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1、荧光定量荧光定量PCRPCR技术部：张劲松荧光定量PCR技术发展史荧光定量PCR的概念 荧光定量PCR是通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件对结果进行分析，计算待测样品的初始模板量。荧光定量PCR与普通PCR比较 实时在线监控实时在线监控 对样品扩增的整个过程进行实时监控，能够实时地观察到产物对样品扩增的整个过程进行实时监控，能够实时地观察到产物的增加，直观地看到反应的对数期的增加，直观地看到反应的对数期 降低反应的非特异性降低反应的非特异性 使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提
2、高了PCRPCR反应反应的特异性的特异性 增加定量的精确性增加定量的精确性 全程监控，精确定量全程监控，精确定量 结果分析更快捷方便，无需电泳结果分析更快捷方便，无需电泳 同一样品重复同一样品重复96次的实验结果次的实验结果普通普通PCR - 终点检测终点检测： - 终点产物量经过终点产物量经过PCR放大放大的的DNA量量- 不恒定，误差大不恒定，误差大Q-PCR - 起点检测起点检测：- 具有重现性，误差小具有重现性，误差小 扩增曲线（primary curve） 随着PCR反应的进行，扩增产物不断累积，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量
3、的变化，从而得到扩增曲线图。 PCR的扩增曲线实际上并不是一条标准的指数曲线，而是呈S型曲线。 纵坐标：Rn（荧光值） 横坐标：cycle number（循环数）线性期荧光阈值（threshold）基线基线(baseline)：一般把荧光PCR的前15个循环信号作为荧光本底信号,即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值。荧光阀值荧光阀值(threshold)：扩增曲线上人为设定的一个值扩增曲线上人为设定的一个值- 缺省设置：PCR反应前3-15个循环荧光本底信号标准偏差的10倍, （机器自动设置）。- 手动设置：大于样本的荧光背景值手工调整荧光阈值示意图 Ct 值(Cycle Threshold)
4、Ct值值：在荧光PCR扩增过程中，当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。Ct值的特点：相同模板进行96次扩增，平台期DNA拷贝数波动很大，但Ct值相对固定；Ct值则极具重现性 起始拷贝数越多，经过的循环数就越少，Ct值也就越小，反之亦然。正常的CT值范围在18-30之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。 Ct值可以确定初始模板量？u理想的理想的PCR反应：反应： X=X0*2nu非理想的非理想的PCR反应：反应： X=X0(1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率当当n=Ct时时 荧光定量荧光定量PCR应应用用l基础
5、研究中基因表达定量的测定；基础研究中基因表达定量的测定；l细胞因子的表达分析细胞因子的表达分析：mRNA表达量分析；l药物治疗、新药研究；药物治疗、新药研究；l遗传病的诊断：遗传病的诊断：点突变、插入基因、多基因等检测；l肿瘤耐药基因表达的研究：肿瘤耐药基因表达的研究：如p53基因、多药耐药相关蛋白（MRP）蛋白等检测；l临临床床医医疗疗领领域域病病原原体体和和基基因因诊诊断断：基因拷贝数定量、细菌和病毒、病原体的定量检测，如：确定病原体的数量判断感染程度，掌握用药时机、药物疗效观察乙肝病毒人乳头瘤病毒淋球菌结核杆菌沙眼衣原体解脲支原体荧光定量PCR检测方法染料标记：染料标记： SYBR Gr
6、een I探针标记：探针标记：水解型探针：水解型探针： TaqMan发夹型探针：发夹型探针：Molecular beacon （分子信标）（分子信标）（分子信标）（分子信标） SYBR Green I 工作原理lSYBR Green I 是是一种与双链一种与双链DNA小小沟结合的荧光染料。沟结合的荧光染料。lSYBR Green I只只与双链与双链DNA结合结合才能发出荧光。才能发出荧光。l荧光信号与双链荧光信号与双链DNA分子数成正分子数成正比，随着扩增产物增加而增加。比，随着扩增产物增加而增加。 荧光信号强度与反应体系中荧光信号强度与反应体系中所有双链所有双链DNA分子成分子成正比正比。S
7、YBR Green5353SGExcitationSGSGSGSGEmissionSYBR Green I作用机理示意图 53535353SGSGSGSGSGEmissionEmissionExcitationExcitationSYBR Green I优缺点 优点：n 实验设计简单 - 仅需设计两个引物n通用性好,成本低 - 对DNA模板没有选择性n兼容熔解曲线 -鉴定有无PCR杂带、有无引物二聚体需要在反应结束时，对产物做融解曲线分析。需要在反应结束时，对产物做融解曲线分析。缺点：nSYBR Green与所有双链DNA结合- 引物二聚体或错误扩增产物造成假阳性- 只能检测单一模板，无法进行
8、多重检测n灵敏度低-适合于5000拷贝以上的基因定量温度温度荧光强度荧光强度熔解曲线分析PCR过程结束后，将温度缓慢升高，此时双链DNA解链成为单链，内掺染料会被释放出来，荧光信号逐渐减弱。l将温度对荧光强度的变化求导。(-dI/dT) 峰值代表斜率改变最大时的温度值，即Tm，其值与双链DNA的长度、GC%含量有关，可部分代表序列的特异性融解曲线分析，单一峰无非特异性荧光定量准确融解曲线分析，出现杂峰其他产物出现非特异性荧光，因此定量不准确 Taqman 工作原理l探针与靶序列配对探针与靶序列配对 （一段序列，两个基团，（一段序列，两个基团，5 报告基团、报告基团、3淬灭基团）淬灭基团）l完整
9、的探针，报告基团完整的探针，报告基团R发射的荧光被淬灭基团发射的荧光被淬灭基团Q淬淬灭，没有荧光产生。灭，没有荧光产生。l聚合酶的聚合酶的5外切酶活性，报告基团外切酶活性，报告基团R与淬灭基团与淬灭基团Q分离，分离，发射荧光发射荧光RQReporterQuencherRQ荧光信号强度与结合探针的荧光信号强度与结合探针的DNADNA分子成正比。分子成正比。RQ53535353ExcitationRQ QRQRExcitationTaqman 工作示意图工作示意图 Taqman法的优缺点 优点优点优点优点% 高度特异性高度特异性% 重复性好重复性好% 灵敏度高灵敏度高% 可进行多重定量可进行多重定
10、量 缺点缺点缺点缺点% 只适合一个特定的目标只适合一个特定的目标% 委托公司标记，价格较委托公司标记，价格较高高% 不易找到本底低的探针不易找到本底低的探针RQExcitationRQQRExcitationEmission分子信标(Molecular beaco) 分子信标分子信标是一种在靶 DNA 不存在时形成茎环结构的双标记寡核苷酸探针。 实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR技术总结技术总结方法方法优点优点缺点缺点适用范围适用范围SYBR Green I 方法适用性广灵敏方便便宜引物要求高易出现非特异性带适合科研中对各种目的基因定量分析，基因表达量的研究，转基因重组动植物的研究TaqMa
11、n 方法特异性高重复性好价格高只适合特定目标病原体检测，疾病耐药基因研究，药物疗效考核遗传疾病的诊断Molecular Beacon法(分子信标)高特异性荧光背景低只适合特定目标设计困难价格高特定基因分析SNP分析1. 根据基因序列设计特异性的引物和荧光探针。根据基因序列设计特异性的引物和荧光探针。 2. 提提DNA/ RNA 。 3. Real Time PCR(荧荧光光定定量量 PCR)，进进行行实实验验结结果果分分析析 。 4. 实实验验完完成成后后，提提供供完完整整的的实实验验报报告告（含含软软件件分分析析结结果果）及引物等实验材料。及引物等实验材料。荧光定量荧光定量PCRPCR的操作
12、流程的操作流程荧光定量PCR解析方法l绝对定量绝对定量 检测起始模板数的精确拷贝数检测起始模板数的精确拷贝数l相对定量相对定量 检测经过不同样本之间目的基因的表达检测经过不同样本之间目的基因的表达差异差异绝对定量的步骤拷贝数计算拷贝数计算对标准品进行梯度浓度稀释对标准品进行梯度浓度稀释荧光定量荧光定量PCR反应反应建立标准品建立标准品未知样品未知样品Ct代入标准曲线代入标准曲线确定拷贝数确定拷贝数质粒提取OD值测定计算待测样本浓度/样本分子量/待测样本拷贝数标准品进行标准品进行5-6个个梯度稀释梯度稀释标准品稀释倍数为标准品稀释倍数为10绝对定量绝对定量Sample- - 样本起始浓度与样本起
13、始浓度与CtCt呈线性关系，根据已知拷贝的标呈线性关系，根据已知拷贝的标准品作出标准曲线。准品作出标准曲线。-根据未知样品的根据未知样品的CtCt值，推算出未知样本量。值，推算出未知样本量。以标准品为标杆以标准品为标杆SampleSamplecopies/mcopies/ml lCt1Ct1Ct2Ct2MeanCtMeanCtSTDSTD标准品510328.1828.6428.410.16标准品510425.2525.1425.190.04标准品510522.1122.4622.280.12标准品510618.6318.9218.770.10未知样品? ?20.5620.4520.50.05空
14、白对照NoneNone实验数据实验数据绝对定量实验例绝对定量实验例 乙肝病人血液中乙肝病人血液中HBVHBV的绝对定量的绝对定量扩增效率（扩增效率（E）计算）计算 E = 10-1/斜率 1 = 10-1/-3.29 1 = 2.011 = 1.01 标准曲线制作：标准曲线制作：利用利用Mean Ct 作图可得到标准曲线作图可得到标准曲线y = -3.29x + 40.33 R2 = 0.9978 相关系数（相关系数（相关系数（相关系数（R R R R2 2 2 2）：大于）：大于）：大于）：大于0.980.980.980.98，越接近，越接近，越接近，越接近1 1 1 1，结果可信度越高。，
15、结果可信度越高。，结果可信度越高。，结果可信度越高。 扩增效率（扩增效率（扩增效率（扩增效率（E E E E）：）：）：）：0.9-1.2, 0.9-1.2, 0.9-1.2, 0.9-1.2, 越接近越接近越接近越接近1 1 1 1，越理想。，越理想。，越理想。，越理想。 未知样品拷贝数的计算：未知样品拷贝数的计算：将Ct值带入线性方程：20.5= -3.29 X + 40.33QuantityUnknown=10 6.03 =1,071,519 copies X=20.5-40.33-3.29=6.03 相对定量 特点特点选择内参基因选择内参基因内参基因内参基因GAPDHGAPDH、Act
16、inActin、18S rRNA18S rRNA等看家基因等看家基因在细胞中的表达量在细胞中的表达量或在基因组中的拷或在基因组中的拷贝数恒定，受环境贝数恒定，受环境因素影响较小因素影响较小- 文献检索文献检索- 实验筛选实验筛选内参基因内参基因- - 同样体积或重量的样本所来源的细胞数目不同。同样体积或重量的样本所来源的细胞数目不同。- RNA- RNA抽提、反转效率不同，操作中存在误差。抽提、反转效率不同，操作中存在误差。对样本初始浓度差异进行均一化校正。对样本初始浓度差异进行均一化校正。 双标准曲线法双标准曲线法 2 -Ct法法 相对定量相对定量两种常用的分析方法两种常用的分析方法 假设条
17、件：假设条件： 内参基因和目标基因扩增效率不同内参基因和目标基因扩增效率不同 优点：优点：实验优化简单实验优化简单 缺点：缺点：每一轮实验都必需做标准曲线每一轮实验都必需做标准曲线80%相对定量相对定量双标准曲线法双标准曲线法待测组目的基因平均Ct值待测组看家基因平均Ct值对照组目的基因平均Ct值对照组看家基因平均Ct值F=2-公式：公式：应用：应用：基因表达调控研究中最常用与公认的相对定量方法之一CtCt待测待测Ct对照对照F=2 -Ct 相对定量相对定量2 2 CtCt相对定量2 - Ct实例靶基因靶基因Jun(Ct)Jun(Ct)GAPDHGAPDH（CtCt）E E对照组对照组1817
18、1.95实验组实验组1617.41.952 - Ct法：假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100%Ct（对照组）Ct 靶基因Ct GAPDH = 18171 Ct（实验组） Ct 靶基因Ct GAPDH = 1617.4=1.4Ct = Ct实验组Ct对照组1.412.4比率（实验组/对照组）=2Ct2（2.4） = 5.3 所以所以Jun基因在实验组表达水平是对照组的基因在实验组表达水平是对照组的5.3倍倍修正方法：如果我们知道目标基因和参照基因有相同的扩增效率，但扩增效率不等于修正方法：如果我们知道目标基因和参照基因有相同的扩增效率，但扩增效率不等于2，那么，那么2Ct可以修正为：可以修
19、正为：ECt，例如扩增效率为，例如扩增效率为1.95，那么计算公式可修正为，那么计算公式可修正为1.95Ct应用实例应用实例MicroRNA 荧光定量荧光定量PCRmicroRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子,它们在动植物中参与转录后基因表达调控。到目前为止，已报道有几千种miRNA存在于动物、植物、真菌等多细胞真核生物中，进化上高度保守。Micro RNAMicro RNA荧光定量荧光定量PCRPCR优势优势microRNA实时定量PCR检测技术最近才有所发展，相对其它荧光定量检测技术有以下优点： 1.1.高特异性高特异性 只对成熟 microRNA 进行
20、定量，有效区分成熟 microRNA分子和前体分子以及其它成熟 microRNA的同源分子； 2.2.简便快捷简便快捷 省时省力省时省力整个操作只需两步，不到3个小时，即可获得高质量的数据； 3.3.检测灵敏检测灵敏 节省样品节省样品样品消耗少，仅需 1-10ng 的总 RNA或50pg左右的 microRNA TaqMan MicroRNA 分析方法分析方法发夹状引物的反转录荧光定量发夹状引物的反转录荧光定量PCRmiRNAStep 1:Stem-loop RTStep 2:Real-time PCRFQOligos required per miRNA1.Specific RT prime
21、r2.Specific forward primer3.Specific reverse primer4.Specific TaqMan probe5.Enzymes required6.Reverse transcriptase7.AmpliTaq Gold DNA PolymeraseSYBR Green MicroRNA 分析方法分析方法MicroRNA 定量方法定量方法lEstimated synthetic miRNA input (lin-4) in RT based on OD: 707-71 copiesl实验证明可达实验证明可达7个数量级的线性范围个数量级的线性范围Slope = -3.4R2 = 0.9991No. PCR cyclesFluorescence signal ( Rn)No. copiesThreshold Cycle (CT)70Mcopies7copiesABStem-loop RT-PCR miRNA assays 高度的重现性高度的重现性let-7amiR-20miR-324-5miR-16
