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1、垂直电泳分离同工酶垂直电泳分离同工酶（活性染色鉴定法）（活性染色鉴定法）实验目的实验目的：理解同工酶的概念及遗传学意义理解同工酶的概念及遗传学意义学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳操作技术掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳操作技术掌握乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色掌握乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色1. 同工酶同工酶是指能够催化相同的化学反应，但酶是指能够催化相同的化学反应，但酶是指能够催化相同的化学反应，但酶是指能够催化相同的化学反应，但酶分子结构、理化特性乃至免疫学性质不同的一分子结构、理化特性乃至免疫学性质不同的一分子结构、理化特性乃至免疫学性质不同的一分子结构、理
2、化特性乃至免疫学性质不同的一组酶。组酶。组酶。组酶。 它们是由遗传体系决定的在不同组织中它们是由遗传体系决定的在不同组织中它们是由遗传体系决定的在不同组织中它们是由遗传体系决定的在不同组织中表达的蛋白质作用相同表达的蛋白质作用相同表达的蛋白质作用相同表达的蛋白质作用相同, ,但分子结构、理化特性但分子结构、理化特性但分子结构、理化特性但分子结构、理化特性等不同等不同等不同等不同. .2.由于同工酶存在蛋白结构及理化性质的不同，由于同工酶存在蛋白结构及理化性质的不同，由于同工酶存在蛋白结构及理化性质的不同，由于同工酶存在蛋白结构及理化性质的不同，在电泳时条带略有差异在电泳时条带略有差异在电泳时条
3、带略有差异在电泳时条带略有差异, ,因此可用电泳将它们分因此可用电泳将它们分因此可用电泳将它们分因此可用电泳将它们分离开来。离开来。离开来。离开来。3. 本实验做的是乳酸脱氢酶的分离鉴定本实验做的是乳酸脱氢酶的分离鉴定本实验做的是乳酸脱氢酶的分离鉴定本实验做的是乳酸脱氢酶的分离鉴定 乳酸脱氢酶用电泳方法将LDH同工酶分离，分析其酶谱，发现脊椎动物各组织中有五条酶带。每条酶带的酶蛋白都是由四条肽链组成的四聚体，LDH有两类肽链，A（M）或B（H），各有不同 同工酶的免疫性质，按排列组合可形成符合于电泳酶带数的五种同工酶。LDH1及LDH5分别由纯粹的4条B链（B4）和4条A链（A4）形成，称为纯
4、聚体；而LDH2、LDH3和LDH4都是由两类肽链杂交而成的，分别可写成AB3、A2B2、A3B，称为杂交体聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理 净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳是对净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳是对天然状态生物大分子进行的电泳，利天然状态生物大分子进行的电泳，利用蛋白质分子中所带净电荷、分子质用蛋白质分子中所带净电荷、分子质量、形状的差异，而在电场中泳动的量、形状的差异，而在电场中泳动的速度和方向不同，达到分离的目的。速度和方向不同，达到分离的目的。实验器材实验器材：夹心式垂直板电泳槽，梳子，直流稳夹心式垂直板电泳槽，梳子，直流稳压电源（电压压电源（电压30
5、0-600V，电流电流50-50-100mA100mA），移液枪（各种量程），烧杯），移液枪（各种量程），烧杯（100mL100mL），培养皿），培养皿, ,实验流程试剂的配制仪器的准备动物组织的样品的获取分离胶（30分钟）浓缩胶（30分钟）电泳（2-3小时）染色（30分钟）观察结果一一、试剂：试剂：1.1.凝胶储备液：凝胶储备液：储备液：储备液： pH8.9 TrisHCl pH8.9 TrisHCl缓冲液：缓冲液：1 M HCl 48ml1 M HCl 48ml，36.6g Tris36.6g Tris，加双蒸水到，加双蒸水到 80ml 80ml，调节，调节pHpH到到8.98.9定容到定
6、容到100ml100ml。储备液储备液 ： pH6.7 TrisHCl pH6.7 TrisHCl缓冲液：缓冲液：1 M HCl 48ml1 M HCl 48ml，5.98g Tris5.98g Tris，加双蒸水到，加双蒸水到80ml80ml，调节，调节pHpH到到6.76.7定容到定容到100ml100ml。储备液：储备液： 分离胶储备液（分离胶储备液（30% Acr/Bis30% Acr/Bis）：）：30g Acr30g Acr，0.8g Bis0.8g Bis，用双蒸水定容到，用双蒸水定容到100ml100ml，备用，备用，44存放可以保存存放可以保存1 1个月。个月。储备液：储备液
7、： 浓缩胶储备液：浓缩胶储备液：10g Acr10g Acr，2.5g Bis2.5g Bis，用双蒸水定容到，用双蒸水定容到100ml100ml，备用，备用，44可以保存可以保存1 1个月。个月。储备液：储备液： 10% Aps 10% Aps（W/VW/V）：）：1g1g定容到定容到10ml10ml，-20-20保存。保存。储备液：储备液： 40% 40%蔗糖：蔗糖：40g40g蔗糖溶解到蔗糖溶解到60ml60ml双蒸水中。双蒸水中。TEMEDTEMED2.2.电泳缓冲液：电泳缓冲液：Tris6.0gTris6.0g，28.8gGly 28.8gGly 加双蒸水到加双蒸水到900ml900
8、ml调节调节pHpH到到8.38.3，定容到，定容到1000ml1000ml，使用时稀释，使用时稀释1010倍。倍。样品制备样品制备取材：大黄鱼若干条，解剖取取材：大黄鱼若干条，解剖取1.肠、肠、2.眼睛、眼睛、3.鳃、鳃、4.肌肉、肌肉、5.脾、脾、6.鳍、鳍、7.肝、肝、8.心脏放入冰箱保存。心脏放入冰箱保存。提取酶：取不同组织块，加入提取缓冲液提取酶：取不同组织块，加入提取缓冲液Tris-Hcl(pH=7.0) 此溶液需此溶液需预冷，组织重量（预冷，组织重量（g）与缓冲液体积（）与缓冲液体积（mL）之）之比为：比为：5,用研钵研磨充分。浆液用研钵研磨充分。浆液离心约分钟，离心约分钟，转分
9、钟。转分钟。取上清液至新管，吸取其中取上清液至新管，吸取其中150ul样品，加样品，加ul 甘油甘油和和ul溴酚蓝，混匀之后即可点样。溴酚蓝，混匀之后即可点样。分离胶的制备分离胶的制备 将需要的凝胶储备液从冰箱中取出，放置备将需要的凝胶储备液从冰箱中取出，放置备用。取一用。取一100ml烧杯，按表比例混匀之后使烧杯，按表比例混匀之后使用。用。储备液储备液A储备液储备液C储备液储备液E储备液储备液双蒸水双蒸水TEMED总体积总体积用量用量（ml）2.53.750.113.7510ul20配方表配方表浓缩胶的制备浓缩胶的制备TEMED最后一个加入，轻轻混匀。移液枪吸取加入约最后一个加入，轻轻混匀。
10、移液枪吸取加入约2.0CM左右高度左右高度的浓缩胶液，然后插入样品梳，注意不要产生气泡。当浓缩胶上出现水的浓缩胶液，然后插入样品梳，注意不要产生气泡。当浓缩胶上出现水层后表明聚合完成。再放置层后表明聚合完成。再放置3060min后可以使用。后可以使用。加入少量电泳缓冲液，小心拔出样品梳（两端同时向外拔），再注满缓加入少量电泳缓冲液，小心拔出样品梳（两端同时向外拔），再注满缓冲液备用。冲液备用。储备液储备液B储备储备液液D储备储备液液E储备液储备液F储备液储备液双蒸水双蒸水TEMED总体积总体积用量用量（ml）1.250.860ul 52.916ul10配方表配方表点样点样加样加样样品迁样品迁移
11、方向移方向电电 泳泳电压和电流：浓缩胶电压电压和电流：浓缩胶电压100v，分离胶电压，分离胶电压180V. 电电流流流流1830mA溴酚蓝跑至分离胶末端，电泳结束。大约溴酚蓝跑至分离胶末端，电泳结束。大约2-3个小时个小时夹在两块玻璃夹在两块玻璃板之间的凝胶板之间的凝胶 电泳电泳缓冲液缓冲液 电泳电泳缓冲液缓冲液 加在槽中的样品加在槽中的样品分子量小分子量小分子量大分子量大电源电源电泳示意图电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。混合样品混合样品带
12、孔胶带孔胶 按分子按分子大小分离大小分离电泳方向电泳方向 电泳电泳 小分子小分子大分子大分子乳酸脱氢酶染色剂的配制乳酸脱氢酶染色剂的配制乳酸钠乳酸钠 0.5mlNAD 25mgPMS 2mgNBT 15mg0. 2M TrisHcl溶液（溶液（PH8.0）10ml去离子水定容至去离子水定容至50ml染色与观察染色与观察将胶从中间切成将胶从中间切成2块，各自切去一个小块，各自切去一个小角（作为标记），去离子水轻轻从玻角（作为标记），去离子水轻轻从玻璃板上吹下，璃板上吹下，置于大培养皿中，去离子水浸洗之后置于大培养皿中，去离子水浸洗之后倒入染倒入染染色剂浸没，避光于染色剂浸没，避光于37度摇床中染色度摇床中染色30min。观察拍照观察拍照思考题：思考题：根据实验过程的体会，总结如何做好根据实验过程的体会，总结如何做好聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳？哪些是聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳？哪些是关键步骤？哪些过程中是关键步骤？哪些过程中是为什么要在样品中加入少许溴酚蓝和为什么要在样品中加入少许溴酚蓝和甘油溶液？分别有何用途？甘油溶液？分别有何用途？谢谢
