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1、第十单元现代生物科技专题专题30基因工程高考生物（浙江专用）高考生物（浙江专用）考点基因工程考点基因工程考点清单考点清单基础知识基础知识一、基因工程的含义与工具一、基因工程的含义与工具1.基因工程与遗传工程基因工程与遗传工程:基因工程是狭义的遗传工程。广义的遗传工程泛指把一种生物的遗传物质(细胞核、染色体脱氧核糖核酸等)移到另一种生物的细胞中去,并使这种遗传物质所带的遗传信息在受体细胞中表达。2.基因工程的核心是基因工程的核心是:构建重组DNA分子。3.基因工程的工具基因工程的工具(1)限制性核酸内切酶a.来源:主要是从微生物(如细菌)中分离纯化出来的。b.功能:识别并切开每条链中特定位点上的
2、两个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键。c.特点:具有专一性,表现在以下两个方面:识别DNA分子中某种特定的核苷酸序列;使每一条链中特定位点的两个核苷酸之间的磷酸二酯键断开。d.作用结果:产生粘性末端或平末端。(2)DNA连接酶功能:将末端碱基互补的2个DNA片段连接起来。(3)载体a.最常用的载体质粒实质:能够自主复制的双链环状DNA分子,是一种特殊的遗传物质,在细菌中以独立于拟核之外的方式存在。b.其他载体:噬菌体、植物病毒和动物病毒等。二、基因工程的基本操作步骤二、基因工程的基本操作步骤1.获得目的基因获得目的基因(1)目的基因:人们所需要的基因。如:人的胰岛素基因、植物的抗病基因等。(2)获取
3、方法2.形成重组形成重组DNA分子分子一般用相同的限制性核酸内切酶分别切割含有目的基因的供体DNA分子和载体(如质粒),使其产生相同的粘性末端(或平末端),然后用DNA连接酶将两者连接在一起,形成重组DNA分子。3.将重组将重组DNA分子导入受体细胞分子导入受体细胞常用的受体细胞:大肠杆菌、枯草杆菌、酵母菌和动植物细胞等。4.筛选含有目的基因的受体细胞筛选含有目的基因的受体细胞(1)筛选原因:并不是所有的细胞都接纳了重组DNA分子。(2)筛选方法举例:质粒上有抗生素如四环素的抗性基因,所以含有这种重组质粒的受体细胞就能够在有四环素的培养基上生长,而没有接纳重组质粒的细胞在这种培养基上不能生长,
4、这样就能筛选出含有重组DNA分子的受体细胞。5.目的基因的表达目的基因的表达目的基因在宿主细胞中表达,产生人们需要的功能物质。三、基因工程与遗传育种三、基因工程与遗传育种1.转基因植物转基因植物培育优点2.转基因动物转基因动物(1)含义:转入了外源基因的动物。(2)培育优点:省时、省力。名称成分用途传统方法基因工程方法胰岛素 蛋白质治疗胰岛素依赖型糖尿病从猪和羊的胰腺中提取通过大肠杆菌生产干扰素 糖蛋白治疗病毒性肝炎和肿瘤从人血液中提取通过基因工程,使人白细胞干扰素基因获得克隆和表达乙型肝炎疫苗蛋白质预防乙型肝炎通过基因工程利用酵母菌和哺乳动物细胞生产四、基因工程与疾病治疗四、基因工程与疾病治
5、疗1.基因工程药物基因工程药物2.基因治疗指的是向目标细胞中引入正常功能的基因,以纠正或补偿基因的缺陷,达到治疗的目的。五、基因工程与生态环境保护五、基因工程与生态环境保护1.利用转基因植物生产聚羟基烷酯,用于合成可降解的新型塑料。2.改造分解石油的细菌,提高其分解石油的能力。3.利用转基因微生物吸收环境中的重金属、降解有毒化合物和处理工业废水。重难突破重难突破一、基因工程的三大操作工具一、基因工程的三大操作工具1.限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(1)限制性核酸内切酶(限制酶)的作用限制酶切割时断开的是DNA分子中的磷酸二酯键(即相邻脱氧核苷酸间的键),而不是两条链之间的氢键。如图:(2)限
6、制性核酸内切酶具有专一性,表现在两个方面:识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列。切割特定序列中的特定位点。如图:2.DNA连接酶连接酶(1)DNA连接酶的作用两个来源不同的DNA用相同的限制性核酸内切酶切割,形成相同的粘性末端(或平末端)。DNA连接酶能催化磷酸与脱氧核糖之间化学键的形成,将两个DNA末端的缝隙“缝合”起来。如图:(2)几种易混淆酶的比较名称功能应用限制酶特异性地切断DNA链中的磷酸二酯键重组DNA技术DNA连接酶形成连接DNA片段之间的磷酸二酯键基因工程DNA聚合酶形成连接DNA片段与单个脱氧核苷酸之间的磷酸二酯键DNA复制RNA聚合酶形成连接RNA片段与单个核糖核苷酸之间的
7、磷酸二酯键转录和RNA复制逆转录酶作用于磷酸二酯键以RNA为模板获得DNADNA解旋酶使碱基对之间的氢键断裂DNA复制DNA水解酶使DNA分子所有磷酸二酯键断裂水解DNA3.载体的种类及作用载体的种类及作用(1)载体应具备的特征能在宿主细胞内稳定保存并大量复制。有1个或多个限制性核酸内切酶切点,以便与外源基因连接。具有某些标记基因,以便进行筛选。(2)载体的种类细菌质粒,最常用大肠杆菌质粒。噬菌体和某些动植物病毒。一般来说天然的载体往往不能满足人们的所有要求,因此人们根据不同目的和需求,对某些天然的载体进行人工改建。(3)作用一是用它作为运载工具,将目的基因送到宿主细胞中去;二是利用它在宿主细
8、胞内对目的基因进行大量复制。二、基因工程基本操作二、基因工程基本操作1.基因工程基本操作基因工程基本操作“五步曲五步曲”(1)获得目的基因序列未知:建立一个包括目的基因在内的基因文库,再从基因文库中获取。序列已知:化学方法(如逆转录法)合成或者用PCR扩增目的基因。PCR技术与DNA复制的比较PCR技术DNA复制相同点原理DNA双链复制(碱基互补配对)原料四种游离的脱氧核苷酸条件模板、酶、能量等不同点解旋方式DNA在高温下变性解旋解旋酶催化场所体外复制主要在细胞核内酶热稳定的DNA聚合酶细胞内含有的DNA聚合酶结果在短时间内形成大量的DNA片段形成整个DNA分子(2)形成重组DNA分子一般采用
9、同种限制性核酸内切酶切割质粒和目的基因,以获得相同的粘性末端(或平末端),以利于形成重组DNA分子,但有时用不同的限制性核酸内切酶处理也可以获得相同的粘性末端(或平末端)。目的基因的插入可能会破坏转基因生物原有基因的结构,影响转基因生物的正常生长,甚至致死。限制性核酸内切酶只识别双链DNA分子中特定的核苷酸序列,对RNA不起作用。用DNA连接酶连接时,可形成3种不同的连接物:目的基因载体连接物、载体载体连接物、目的基因目的基因连接物,导入受体细胞后,可利用抗性基因的差异进行筛选。生物种类 植物细胞动物细胞微生物细胞常用方法 农杆菌转化法显微注射技术Ca2+处理法受体细胞 体细胞受精卵原核细胞转
10、化过程将目的基因插入Ti质粒的T-DNA上导入农杆菌侵染植物细胞目的基因稳定维持和表达将重组DNA分子提纯取卵(受精卵)显微注射受精卵发育获得具有新性状的动物用Ca2+处理细胞使之成为感受态细胞重组DNA分子与感受态细胞混合感受态细胞吸收重组DNA分子(3)将重组DNA分子导入受体细胞(4)筛选含有目的基因的受体细胞原理:质粒上有抗生素抗性基因等标记基因。方法:利用选择培养基筛选。举例:所有受体细胞含四环素培养基活的受体细胞重组DNA分子(质粒上有四环素抗性基因)含重组DNA分子的受体细胞在实际应用中还有:a.检测是否插入目的基因,利用DNA分子杂交技术,目的基因DNA一条链(作探针)与受体细
11、胞中提取的DNA杂交,看是否有杂交带。b.检测是否转录出了mRNA,利用核酸分子杂交技术,目的基因DNA一条链(作探针)与受体细胞中提取的mRNA杂交,看是否有杂交带。(5)目的基因的表达:看到目的性状或分离到目的基因表达产物检测目的基因是否翻译成蛋白质:从转基因生物中提取蛋白质,用相应的抗体进行抗原抗体杂交。个体生物学水平的鉴定:如转基因抗虫植物是否出现抗虫性状。2.有关基因工程操作注意事项有关基因工程操作注意事项(1)基因文库中的基因保存在受体菌中。(2)原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少,有利于目的基因的复制与表达,因此常采用大肠杆菌等原核生物作为受体细胞。(3)植物细胞的全能
12、性较高,可经植物组织培养过程成为完整植物体,因此受体细胞可以是受精卵也可以是体细胞;动物基因工程中的受体细胞一般是受精卵。(4)操作工具有三种,但常用工具酶有两种,载体不是酶;在基因工程操作步骤“获得目的基因”和“形成重组DNA分子”两个过程中通常用同种限制酶,目的是产生相同的粘性末端(或平末端);DNA连接酶只在“形成重组DNA分子”操作中用到。(5)一般情况下,用同一种限制性核酸内切酶切割质粒和含有目的基因的DNA片段,但有时可用两种限制性核酸内切酶分别切割质粒和目的基因,这样可避免质粒和质粒之间、目的基因和目的基因之间的连接。(6)标记基因的种类和作用:标记基因的作用筛选、检测目的基因是
13、否导入受体细胞,常见的有抗生素抗性基因、发光基因(表达产物为带颜色的物质)等。方法限制性核酸内切方法限制性核酸内切酶的的选择方法技巧方法技巧限制酶选择的注意事项限制酶选择的注意事项(1)根据目的基因两端的限制酶切点确定限制酶的种类:应选择切点位于目的基因两端的限制酶,如图甲可选择Pst。不能选择切点位于目的基因内部的限制酶,如图甲不能选择Sma。为避免目的基因和质粒的自身环化和随意连接,也可使用不同的限制酶分别切割目的基因和质粒,如图甲也可选择用Pst和EcoR两种限制酶(但要确保质粒上也有这两种酶的切点)。(2)根据质粒的特点确定限制酶的种类所选限制酶要与切割目的基因的限制酶相一致,以确保具有相同的粘性末端(或平末端)。质粒作为载体必须具备标记基因等,所以所选择的限制酶尽量不要破坏这些结构,如图乙中限制酶Sma会破坏标记基因;如果所选酶的切点不是一个,则切割重组后可能丢失某些片段,若丢失的片段含复制起点区,则切割重组后的片段进入受体细胞后不能自主复制。
