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1、3730xl测序原理及特点3730xl测序仪的原理 双脱氧链终止法测序原理 3730xl测序仪的构造 3730xl测序仪的特点 测序基本流程3730xl测序仪的应用文库类型及特点Sanger测序法的原理 19771977年，英国人Fred Sanger Fred Sanger 发现，如果在DNADNA复制过程中掺入ddNTPddNTP，就会产生一系列末端终止的DNADNA链，并能通过电泳按长度分辨。 不同末端终止DNADNA链的长度是由掺入到新合成链上随机位置的ddNTPddNTP决定的。 由此诞生了以Sanger命名的测序原理即双脱氧链终止法测序原理。5磷酸磷酸3羟基羟基3,5 -磷酸二磷酸
2、二酯键酯键核苷酸形成3,5-磷酸二酯键示意图核酸序列形成的基础“ “双脱氧末端终止双脱氧末端终止双脱氧末端终止双脱氧末端终止” ”的含的含的含的含义义义义TemplatePrimerdNTPPolymeraseTerminatorCGTA终止物标记方法因为颜色不同，4种终止物可以在一起进行反应。3730xl Sequence Map测序反应与PCR的比较 PCR 测序反应测序反应 DNA 聚合酶聚合酶 Taq酶酶 测序酶测序酶 引物引物 一对一对 单向单向 底物底物 dNTP dNTP+ddNTP* 模板模板 量少量少 质量要求高质量要求高 产物产物 等长的等长的DNA片段片段 相差一个碱基的
3、一系相差一个碱基的一系l列片段列片段 荧光标记荧光标记 无无 3端带荧光标记端带荧光标记 测序产物测序产物 指数扩增指数扩增 线性扩增线性扩增3730xl测序仪的构造遗传分析仪系统组成主主 机机电脑及软件电脑及软件耗耗 材材Capillary3730xl测序仪的特点1 电进样及电泳电进样及电泳1. 毛细管和电极深入样品溶液中2. 加电压3. 荷负电的DNA分子进入毛细管 在电场作用下向阳极泳动2 荧光激发和检测荧光激发和检测1.分别带4色荧光标记的DNA片段从小到大依次经过激光检测区2.激光激发荧光产生长波长的荧光信号3.荧光信号被冷CCD收集4.软件将光学信号转换成电泳图谱 专利的荧光检测技
4、术专利的荧光检测技术多道毛细管同时检测多道毛细管同时检测双束激光激发双束激光激发 光栅光栅全波长分光全波长分光低温低温CCD实时检测实时检测每道毛细管同时检测激发：激发：Dual Side IlluminationDual Side Illumination双束激光两侧同时激发：灵敏度+均匀性+超速测序Top beam BlockedBoth BeamsBottom Beam Blocked检测：光栅+低温CCD同步成像支持支持4色或色或5色以上荧光，适用于多种商品化试剂盒。色以上荧光，适用于多种商品化试剂盒。更新荧光化学时无需更换任何硬更新荧光化学时无需更换任何硬 件设备件设备低温低温CCD
5、有效提高信噪比，准确度高。有效提高信噪比，准确度高。光栅全波长分光低温CCD实时检测Fully Integrated System3730xl3730xl型遗传分析仪型遗传分析仪双光束激光实时激发荧光全波长实时荧光检测：光栅分光，后置超簿型CCD检测 96个样品自动进样及一体化16板自动进样样品架 内置样品板条形码自动识别 100次（9600个样品）运行试剂一次上机 自动碱基识别与质量评分软件 长读测序POP-7液体分离胶，动态内镀毛细管 电泳温度18-70 C可调DNADNA测序基本流程测序基本流程 准备模板：质粒、PCR产物 抽样检查DNA浓度和质量，必要时纯化 测序PCR反应 纯化测序产
6、物 变性 上机电泳 分析数据DNA测序技术应用测序技术应用测序的应用 q基因组基因组DNA测序测序qcDNA测序测序q未知序列测序未知序列测序q已知序列再测序已知序列再测序q质粒、质粒、PCR产物产物qBAC、YACq细菌基因组细菌基因组DNAq法医：线粒体法医：线粒体DNA测序测序Long read with BigDye Terminator v3.1: 1010bp长片段测序长片段测序ACCGTCTTGACCTCGTACGCATGAACCGTCCTGACCTCGTACGCATGA基因测序的重要工作：杂合子位点识别 A C G T杂合子测序杂合子测序杂合子检测：发现新突变位点再测序再测序人
7、类基因组计划的完成，为遗传分析开创了新的研究领域其他物种的测序项目已经启动再测序项目的特点可以更好的理解遗传多样性在疾病中的作用可以在各种规模的实验室中进行，而不是仅限于基因组测序中心要求更高质量的数据基因分析技术在生物、医学、农牧业领域的应用 DNA测序 q人类功能基因再测序q细菌、真菌等微生物鉴定；qHLA配型q基因突变检测 SNP检测qSNaPshot MultiplexqSNPlexq二重TaqMan探针 片段分析q基于STR的法医个体识别与亲子鉴定：HIDq基于STR的致病基因连锁定位：LMSq基因突变筛选 ：SSCPq农牧业育种：AFLP 基因表达定量qTaqMan探针法与荧光染料
8、法文库文库类型及特点类型及特点基因文库（Gene Library）基因组文库（Genomic Library ）cDNA 文库（cDNA Library）基因组文库基因组文库含有某种生物全部遗传信息的重组DNA分子的克隆总和基因组文库常用的载体及特点质粒载体质粒载体 简单、快速、易于操作，但仅适合一些低等真核生物和原核生物，如：pBR322,pUC18,pGEM噬菌体载体噬菌体载体 由噬菌体改建而来，需要在体外包装成噬菌体颗粒，再转染受体细胞粘质粒载体（粘质粒载体（cosmid) 具有质粒和噬菌体两种载体的性质人工染色体人工染色体 能容纳大片段的外源DNA。如YAC(酵母人工染色体），BAC(
9、细菌人工染色体），PAC(P1来源的人工染色体），MAC（哺乳动物人工染色体）各种克隆载体的比较载体受体细胞结构插入大小适 用pUC18/19质粒E.coli环形质粒1000kb基因组文库cDNA 文库文库 直接以完整的直接以完整的mRNA为模板反转录成的为模板反转录成的全长全长cDNA分子与克隆载体连接后，转分子与克隆载体连接后，转导到寄主细胞导到寄主细胞，经复制形成的在寄主细经复制形成的在寄主细胞中保存的许多克隆胞中保存的许多克隆 分类分类质粒cDNA文库噬菌体cDNA文库 表达文库非表达文库 未处理cDNA文库均一化cDNA文库差减cDNA文库普通普通cDNA文库应用领域文库应用领域v发
10、现发现SNP v克隆新基因克隆新基因v基因表达谱分析基因表达谱分析v从从EST中发掘中发掘SSR标记标记 v挖掘与病害、发育等功能相关的关键基因挖掘与病害、发育等功能相关的关键基因v开展转基因等功能研究，以改变某生物的性状。开展转基因等功能研究，以改变某生物的性状。v保护濒危珍惜生物资源，建立该生物的基因库。保护濒危珍惜生物资源，建立该生物的基因库。vEST可以作为构建分子标记连锁图谱所用的探针可以作为构建分子标记连锁图谱所用的探针普普通通cDNA文文库库构构建建基基本本流流程程 双链双链cDNAcDNA末端的磷酸化及酶切末端的磷酸化及酶切 提取提取total RNA分离分离mRNA mRNA
11、 合成一链合成一链cDNAcDNA 合成二链合成二链cDNAcDNA双链双链cDNAcDNA末端补平末端补平加接头加接头胶回收胶回收cDNA cDNA 连接连接 电转化电转化鉴定库容及插入子大小鉴定库容及插入子大小文库送检文库送检1d1d1d1d2d4d建立建立cDNA文库的特殊方法文库的特殊方法1. OkayamaBerg法法2.OkayamaBerg改进法改进法3.SMART(Switch Mechanism At the 5 end of RNA Templates)方法方法 4聚合酶链式反应法聚合酶链式反应法（PCR法）法）SMART技术：技术：Switch Mechanism At the 5end of RNA Templates 模板跳转转移机制模板跳转转移机制利用逆转录酶的末端转移酶活性，经巧妙设计而利用逆转录酶的末端转移酶活性，经巧妙设计而成为有力武器。成为有力武器。Thank you !Thank you !
