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1、实验二实验二 显微镜油镜的使用、细胞形态的显微镜油镜的使用、细胞形态的 观察及革兰氏染色观察及革兰氏染色 1、显微镜油镜的使用2、细菌形态的观察（示教）（示教）3、革兰氏染色一、实验目的一、实验目的1.1.学习并掌握普通光学显微镜的构造和学习并掌握普通光学显微镜的构造和油油镜的使用镜的使用技术及维护的基本知识技术及维护的基本知识；2.2.掌握细菌掌握细菌革兰氏染色革兰氏染色的原理和方法，学的原理和方法，学会在油镜下观察细胞和识别细菌的形态会在油镜下观察细胞和识别细菌的形态特征。特征。二、实验原理二、实验原理1.1.光学部分光学部分: :接目镜接目镜 、 接物接物镜镜 、 照明装置照明装置( (
2、聚光镜、聚光镜、 虹彩光圈、反光镜等虹彩光圈、反光镜等) )。 它使它使检视物放大检视物放大, ,造成物象。造成物象。2.2.机械部分机械部分: :镜座、镜臂、镜镜座、镜臂、镜筒、物镜转换器、载物台、载筒、物镜转换器、载物台、载物台转移器、粗调节器、细调物台转移器、粗调节器、细调节器等部件。它起着支持、调节器等部件。它起着支持、调节、固定等作用。节、固定等作用。（一）普通光学显微镜（一）普通光学显微镜图图1-1-2 光学显微镜的成像原理光学显微镜的成像原理倒立的虚像倒立的虚像显微镜的放大倍数和分辨率显微镜的放大倍数和分辨率D值越小，分辨率越高，看到的物象越清晰值越小，分辨率越高，看到的物象越清
3、晰2.2. 显微镜的分辨率显微镜的分辨率：是表示显微：是表示显微镜辨析物体（两端）两点之间距镜辨析物体（两端）两点之间距离的能力，可用公式表示为：离的能力，可用公式表示为： D D（R R）=0.61/nSin/2=0.61/nSin/2n式中式中D D：物镜分辨出物体两点间物镜分辨出物体两点间的的最短距离最短距离。 ：可见光的波长（平均：可见光的波长（平均0.550.55 m) m) n n: : 物镜和被检标本间介质的折物镜和被检标本间介质的折射率。射率。 ：镜口角（即入射角）。：镜口角（即入射角）。1.1.放大倍数放大倍数= =接物镜放大倍数接物镜放大倍数接目镜放大倍数接目镜放大倍数镜口
4、率镜口率 N.A=nSin/2 油镜油镜(OI,HI,100X)，即油浸，即油浸接物镜。当光线由反光镜通过接物镜。当光线由反光镜通过玻片与镜头之间的空气时，由玻片与镜头之间的空气时，由于空气与玻片的密度不同，使于空气与玻片的密度不同，使光线受到曲折，发生散射，降光线受到曲折，发生散射，降低了视野的照明度。若中间的低了视野的照明度。若中间的介质是一层油（介质是一层油（其折射率与玻其折射率与玻片的相近片的相近），则几乎不发生折），则几乎不发生折射，增加了视野的进光量，从射，增加了视野的进光量，从而使物象更加清晰。而使物象更加清晰。u根据公式根据公式D=0.61/nSin/2D=0.61/nSin/
5、2 ，增大分母，使得增大分母，使得D值减小，分辨值减小，分辨率增大。率增大。（二）油镜使用的原理（二）油镜使用的原理1.1.不准擅自拆卸显微镜的任何部件不准擅自拆卸显微镜的任何部件, ,以免损坏。以免损坏。2.2.镜面只能用镜面只能用擦镜纸擦镜纸擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度擦，不能用手指或粗布，以保证光洁度3.3.观察标本时，必须依次用观察标本时，必须依次用低、中、高倍镜低、中、高倍镜，最后用油镜最后用油镜。当。当目视接目镜时，特别在目视接目镜时，特别在使用油镜时，切不可使用粗调节器使用油镜时，切不可使用粗调节器，以免压碎玻片或损伤镜面。以免压碎玻片或损伤镜面。4.4.拿显微镜时，一定要
6、拿显微镜时，一定要右手右手拿镜臂，拿镜臂，左手左手托镜座，不可单手拿，托镜座，不可单手拿，更不可倾斜拿。更不可倾斜拿。5.5.油镜使用结束后，物镜用擦镜纸擦三遍：第一遍擦去多余的油镜使用结束后，物镜用擦镜纸擦三遍：第一遍擦去多余的香柏油香柏油；第二遍擦镜纸蘸上；第二遍擦镜纸蘸上乙醇乙醇再擦镜头；第三遍再用干净再擦镜头；第三遍再用干净的擦镜纸擦去多余的的擦镜纸擦去多余的乙醇乙醇。6.6.显微镜应显微镜应存放存放在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片在阴凉干燥处，以免镜片滋生霉菌而腐蚀镜片。（三）显微镜保养和使用中的注意事项（三）显微镜保养和使用中的注意事项1 1、实验原理（、实验原理（p.29
7、p.29） 革兰氏染色法：革兰氏染色法：细菌学中重要的鉴别染色法。细菌学中重要的鉴别染色法。 有芽孢的杆菌有芽孢的杆菌和和绝大多数球菌绝大多数球菌以及以及所有的放线所有的放线菌和真菌菌和真菌都呈革兰氏都呈革兰氏阳性阳性反应；反应； 弧菌、螺旋体弧菌、螺旋体和和大多数致病性的无芽孢杆菌大多数致病性的无芽孢杆菌都都呈现呈现阴性阴性反应。反应。（四）、革兰氏染色原理（四）、革兰氏染色原理n根据革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌之间根据革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌之间细胞壁细胞壁的的结构差异结构差异来达到染色的目的的。来达到染色的目的的。n先用先用结晶紫初染结晶紫初染，所有的细菌都被染成初染料的，所有的细菌都被
8、染成初染料的蓝紫色蓝紫色；n然后用然后用碘媒染碘媒染，它与结晶紫结合成，它与结晶紫结合成结晶紫结晶紫碘复碘复合物合物，从而增强了染料与细菌的结合力。，从而增强了染料与细菌的结合力。n然后再用然后再用乙醇脱色乙醇脱色处理。处理。（四）、革兰氏染色原理（四）、革兰氏染色原理n由于革兰氏由于革兰氏阳性菌阳性菌细胞壁主要由肽聚糖形成网状细胞壁主要由肽聚糖形成网状结构、壁厚、类脂质含量低，结构、壁厚、类脂质含量低，脱色时网孔收缩脱色时网孔收缩，结晶紫结晶紫碘碘不易被洗脱不易被洗脱而保留在细胞内，复染时而保留在细胞内，复染时仍保持仍保持蓝紫色蓝紫色。n而革兰氏而革兰氏阴性菌阴性菌由于细胞壁的肽聚糖层较薄、
9、类由于细胞壁的肽聚糖层较薄、类脂含量高，所以当脱色处理时类脂被乙醇溶解，脂含量高，所以当脱色处理时类脂被乙醇溶解，细胞壁透性增大，结晶紫细胞壁透性增大，结晶紫碘复合物被洗脱，复碘复合物被洗脱，复染时细胞被染上复染剂的颜色染时细胞被染上复染剂的颜色（红色）（红色）。（四）、革兰氏染色原理（四）、革兰氏染色原理大肠杆菌大肠杆菌葡萄球菌葡萄球菌1 1、菌种、菌种：大肠杆菌、白色葡萄球菌：大肠杆菌、白色葡萄球菌2 2、仪器、仪器：显微镜：显微镜3 3、染色液、染色液：草酸铵：草酸铵结晶紫结晶紫染色液、染色液、LugolLugol( (路哥尔氏路哥尔氏) )碘液碘液、9595乙醇、乙醇、0.5%0.5%
10、沙黄沙黄染色液染色液4 4、材料、材料：载玻片、香柏油、乙醇、擦：载玻片、香柏油、乙醇、擦镜纸镜纸三、实验材料三、实验材料（一）（一）显微镜显微镜油镜观察操作方法油镜观察操作方法 在高倍镜或低倍镜下在高倍镜或低倍镜下找到找到要观察的要观察的样品区域样品区域后，然后将后，然后将油镜转油镜转到工作位置。在待观察的样品到工作位置。在待观察的样品区域滴区域滴加香柏油加香柏油，从，从侧面侧面注视，用注视，用粗调节器粗调节器使油使油镜浸在镜油中并几乎与标本相接。然后用镜浸在镜油中并几乎与标本相接。然后用细调节细调节器器调节，在目镜下找到最合适的观察点。调节，在目镜下找到最合适的观察点。四、实验操作步骤四、
11、实验操作步骤p油镜使用毕后油镜使用毕后：上升上升镜筒，镜筒，取下取下载玻载玻片，用擦镜纸片，用擦镜纸拭去拭去镜头上的镜头上的镜油镜油，然，然后用擦镜纸后用擦镜纸蘸少许蘸少许乙醇乙醇擦擦去镜头上残去镜头上残留的油迹，留的油迹，最后最后用干净的擦镜纸用干净的擦镜纸擦去擦去残留的残留的乙醇。乙醇。四、实验操作步骤四、实验操作步骤n本实验室本实验室按小组使用固定编号的显微镜按小组使用固定编号的显微镜，显微镜的保养由显微镜的保养由对应学号对应学号的同学的同学负责负责。实验过程中如果所用显微镜不能使用，实验过程中如果所用显微镜不能使用，自行与其他同学调节。但显微镜如果自行与其他同学调节。但显微镜如果出现问
12、题，由对应学号的同学承担责出现问题，由对应学号的同学承担责任。任。四、实验操作步骤四、实验操作步骤基本形态基本形态：杆菌，球菌：杆菌，球菌（注意大小、染色性、（注意大小、染色性、排列）排列）特殊结构：特殊结构：鞭毛，芽胞，荚膜鞭毛，芽胞，荚膜（先找到菌体，（先找到菌体，再仔细观察特殊结构）再仔细观察特殊结构）四、实验操作步骤四、实验操作步骤（二）细菌形态的观察（示教？）（二）细菌形态的观察（示教？）（三）革兰氏染色的操作方法（三）革兰氏染色的操作方法无菌操作无菌操作涂片涂片 干燥干燥 固定固定 染色染色 水洗水洗 干燥干燥 镜检镜检四、实验操作步骤四、实验操作步骤（1 1）涂片：）涂片：先在载
13、玻片左右端各滴一滴生理盐水，分别挑先在载玻片左右端各滴一滴生理盐水，分别挑取取大肠杆菌大肠杆菌和和白色葡萄球菌白色葡萄球菌菌体于生理盐水中菌体于生理盐水中涂片涂片（采用采用三区涂片法：三区涂片法：分别将上述分别将上述2 2种菌液延伸至玻片中央，种菌液延伸至玻片中央，混匀混匀并涂成薄膜），把菌液充分涂开，使其分布均匀。并涂成薄膜），把菌液充分涂开，使其分布均匀。注意：注意：载玻片要洁净载玻片要洁净无油迹无油迹；滴生理盐水和取菌；滴生理盐水和取菌不宜过多不宜过多，涂片要涂片要均匀均匀，不可不可过于过于浓厚浓厚。（三）革兰氏染色的操作方法（三）革兰氏染色的操作方法三区涂片法三区涂片法载玻片生理盐水滴
14、菌体涂片大肠杆菌大肠杆菌葡萄球菌葡萄球菌混合菌混合菌染色前染色前必须固定必须固定细菌，其目的是：细菌，其目的是：一是一是杀死杀死细菌并使菌体细菌并使菌体粘附粘附于玻片上。于玻片上。二是二是增加其对染料的增加其对染料的亲和亲和力。常用的有力。常用的有加热和化学固定两种方法。固定时尽加热和化学固定两种方法。固定时尽量维持细胞原有的形态。量维持细胞原有的形态。（三）革兰氏染色的操作方法（三）革兰氏染色的操作方法 干燥：干燥：把上面涂好的片于把上面涂好的片于室温下自然干燥室温下自然干燥( (或者用吹风机或者用吹风机) )。 固定固定： 涂面朝上涂面朝上，在，在火焰火焰上方过几次以热固定菌体（此上方过几
15、次以热固定菌体（此操作的目的是使得细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之操作的目的是使得细胞质凝固，以固定细胞形态，并使之牢固附着在载玻片上）。固定时通过火焰牢固附着在载玻片上）。固定时通过火焰1 12 2次次即可。即可。注意：不可过热，以载玻片不烫手为宜，温度过高会改变甚注意：不可过热，以载玻片不烫手为宜，温度过高会改变甚至破坏细胞形态。至破坏细胞形态。 初染：初染：滴数滴滴数滴结晶紫结晶紫于菌膜上（以刚好完全覆盖菌膜为于菌膜上（以刚好完全覆盖菌膜为宜）初染宜）初染1-21-2分钟分钟minmin，水洗水洗。 媒染媒染：滴加：滴加碘液碘液冲去残水，并覆盖约冲去残水，并覆盖约1min1min，水洗
16、水洗。（三）革兰氏染色的操作方法（三）革兰氏染色的操作方法初染初染媒染媒染脱色脱色复染复染 脱色脱色：用滤纸吸去载玻片上面的残水，将玻片倾：用滤纸吸去载玻片上面的残水，将玻片倾斜，用斜，用9595酒精酒精滴洗滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色至流出酒精刚刚不出现紫色时为止，约时为止，约202030s30s，立即，立即用水冲净用水冲净酒精。酒精。 注意：注意：革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是整个革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是整个操作的操作的关键环节关键环节，脱色，脱色不足不足，阴性菌被误染成阳，阴性菌被误染成阳性菌（性菌（假阳性假阳性），脱色过度，阳性菌被误染成阴），脱色过度，阳性菌被误染成阴性
17、菌。性菌。（三）革兰氏染色的操作方法（三）革兰氏染色的操作方法 复染复染：用：用番红番红液染液染1 12min2min, ,水洗。水洗。 镜检镜检：干燥后（室温下：干燥后（室温下晾干晾干），观察（先在），观察（先在低倍低倍镜（镜（40X40X），），然后在然后在油镜（油镜（100X100X）下观察菌体细胞）下观察菌体细胞的形态）。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌的形态）。革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色。呈紫色。注意：以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过注意：以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈假阳性。于密集的细菌，常常呈假阳性。（三）革兰氏染色的操作方法（三）革
18、兰氏染色的操作方法(10)(10)实验结果的记录实验结果的记录： 要求在用要求在用显微镜观察（左眼观察）的同时显微镜观察（左眼观察）的同时在实验记录本上画下你所观察到在实验记录本上画下你所观察到的细菌的形态。的细菌的形态。（三）革兰氏染色的操作方法（三）革兰氏染色的操作方法注意：实验结束后，把载玻片用酒精棉擦净，放入烧杯！注意：实验结束后，把载玻片用酒精棉擦净，放入烧杯！n本实验本实验每人做一张每人做一张。n实验报告中要画图表示结果实验报告中要画图表示结果（40X倍镜、100X油镜）。（三）革兰氏染色的操作方法（三）革兰氏染色的操作方法思考题思考题1.1.涂片为何要固定涂片为何要固定？固定加热时间过长会怎样固定加热时间过长会怎样2.2.革兰氏染色中哪一步是关键，为什么？你如革兰氏染色中哪一步是关键，为什么？你如何控制这一步？何控制这一步？3.3.使用油镜时，为什么必须用香柏油？使用油镜时，为什么必须用香柏油？
