细胞仪分析技术应用样本制本制备标记染色染色液相芯片技液相芯片技术 质量控制量控制 第四第四节 流式流式细胞胞仪免疫分析的技免疫分析的技术要求要求23流式细胞仪分析技术应用外周血淋巴外周血淋巴细胞胞样品的制品的制备分离分离单个核个核细胞胞培养培养细胞的胞的样品制品制备蛋白蛋白酶消化消化机械吹打机械吹打使使贴壁壁细胞脱落胞脱落洗洗涤尼尼龙网网过滤单细胞胞悬液液一、免疫一、免疫检测样品制品制备24流式细胞仪分析技术应用新新鲜实体体组织单细胞胞悬液的制液的制备机械法机械法酶处理法理法化学化学试剂处理法理法表面活性表面活性剂处理法理法单细胞胞悬液的保存液的保存深低温保存法（一年）深低温保
10、存法（一年）乙醇或甲醇保存法（乙醇或甲醇保存法（2周）周）甲甲醛或多聚甲或多聚甲醛保存法（保存法（2月）月）25流式细胞仪分析技术应用1 Phosphate Buffer Saline or HBSS (Ca/Mg+ free)1 mM EDTA25 mM HEPES pH 7.01 % Fetal Bovine Serum (Heat-inactivated)Sorting Buffer26流式细胞仪分析技术应用淋巴淋巴细胞： 1x HBSS(with Ca+/Mg+)含含1% FBS HBSS配方中的配方中的阳离子可可增加细胞的生存力。的生存力。由于这些细胞并非易于聚集，即便配方中沒有，即
11、便配方中沒有EDTA也不也不会造成造成问题。较黏着较黏着的的细胞细胞(sticky cells)(sticky cells)： 提高提高EDTA EDTA 到到 5mM 5mM 并并使用透析使用透析过过的的FBS (against FBS (against Ca+/Mg+ free PBS)Ca+/Mg+ free PBS)。某些。某些细胞细胞在活化在活化会比较会比较黏著而黏著而EDTAEDTA可抑制此作用可抑制此作用27流式细胞仪分析技术应用贴壁型型细胞株株(Adherent cells)： 以以Trypsin处理后去去准备单细胞悬液时，待，待细胞变圆(切记不可不可过度作用作用)，便以，便以
12、5 ml 含含5%血清血清培养液收取收取细胞，并均匀地打散地打散细胞悬液。离心后，用，用sorting buffer调整细胞浓度。如果需要的。如果需要的话，可以提高可以提高EDTA的的浓度(至至5mM)以以避免細胞重新黏聚。避免細胞重新黏聚。含有高比例死細胞的含有高比例死細胞的样本样本： Sorting bufferSorting buffer加加5mM MgCl25mM MgCl2以及以及2550 g/mL 2550 g/mL DNAase I (Sigma D-4513)DNAase I (Sigma D-4513)或是或是Sorting bufferSorting buffer加加0.8
13、3mM 0.83mM MgCl2MgCl2以及以及20 U DNAase II (Sigma D-4138)20 U DNAase II (Sigma D-4138)。这些这些配方可配方可減少因死減少因死细胞释放细胞释放出來的出來的DNADNA所造成的所造成的细胞细胞黏聚黏聚现象现象。28流式细胞仪分析技术应用尽量选择荧光光谱重叠小的荧光素尽量选择荧光光谱重叠小的荧光素PE-Cy5/APC & PerCP-Cy5.5/APCPE-Cy5/APC & PerCP-Cy5.5/APC为弱表达的抗原选择较亮的荧光素为弱表达的抗原选择较亮的荧光素CD62L on CD8+TCD62L on CD8+T
14、防止耦联染料降解（光照防止耦联染料降解（光照/ /固定固定/ /升温等）造成的干扰升温等）造成的干扰APC-Cy7/PE-Cy7APC-Cy7/PE-Cy7二、常用的二、常用的荧光染料与光染料与标记染色染色29流式细胞仪分析技术应用尽量选择荧光光谱重叠小的荧光素尽量选择荧光光谱重叠小的荧光素Minimize the potential for spectral overlap Spillover estimates available in the spectra viewer2 230流式细胞仪分析技术应用FITCTexas redPE.PC.APCPEcy5FL1FL2FL3FL4激光激光
15、细胞胞悬液液异硫异硫氰酸酸荧光素光素得州得州红能量能量传递复合染料复合染料藻胆蛋白藻胆蛋白类（一）几种常（一）几种常见的的荧光染料光染料31流式细胞仪分析技术应用名称名称染料染料激发激发波长波长荧光颜荧光颜色色溶解性溶解性对对PHPH敏感敏感性性特点特点异硫氰酸荧异硫氰酸荧光素光素FITCFITC488488绿绿 525525易易敏感敏感易溶于水，与抗体结易溶于水，与抗体结合不影响特异性合不影响特异性得州红得州红Texas Texas redred568568红红 615615不易不易不敏感不敏感稳定，偶联后量子产稳定，偶联后量子产额低额低藻红蛋白藻红蛋白PEPE488488橙橙575575易
16、易不敏感不敏感具较多发光基团，消具较多发光基团，消光系数和量子产额高光系数和量子产额高藻青蛋白藻青蛋白PCPC488488别藻青蛋白别藻青蛋白APCAPC633633红红670670能量传递复能量传递复合染料合染料PEcy5PEcy5488488红红670670易易不敏感不敏感减少交叉，成本高减少交叉，成本高常用的几常用的几类荧光染料光染料32流式细胞仪分析技术应用用化学法将两种不同激用化学法将两种不同激发波波长的染料的染料结合在合在一起，在一起，在488nm激激发光照射下，通光照射下，通过一个一个荧光染光染料被激料被激发后后产生的生的发射波射波长再激再激发另一另一荧光染料光染料产生生荧光信号
17、，从而光信号，从而检测到到该特定特定荧光信号。光信号。能量能量传递复合染料复合染料33流式细胞仪分析技术应用PECY5CY5CY5488nm575nm670nm红色荧光花青苷花青苷5藻藻红蛋白蛋白能量能量传递复合染料机制复合染料机制34流式细胞仪分析技术应用多色分析时组合抗体的使用原则在免疫表型分析中，常常把多种荧光素标记抗体同时组合在一起进行多色分析，但并非多种抗体均可以自由组合在一起使用。在多数荧光素标记抗体组合应用之前，必须将每种抗体单独应用和组合应用的结果进行比较，一旦这种组合显示出与单独应用时无差别的结果时，这种组合才可以应用于多色免疫表型分析。在单独或组合应用时，应注意抗体的稀释度
18、。如3种抗体单独使用时的最佳用量为20l，而3种抗体组合应用时如果各加20l，总体积会增至60l，因此每种抗体的浓度被稀释成原来的1/3，不再是最佳用量。因此组合抗体应用浓度应比单独抗体使用浓度高。一种新的抗体组合设计后必须进行这种比对试验，这种组合一旦应用与临床，不可随便改换抗体组合或抗体的克隆。一般情况下多色分析荧光素标记抗体组合最好采用同一种工艺制作的为佳。 35流式细胞仪分析技术应用血液系统单细胞分选血液系统单细胞分选标准化的建立标准化的建立36流式细胞仪分析技术应用背景干细胞的研究意义现在已经越来越重要。白血病干细胞的研究一直走在整个学科的前沿，引领学科的发展。越来越多的证据显示干细
19、胞自我更新及分化的分子机制都是在单细胞水平上发生的，单细胞技术的发展为干细胞的研究奠定了重要基础。现有的单细胞技术主要包括单细胞分选、培养、单细胞PCR、单细胞多色Fish、单细胞基因组及表观遗传学分析、免疫缺陷鼠移植鉴定在内的单细胞技术。37流式细胞仪分析技术应用拟解决的关键科学问题拟解决的关键科学问题所有的单细胞实验技术中，干细胞的单细胞分选是最为关键，也是最为基础的一个环节。影响单细胞分选效果的因素有很多。（比如目的分离细胞群的不同，分选的仪器选择，抗体标记的染料的选择，不同荧光颜色之间的补偿计算，样品的准备，收集工具的不同等。)单细胞分选的标准化建立非常重要，尤其我重点实验室研究工作主
20、要以血液系统为研究对象，更加有意义。38流式细胞仪分析技术应用研究目标研究目标 通过对机器参数的调整，激光功率的确认，补偿的量化处理，接收工具的模板化和抗体组合的优化建立一套针对白血病干细胞和正常造血干细胞的分选标准。39流式细胞仪分析技术应用研究方法研究方法荧光抗体的选择荧光抗体的选择分选仪器的比较分选仪器的比较补偿计算的量化精确调整补偿计算的量化精确调整接收工具的模板标准化接收工具的模板标准化单细胞的培养鉴定单细胞的培养鉴定40流式细胞仪分析技术应用荧光抗体的选择荧光抗体的选择种属来源：人正常造血干细胞分选标记：Lin-CD34+CD38-CD45RA-CD90+CD49f+Rholow白
21、血病干细胞的分选标记：CD34+CD38-CD71-CD90-CD117-CD123+CD96+CD47+种属来源：鼠正常造血干细胞分选标记: Lin-Sca-1+c-Kit+CD34-Flk2- 或者 Lin-Sca-1+c-Kit+CD150+CD48-MLL-AF9 AML白血病干细胞的分选标记: Lin-Sca-1-c-Kit+ CD16/32+CD34+ 或 c-Kit+Gr-1-BCR-ABL CML 白血病干细胞的分选标记: Lin-Sca-1+c-Kit+41流式细胞仪分析技术应用分选仪器的比较分选仪器的比较石英杯激发原理：激光检测是在石英杯中进行的优点：比色皿提供层流和增强的
22、样品聚焦，对于敏感性来说，石英杯激发系统明显占优。缺点：石英杯长度有限，而且激光光学装置需要足够空间避免不同通道间的串扰，细胞需要通过不同的介质，且速度不一样，高速下细胞密度变大，与流动池和喷嘴接触面变大，不能保证在液滴延迟时间内到。空气激发原理：激光检测是在细胞通过喷嘴后的液滴中。优点：硬件设备简单，检测点与收集装置间距离较短，检测样品的可用的激光数多，液流更稳定，能在高速情况下准确在液滴延迟时间内到达。保持细胞清洁的更好，并且能提供额外的激光束。缺点：对于敏感性来说，空气激发不那么敏感。42流式细胞仪分析技术应用补偿计算的量化精确调整补偿计算的量化精确调整 购买补偿微球（comp-bead
23、s），标记实验中所需要涉及的抗体，孵育后作为单阳补偿管，进行上样通过圈门调整微球群中位数，修正所有补偿。建立良好的补偿矩阵，这样的补偿计算更标准。43流式细胞仪分析技术应用接收工具的模板标准化接收工具的模板标准化 因为实验的需求不同，所以单细胞分选到不同接收器中，这其中包括24孔板，96孔板，72孔板乃至384孔板等，在每个机器上调整相应模板，使其固定为标准化的模板，每次使用直接调用，不需要重复进行调整。这将极大提高分选效率和精确性。44流式细胞仪分析技术应用单细胞的培养鉴定单细胞的培养鉴定 将分好的单细胞至于相应的培养基中进行14天培养，培养后对每板细胞存活比例进行统计，然后对存活的各孔细胞
24、向各系进行分化趋向的统计。1 细胞细胞 / 孔孔IMDM + 10%FBS + SCF 100ng/mL + TPO 50ng/mL + Flt3L 100ng/mL14天天检测nmEM四系分化：人（CD19，CD33），鼠（Gr-1，Mac-1，Ter119，CD41）45流式细胞仪分析技术应用技术路线46流式细胞仪分析技术应用47流式细胞仪分析技术应用CD34-PE CD38-FITCCD34+ CD38- 细胞 1/ PE- Isotype; FITC-Isotype : 设置阴性对照门, 去除抗体非特异性吸附的影响2/ CD34-PE ; FITC-Isotype : 单阳管对照, 设
25、置补偿3/CD38-FITC ; PE- Isotype : 单阳管对照, 设置补偿4/ CD34-PE ; CD38-FITC : 检测分选管48流式细胞仪分析技术应用适当的制适当的制备方式方式处理理红细胞胞实体体组织来源来源标本用机械法本用机械法温度温度2537，pH7.07.2四、流式四、流式细胞免疫学技胞免疫学技术的的质量控制量控制（一）（一）单细胞胞悬液制液制备的的质控控49流式细胞仪分析技术应用温度温度pH染料染料浓度度固定固定剂（二）免疫（二）免疫荧光染色的光染色的质控控50流式细胞仪分析技术应用培养基及血清的培养基及血清的选择温度温度离心速度离心速度无菌操作无菌操作（三）分（三）分选后后细胞的培养胞的培养51流式细胞仪分析技术应用
