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1、第五章第五章食品毒物的一般食品毒物的一般毒性作用毒性作用2012.09第四章第四章 毒理作用机制毒理作用机制第一节第一节 概述概述 第二节第二节 食品毒物的急性毒性食品毒物的急性毒性第三节第三节 蓄积毒性作用及其评价蓄积毒性作用及其评价 第四节第四节 亚慢性和慢性毒性亚慢性和慢性毒性第一节第一节 概述概述 一、一般毒性研究的特点和发展趋势一、一般毒性研究的特点和发展趋势 1.1.最终目标：最终目标：证明食品中某种化学、生物或物理因素的毒性 和危险性。 2.2.主要手段：主要手段： 体内试验（in vivo test）在实验动物模型上进行 体外试验（in vitro test）在微生物、人工培养
2、的 细胞或组织或器官上进行。 3.3.发展趋势：发展趋势： 动物用量少、动物痛苦小、开发体外替代试验； 在传统长期毒性试验中附加额外或特殊毒性观测内容 。二、一般毒性的概念和分类二、一般毒性的概念和分类一般毒性通常也称基础毒性 包括：急性毒性 蓄积毒性 亚急性或亚慢性毒性 慢性毒性 特殊毒性主要是指致癌作用、致突变作用、致畸和遗传毒性等 三、一般毒性试验在三、一般毒性试验在食品安全性评价程序食品安全性评价程序中的地位中的地位 预备/准备阶段：了解食品毒物的理化性质、收集毒性研究资料 第一阶段：急性毒性试验(致死和非致死) 第二阶段：亚急性或亚慢性毒性试验（1个月喂养试验）、代谢试验、蓄积毒性、
3、遗传毒性试验、致畸试验 第三阶段：亚慢性毒性试验（36个月喂养试验）、繁殖试验、代谢试验、蓄积毒性第四阶段：慢性毒性试验（6个月至终生试验）、 致癌试验 第二节第二节 食品毒物的食品毒物的急性毒性急性毒性一、急性毒性和急性毒性试验的目的二、急性毒性试验三、急性毒性评价一、急性毒性和急性毒性试验的目的一、急性毒性和急性毒性试验的目的 1.1.急性毒性急性毒性(acute toxicity)(acute toxicity)是指机体是指机体( (人或试验人或试验动物动物) )一次接触或一次接触或2424小时内多次接触小时内多次接触化学物后在化学物后在短期短期( (最长到最长到1414天天) )内所发
4、生的内所发生的毒性效应毒性效应。 2. 目的：目的：确定急性毒性评价参数；确定急性毒性评价参数； 探求化学毒物急性毒性的剂量探求化学毒物急性毒性的剂量反应反应 关系与中毒特征；关系与中毒特征； 为亚慢性、慢性毒性作用试验的染毒为亚慢性、慢性毒性作用试验的染毒 剂量设计提供参考依据；剂量设计提供参考依据； 为毒理学机制研究提供线索。为毒理学机制研究提供线索。 急性毒性参数英文缩写试验终止效应 毒性 上限 参数半数致死剂量或浓度LD50/LC50死亡最大致死剂量或浓度LD100/LC100死亡最小致死剂量或浓度MLD/LD01死亡可代替LD50的参数半数效应剂量或浓度ED50/EC50非死亡最大耐
5、受剂量或浓度MTD/LD0不完全以死亡为终点急性毒性估计值急性毒性估计值ATE动物用量少，不完全以死亡为终点毒性 下限 参数观察到有害作用的最低剂量LOAEL非死亡未观察到有害作用的剂量NOAEL非死亡3. 3. 急性毒性试验常用的毒性参数急性毒性试验常用的毒性参数二、急性毒性试验二、急性毒性试验(一)实验动物原则：急性毒性试验要求选择对化学毒物的代谢和毒效应表现与人的反应尽可能一致的试验动物。动物易于获得品系纯化价格较低和易于饲养等条件。 1试验动物的种属和品系最好用两种种属的动物啮齿类:小鼠、大鼠、豚鼠或家兔非啮齿类：狗或猴。急性皮肤毒性试验可选用成年大鼠、豚鼠或家兔，优先考虑白色家兔。而
6、急性吸入毒性试验和经口急性毒性试验则优先考虑大鼠。 试验动物的年龄和体重：通常要求选择刚成年动物进行试验，而且须是未曾交配和受孕的动物，使实验结果具有代表性和可重复性。例如：大鼠180240g、小鼠1825g、家兔22.5kg、豚鼠200250g、狗1015kg。同一批试验动物体重变异范围不应超过该批动物平均体重的20。 3.3.试验动物的性别：试验动物的性别：一般要求为雌雄各半。如果着重观察受试物对雄性动物生殖功能的影响应选用雄性动物如果试验是为致畸试验则选雌性动物4.4.动物数量与随机分组：动物数量与随机分组：小鼠：每组不少于10只大鼠：每组68只家兔、狗等大动物：每组46只分组原则随机化
7、原则5 5. .禁食：禁食：经消化道染毒时，要求试验前对动物禁食大鼠、大型动物隔夜禁食；小鼠禁食4h染毒后继续禁食24h，但在禁食时要保障饮水。6.6.实验动物的预检：实验动物的预检：选择健康动物12周的检疫期动物购来后适应饲料和环境3d5d （二）试验动物的饲养环境恒定的温度：223湿度：3070%照度：昼夜各半饲料合格、饮水合格、垫料合格（三）染毒途径的选择（三）染毒途径的选择 模拟人在生活和生产环境中实际接触 受试物的途径和方式；有利于不同化学物之 间急性毒性大小的比较；受试物的性质和用 途；各种受试物毒性评价程序的要求等。 最常用的染毒途径为经口、经呼吸道、经皮及注射途径。1. 经口(
8、胃肠道)接触 : 灌胃：小鼠0.20. 7ml/20g 大鼠14ml/200g，不超过5ml/只 家兔不超过10ml/2kg 狗不超过50ml/10kg 混入饲料或饮水： 吞咽胶囊： 2.经呼吸道接触 : 静式吸入 动式吸入 3.经皮肤接触 :4.注射途径接触: 染毒途径染毒途径 对各个毒理学试验应该用同一种、同一批号受试物对各个毒理学试验应该用同一种、同一批号受试物 受试物成分和配方必须固定；受试物成分和配方必须固定； 如是异构体混合物，异构体比例必须固定；如是异构体混合物，异构体比例必须固定； 活性成分的百分含量和可检测的杂质的浓度固定；活性成分的百分含量和可检测的杂质的浓度固定； 受试物
9、在贮存期内稳定性和在饲料中的稳定性必须进行研究并受试物在贮存期内稳定性和在饲料中的稳定性必须进行研究并 报告；报告； 受试物应一次备齐全部实验的用量。受试物应一次备齐全部实验的用量。（四）受试样品（四）受试样品 （五）染毒剂量与分组（五）染毒剂量与分组 1查阅文献查阅文献了解化学毒物的结构式、分子量、常温常压下的状态、熔 点、沸点、密度、挥发度、蒸气压、水溶性和脂溶性等理 化特性，生产批号及纯度，杂质成分与含量等。 确定使用哪一种计算方法求LD50，然后再设计剂量分组。 LD50的计算方法常用寇氏法、概率单位法、霍思法等。 找出与受试物结构与理化性质近似的化学物的毒性资料， 并以文献资料中相同
10、的动物种系和相同接触途径所测得的 LD50(LC50)值作为受试物的预期毒性中值。 （五）染毒剂量与分组2预试验预试验 设定以此预期值作为待测化学物的中间剂量组， 并在该剂量的上下各设计l一2个剂量组作为预试验剂量。 根据确定的剂量组进行染毒。 根据预试验的死亡资料确定组距。 可根据以下公式计算出剂量分组： i=(lgLD90-lgLD10)(n-1) 或：i=(lgLD100-lgLD0)(n-1) 式中i为组距(相邻的两个剂量组对数剂量之差)； n为设计的剂量组数。（五）染毒剂量与分组:3正式试验正式试验 一般来说、根据试验设计所选用的LD50计算方法来确定 组数。例如概率单位法、寇氏法一
11、般设510个剂量组； 霍恩法固定设4个剂量组。求得i值后以最低剂量组(LD0 或LD10)的对数剂量加上一个i值，即是第二个剂量组的对 数剂量，依此类推直至最高剂量组，查各自的反对数即得 出各组剂量的真实值。 1 2 3 4 5 6 LgLD0 LgLD0+i LgLD0+2i LgLD0+3i LgLD0+4i （六）试验周期与毒效应观察（六）试验周期与毒效应观察1.1.中毒症状中毒症状（六）试验周期与毒效应观察 2.2.体重变化体重变化 体重可以反映动物中毒后的整体变化。 体重改变的原因很多，因此对存活动物尤 其是对低于LD50剂量组的存活动物，应在 观察期14天内称量其体重的变化，以便了
12、 解受试物引起毒效应的持续时间。 （六）试验周期与毒效应观察:3.3.病理检查及其他指标病理检查及其他指标对死亡的动物均应及时进行大体解剖和病理组织学检查；对存活动物在观察期结束时进行大体病理检查，必要时做组织病理学检查；其他指标：体温、心电图、脑电图或进行某些生化指标测定等。（六）试验周期与毒效应观察（六）试验周期与毒效应观察4.4.死亡和死亡时间死亡和死亡时间 重点观察和记录每只动物死亡的时间，特别是最早出现死亡的时间以及各个剂量组动物的死亡数。 分析中毒死亡时间的规律具有一定意义，可为深入研究化学物的毒作用机制提供参考。 1.1.毒理学试验设计的统计学要求毒理学试验设计的统计学要求: :
13、随机、重复、对照原则随机、重复、对照原则 2.2.对常规毒理学试验资料的统计学方法对常规毒理学试验资料的统计学方法 计量资料：计量资料：一般用一般用t t检验检验 记数资料：记数资料：卡方检验卡方检验（七）毒理学试验的统计学（七）毒理学试验的统计学（八）实验结果的判断（八）实验结果的判断1.1.处理组与对照组比较差别有无显著性处理组与对照组比较差别有无显著性; ;2.2.有无剂量有无剂量- -反应关系反应关系; ;3.3.是否伴有其他相关参数的改变是否伴有其他相关参数的改变; ;4.4.是否在是否在“正常正常”值范围值范围. .( (九九) )经典急性毒性试验的局限性经典急性毒性试验的局限性1
14、.消耗的动物量大2.获得的信息有限3.测得的LD50仅仅是一个近似值4.在安全性评价中仅评价动物死亡和简单的症状观察是不够的，更需要的是生理学、血液学及其它化验检查所提供的深入细致的毒性信息。三、急性毒性评价三、急性毒性评价外源化学物急性毒性分级（WHO）毒性分级大鼠一次经口LD50 (mg/kg)6只大鼠吸入4小时，死亡24只的浓度(ppm)兔经皮LD50(mg/kg)对人可能致死的估计量g/kg总量(g/60kg)剧毒1105151000我国食品毒理急性毒性分级法(1994)急性毒性分级大鼠经口LD50(mg/kg)大致相当于70kg人的致死量6级(极毒)1稍尝,150001050克一、基
15、本概念二、蓄积毒性试验方法及其评价 第三节第三节 蓄积毒性蓄积毒性 当化学毒物反复多次进入机体，而且吸收速度超过代谢转化与排泄的速度时，化学毒物就有可能在机体内逐渐增加并贮留，这种现象称为化学毒物的蓄积作用(accumulation)。 大多数蓄积作用会产生蓄积毒性。蓄积作用实际上有二个含义： 物质蓄积(material accumulation) 功能蓄积(functional accumulation) 一、基本概念 二、蓄积毒性试验方法及其评价二、蓄积毒性试验方法及其评价化学毒物的蓄积作用是发生慢性中毒的物质基础蓄积毒性试验目的：求出蓄积系数K，了解化学毒物蓄积毒性的强弱。(一)蓄积系数
16、法 (accumulation coefficient) 多次染毒使半数动物出现效应(或死亡)的累积剂量ED50(n)与一次染毒使半数动物出现相同效应(或死亡)的剂量ED50(1)的比值，即：KED50(n)/ED50(1)KLD50(n)/LD50(1) 根据染毒剂量的不同分为： 固定剂量法； 定期递增剂量法； 20d试验法。 1 1固定剂量法：固定剂量法：先求出LD50 均分实验动物两组（染毒组和对照组）雌雄各半。每日以固定剂量（120l5LD50）、定时和相同途径染毒观察记录每组动物死亡数。 当试验组累积发生一半动物死亡即可终止试验。此时，计算LD50(n)，依公式计算K值，进行评价。
17、但若接触剂量已累积达到5个LD50剂量，也可终止试验。 2 2定期递增剂量法：定期递增剂量法： 在试验期间，当动物累积死亡一半时即可终止试验，在试验期间，当动物累积死亡一半时即可终止试验，在试验期间，当动物累积死亡一半时即可终止试验，在试验期间，当动物累积死亡一半时即可终止试验，计算计算计算计算K K K K值进行评价。一般来说，在试验第值进行评价。一般来说，在试验第值进行评价。一般来说，在试验第值进行评价。一般来说，在试验第2l2l2l2l天也可结束试天也可结束试天也可结束试天也可结束试验，其累积剂量已达验，其累积剂量已达验，其累积剂量已达验，其累积剂量已达5.26LD5.26LD5.26L
18、D5.26LD50505050，即，即，即，即K K K K5 5 5 5。3 320d20d试验法：试验法： 将动物随机分为阴性对照组和1/20 LD50、l/10 LD50、1/5 LD5 和1/2 LD50四个剂量组，每组10只，雌雄各半。每日染毒一次， 连续染毒20天。 结果评价： 各剂量组均无死亡，即为蓄积性不明显； 如仅1/2LD50剂量组有死亡，则为弱蓄积性； 如1/20LD50剂量组无死亡，其他各组间死亡数有剂量反应关 系时，则为中等蓄积性； 如1/20LD50剂量组有死亡，且有剂量反应关系，则为强蓄积性。 (二)生物半衰期法：(biological half-time，t1/
19、2) t1/2是指进入机体的外来化学物质被消除一半所需要的时间。t1/2 短，从机体消除快。 一般，在等间距、等剂量染毒的条件下，化学物在体内经56个t1/2即可达到蓄积极限，此时理论蓄积量为极限值的96.998.4。此后继续染毒蓄积量也基本上不再增加。 蓄积极限量每日吸收量t1/21.44（三）蓄积率测定法 分蓄积组和对照组，每组6070只。蓄积组动物每次按一定剂量(低于最小致死量)按同一给毒途径预先给受试物，经过一定时间之后，按常规方法测LD50，计算: 蓄积率=（对照组LD50 - 蓄积组LD50）/ 蓄积组预给受试物的总剂量 100% 在相同时间及剂量条件下，蓄积率越大则表示该物质在体
20、内的蓄积作用越强 ，反之则越弱。 一 亚慢性毒性作用： 亚慢性毒性的概念 亚慢性毒性试验的目的 亚慢性毒性试验的设计 二 慢性毒性作用： 慢性毒性的概念 慢性毒性试验的目的 慢性毒性试验的设计 第四节第四节 亚慢性和慢性毒性试验亚慢性和慢性毒性试验( (一一) ) 概念：概念：亚慢性毒性(subchronic toxicity)是指人或实验动物连续多日(通常13个月)重复接触外源化学物所引起的毒性效应。慢性毒性(chronic toxicity)是指人或实验动物长期(甚至终生)反复接触低剂量的化学毒物所产生的毒性效应。一、亚慢性和慢性毒性试验的概念、目的（二）试验目的：（二）试验目的：1.确定
21、受试物亚慢性和慢性毒性的效应谱；2.研究受试物亚慢性和慢性毒作用的靶器官；3.研究受试物亚慢性和慢性毒性剂量反应(效应)关系，确定 LOAEL和NOAEL,提 出此受试物的安全限量参考值;4.研究受试物亚慢性和慢性毒性损害的可逆性;5.亚慢性毒性试验为慢性毒性试验的剂量设计及观察指标选择提供依据;6.确定不同动物物种对受试物亚慢性和慢性毒效应的差异，为将毒性研究结果外推到人提供依据。 二、亚慢性和慢性毒性试验设计二、亚慢性和慢性毒性试验设计 （一）实验动物选择（一）实验动物选择 亚慢性毒性试验亚慢性毒性试验 年龄：年龄：大鼠大鼠80100g 狗狗 812月月 小鼠小鼠1015g数量：数量：小动
22、物小动物20 大动物大动物6性别：性别：雌雄各半雌雄各半 慢性毒性试验慢性毒性试验年龄：年龄：大鼠大鼠 5070g 狗狗 8月月 小鼠小鼠 初断乳初断乳数量：数量：小动物小动物40 大动物大动物8性别：性别：雌雄各半雌雄各半（二）实验动物染毒期限：（二）实验动物染毒期限： 亚慢性毒性试验：30d、90d喂养试验 慢性毒性试验：工业毒理学 6个月食品毒理学1年环境毒理学1年致癌试验 接近或等于动物的预期寿命 经消化道 灌胃；吞咽胶囊；喂饲。经呼吸道 静式吸入染毒； 动式吸入染毒； 气管内入。经皮肤 经皮染毒毒性试验；皮肤刺激和致敏试验。注射染毒（三）实验动物染毒方式（三）实验动物染毒方式亚慢性毒
23、性的剂量选择阴性对照组低剂量组中剂量组高剂量组 急性毒性的阈剂量 1/201/5 LD50组距：310倍，最低不小于2倍慢性毒性的剂量选择阴性对照组低剂量组中剂量组高剂量组 亚慢性阈剂量或其1/51/2 1/10 LD50组距：25倍，最低不小于2倍（四）试验分组和剂量设计（四）试验分组和剂量设计（五）观察指标（五）观察指标 1.一般综合性观察指标： 外观体征、行为活动、体重、食物利用率、中毒症状2.生理生化指标：肝、肾、血、代谢产物3.病理学检查：（1）病理解剖（2）脏器湿重、脏器系数（脏/体比值 ） （如肝/体比，即(全肝湿重/体重)100 ）（3）病理学检查4.特异性指标：5.检测指标的时间6.恢复期观察（五）观察指标（五）观察指标二、亚慢性和慢性毒性试验设计思考题：P146T1、T4、T6、T9、T13
