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1、树突状细胞体外刺激对树突状细胞体外刺激对HBVHBV特异特异性细胞毒性细胞毒T T细胞影响的研究细胞影响的研究 张恒辉张恒辉何豫何豫赵鸿赵鸿朴文花朴文花刘茂昌刘茂昌席宏丽席宏丽于敏于敏王贵强王贵强北京大学第一医院感染疾病科北京大学第一医院感染疾病科北大医院感染科 张恒辉研究背景北大医院感染科 张恒辉HBV慢性感染慢性感染主要原因主要原因HBV特异细胞免疫特异细胞免疫功能的低下功能的低下T细胞细胞树突状细胞（树突状细胞（DC）慢性乙型肝炎患者慢性乙型肝炎患者DC成熟、功能成熟、功能异常异常研究背景（研究背景（1）特异性特异性CTL数量少数量少低反应低反应HBV慢性感染慢性感染主要原因主要原因HB
2、V特异细胞免疫特异细胞免疫功能的低下功能的低下T细胞细胞树突状细胞（树突状细胞（DC）慢性乙型肝炎患者慢性乙型肝炎患者DC成熟、功能成熟、功能异常异常促进促进DC成熟、恢复成熟、恢复DC的功能的功能增强增强DC激活特异性激活特异性抗病毒免疫反应抗病毒免疫反应打破免疫耐受打破免疫耐受彻底清除病毒彻底清除病毒研究背景（研究背景（1）特异性特异性CTL数量少数量少低反应低反应获得高频数、功能强获得高频数、功能强HBV特异性的特异性的CTL促进促进DC成熟，增强成熟，增强DC功能功能CpGCD40LAd-IL-12转染转染Poly（I：C）关于恢关于恢复复DCDC功能的研究功能的研究研究背景（研究背景
3、（2）研究目的v本研究通过在体外进行慢性乙型肝炎患者单核细胞的DC方向转化，并辅以聚肌胞聚肌胞Poly(I:C)刺激，增强增强DC的成熟和功能的成熟和功能。v将患者DC经HBV core18-27肽负载后，刺激病人自身的T淋巴细胞。并用Elispot法及本研究室构建的HLA-A2肽四聚体复合物检测病毒特异检测病毒特异性性T淋巴细胞的数量和功能淋巴细胞的数量和功能。研究对象和方法北大医院感染科 张恒辉研究对象研究对象v22例例HLA-A2+慢性乙型肝炎患者。慢性乙型肝炎患者。vHBeAg+患者患者16例、例、HBeAb+患者患者6例。例。HBVDNA均均104copy/ml。v排除排除HCV、H
4、AV、HDV、HEV感染。近半年感染。近半年没有接受过抗病毒治疗。没有接受过抗病毒治疗。研究方法研究方法vHLA-A2型别鉴定型别鉴定 vDC的体外培养扩增及鉴定的体外培养扩增及鉴定 v以树突状细胞为抗原递呈细胞体外诱导病毒抗以树突状细胞为抗原递呈细胞体外诱导病毒抗原特异性原特异性T细胞细胞 vElispot检测分泌检测分泌IFN-的的T细胞频数细胞频数 v MHC-肽四聚体检测肽四聚体检测HBVcore18-27肽特异性肽特异性CD8+T细胞细胞HLA-A*02型别鉴定型别鉴定 v外周血淋巴细胞标记鼠抗人外周血淋巴细胞标记鼠抗人HLA-A02单抗；单抗；v流式细胞仪检测；流式细胞仪检测；v每
5、份标本均设自身阴性对照。每份标本均设自身阴性对照。树突状细胞的体外培养扩增及鉴定树突状细胞的体外培养扩增及鉴定 v分离病人分离病人PBMC；vGM-CSF、IL-4刺激下刺激下DC培养转化；培养转化；vPoly(I:C)刺激；刺激；v通过流式细胞仪检测通过流式细胞仪检测DC的的HLA-DR、CD80、CD86、CD83、CD14等表面分子表达，进行功等表面分子表达，进行功能及成熟度的鉴定。能及成熟度的鉴定。以以DCDC为抗原递呈细胞体外诱导为抗原递呈细胞体外诱导HBVHBV抗抗原特异性原特异性T T细胞细胞 v培养成熟培养成熟DC负载负载HBV核心肽（核心肽（HBVcore18-27FLPSD
6、FFPSV）；）；vDC与自体与自体T细胞共培养细胞共培养48-72h；v单纯单纯IL-2维持未经自身树突状细胞刺激维持未经自身树突状细胞刺激T细胞组细胞组为对照。为对照。 ElispotElispot检测分泌检测分泌IFN-IFN-的的T T细胞频数细胞频数 v封闭封闭v种板种板v孵育：孵育：37，5%CO2孵育孵育15-20h；v显色显色v计数：计数：CTLIMMUNOSPOT分析仪计数，取两分析仪计数，取两复孔的平均值复孔的平均值 MHC-MHC-肽四聚体检测肽四聚体检测 HBVcore18-27 HBVcore18-27 肽特异肽特异性性CD8 CD8 + + T T 细胞细胞vPE-
7、HLA-A0201/HBVcore18-27tetramer和和FITC-鼠抗人鼠抗人CD8标记；标记；v流式细胞仪检测；流式细胞仪检测；v慢性乙型肝炎患者，采用慢性乙型肝炎患者，采用HLA-0201/HCV四聚四聚体标记作为阴性对照；体标记作为阴性对照；统计学处理统计学处理 v实验数据以实验数据以 xSD表示。用表示。用SPSS10.0软件进行软件进行统计分析，组间比较用配伍组方差分析。统计分析，组间比较用配伍组方差分析。 结结果果北大医院感染科 张恒辉DCDC的扩增、表型鉴定及的扩增、表型鉴定及Poly (I:C)Poly (I:C)对其表面对其表面分子表达的影响分子表达的影响组别例数例数
8、HLA-DR+CD80+CD83+CD86+CD14+CD11c+未加未加Poly(I:C)组2283.66.923.46.619.32.284.26.38.42.895.53.1Poly(I:C)作用作用组2288.87.839.38.6*30.75.6*85.43.23.72.3*93.42.9慢性乙型肝炎病人慢性乙型肝炎病人DC经经Poly(I:C)作用前后表面分子表达作用前后表面分子表达的比较的比较*表示差异有统计学意义（表示差异有统计学意义（P0.01）v经经Poly(I:C)刺激后：刺激后：CD80、CD83表达明显上调。表达明显上调。vCD14的表达明显下降的表达明显下降。Pol
9、y(I:CPoly(I:C) )对对DCDC表面分子表达的影响表面分子表达的影响ElispotElispot检测检测HBVHBV特异性的特异性的分泌分泌IFN- IFN- 的的CTLCTL细胞频数的比较细胞频数的比较 1231.慢乙肝病人体外经慢乙肝病人体外经IL-2维持生长的维持生长的T细胞；细胞；2.经自体经自体DC刺激后的刺激后的T细胞；细胞；3.DC经经Poly（I:C）作用后刺激的）作用后刺激的T细胞细胞树突状细胞激活的分泌树突状细胞激活的分泌IFN-IFN-的的CTLCTL细胞的频数分布图细胞的频数分布图 T：慢性乙型肝炎患者体外经：慢性乙型肝炎患者体外经IL-2维持生长的维持生长
10、的T细胞；细胞；DC-T：经树突状细胞刺激后的：经树突状细胞刺激后的T细胞；细胞；PDC-T：树突状细胞经：树突状细胞经Poly（I:C）作用后刺激的）作用后刺激的T细细（“”表示均数）表示均数）ElispotElispot检测结果说明检测结果说明v病人病人T细胞在经自体细胞在经自体树突状细胞刺激后与未刺树突状细胞刺激后与未刺激前相比，分泌激前相比，分泌IFN-的的CTL细胞频数均值由细胞频数均值由16上升为上升为46，约为，约为2.9倍倍；v发现经发现经Poly（I:C）作用后的树突状细胞所活化）作用后的树突状细胞所活化的特异性分泌的特异性分泌IFN-的的T细胞频数明显升高，均细胞频数明显升
11、高，均值为值为98，和未经树突状细胞刺激组和树突状细，和未经树突状细胞刺激组和树突状细胞刺激组相较，分别升高胞刺激组相较，分别升高6.1和和2.1倍倍。Tetramer Tetramer 流式细胞技术检测流式细胞技术检测HBVcore18-27 HBVcore18-27 特异性特异性CD8 CD8 + + T T 细胞结果细胞结果 vPE-HLA-A0201/HBVcore18-27tetramer和和FITC-鼠抗人鼠抗人CD8标记标记T细胞，行流式检测。细胞，行流式检测。v以淋巴细胞设门，收集门内细胞以淋巴细胞设门，收集门内细胞50,000个个,右上象右上象限细胞数限细胞数/右上及右下象限
12、细胞数之和即为抗原特右上及右下象限细胞数之和即为抗原特异性异性CTL占占CD8+细胞数比例（图中右上象限的百细胞数比例（图中右上象限的百分比值）。分比值）。1PE-羊抗鼠羊抗鼠IgG/FITC-鼠抗人鼠抗人CD8标记的标记的T细胞；细胞；2.IL-2维持的自身维持的自身T细胞；细胞；3.与树突状细胞作与树突状细胞作用的用的T细胞；细胞；4.与与poly（IC）刺激后的树突状刺激后的树突状细胞作用的细胞作用的T细胞细胞图图3. tetramer3. tetramer检测特异检测特异CD8 + T CD8 + T 细胞的频数分布图细胞的频数分布图 Control：非相关肽四聚体标记的：非相关肽四聚
13、体标记的T细胞；细胞；T：IL-2维持的自身维持的自身T细胞；细胞；DC-T：与树突状细胞作用的：与树突状细胞作用的T细胞；细胞；PDC-T：与：与poly（IC）刺激后的树突状细胞作用的）刺激后的树突状细胞作用的T细胞细胞。Tetramer Tetramer 结果说明结果说明v患者患者T细胞在经自体细胞在经自体树突状细胞刺激后与未刺激前树突状细胞刺激后与未刺激前相比，相比，HBVcore18-27肽特异的肽特异的CTL频数均值由频数均值由0.77%上升至上升至1.92%，提高约，提高约2.5倍倍，差异均有统，差异均有统计学意义（计学意义（P0.001）。）。v经经Poly（I:C）刺激的树突
14、状细胞活化后，）刺激的树突状细胞活化后，HBVcore18-27表位特异性表位特异性CTL的频数均值上升为的频数均值上升为3.49%，分别为前，分别为前2组的组的4.5和和1.8倍倍，差异均有统，差异均有统计学意义（计学意义（P值均小于值均小于0.001）。）。讨讨 论论讨论（讨论（1）v树突状细胞能激活幼稚树突状细胞能激活幼稚T细胞，调节细胞，调节T、B淋巴淋巴细胞的功能；在病毒抗原摄取、递呈及特异性细胞的功能；在病毒抗原摄取、递呈及特异性激活抗病毒免疫反应中发挥重要的作用，激活抗病毒免疫反应中发挥重要的作用，是抗是抗感染免疫的中心环节感染免疫的中心环节。 vHBV急性感染时：多克隆、高反应
15、性的病毒特急性感染时：多克隆、高反应性的病毒特异性异性CTL可迅速、彻底清除病毒；可迅速、彻底清除病毒；vHBV慢性感染时：单一克隆、弱反应性的病毒慢性感染时：单一克隆、弱反应性的病毒特异性特异性CTL。 讨论（讨论（2）v聚肌胞聚肌胞Poly(I:C)是一种是一种型和型和型干扰素的强诱生剂。型干扰素的强诱生剂。vPoly（I:C）能够有效地诱导体外单核细胞转化的树突状）能够有效地诱导体外单核细胞转化的树突状细胞成熟，并维持树突状细胞的成熟状态细胞成熟，并维持树突状细胞的成熟状态。 CD83：DC成熟；行使功能CD83表达 DC成熟及功能改善 CD14：单核细胞的特异性分子标记CD14表达 D
16、C分化程度改善讨论（讨论（3）MHC-肽四聚体染色法检测肽四聚体染色法检测HBVcore18-27特异性特异性CTL的数量：的数量： 高特异性、敏感性 对特异性CTL进行定性、定量分析 用于感染、肿瘤、自身免疫性疾病等的细胞免疫学研究和治疗效果监测。Elispot 检测活化的分泌IFN-的有功能的病毒特异性T细胞两种技术结合两种技术结合 能够更准确、客观地评价体外转化的树突状细胞活化特异性T淋巴细胞的能力。结结论论北大医院感染科 张恒辉v慢性乙型肝炎患者T细胞在体外经自身负载HBV core18-27抗原肽的DC刺激后，可获得可获得高频数、功能较强的高频数、功能较强的HBV特异性的特异性的CTL；v在DC体外转化的过程中加入聚肌胞作为刺加入聚肌胞作为刺激剂激剂可明显促进DC的成熟、增强DC功能，在负载HBV core18-27抗原肽后与自身T细胞作用可获得频数更高及功能更强的病毒特异可获得频数更高及功能更强的病毒特异性的性的CTL。 Thank you!
