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1、重组重组质粒的酶切鉴定（质粒的酶切鉴定（p82）紫外分光光度法检测紫外分光光度法检测DNA含量（含量（p39）实验内容2.2.限制性内切酶的酶切鉴定限制性内切酶的酶切鉴定(P82)(P82)3.3.定性鉴定定性鉴定:DNA:DNA的琼脂糖凝胶电的琼脂糖凝胶电泳泳4.4.定量检测：定量检测：DNADNA的紫外分光光度法的紫外分光光度法测定测定(P39)(P39)1.1.质粒质粒DNADNA的提取与纯化的提取与纯化(P70(P70碱法碱法) )一、限制性内切酶切割重组质粒一、限制性内切酶切割重组质粒 1 1 关于限制性核酸内切酶关于限制性核酸内切酶 （restriction endonucleas
2、erestriction endonuclease）1.1 1.1 定义定义 能在特异位点（酶切位点）上催化双链能在特异位点（酶切位点）上催化双链DNADNA分子分子的断裂的断裂, ,产生相应的限制性产生相应的限制性DNADNA片段。片段。 主要存在于细菌体内。主要存在于细菌体内。 切割不同来源的切割不同来源的DNADNA分子将产生特征性限制性酶分子将产生特征性限制性酶切图谱，具有重大应用价值（切图谱，具有重大应用价值（“分子手术刀分子手术刀”）。）。31.3 1.3 作用作用 与与甲甲基基化化酶酶共共同同构构成成细细菌菌的的限限制制修修饰饰系统，限制外源系统，限制外源DNA， 保护自身保护自
3、身DNA。1.2 1.2 分类分类、（基因工程技术中常用（基因工程技术中常用型，仅含内切酶特性）型，仅含内切酶特性）第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。1.4 1.4 命名命名Hin d 属属 系系 株株 序序Haemophilus influenzae d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d株的第三种酶株的第三种酶2 BamHI 2 BamHI 、HindHind酶切质粒及鉴定
4、酶切质粒及鉴定2.1 2.1 实验原理：实验原理： 利用限制性内切酶特异的识别利用限制性内切酶特异的识别DNADNA特异的特异的核苷酸序列，并切割核苷酸序列，并切割DNA,DNA,产生一定长度的产生一定长度的DNADNA片段，通过电泳对酶切前后产物分析可以鉴片段，通过电泳对酶切前后产物分析可以鉴别目的基因（重组质粒别目的基因（重组质粒DNADNA）65-G A A T T C-33-C T T A A G-5BamHI5-A A G C T T-3 3-T T C G A A-5 Hind III重组质粒重组质粒BamHIHind III双酶切双酶切电泳检测电泳检测PUC119（3.2Kb）U
5、6启动子（256bp）U6启动子（256bp） 琼脂糖凝胶板的制备琼脂糖凝胶板的制备（封板、制备（封板、制备1%凝胶、倒胶、插梳、凝固后拔梳）凝胶、倒胶、插梳、凝固后拔梳）将胶置于电泳槽，倒上将胶置于电泳槽，倒上TAE缓冲液缓冲液在酶切质粒在酶切质粒DNA样品液样品液 20 l 中加入中加入 4 l上样缓冲液，混匀上样缓冲液，混匀在未酶切质粒在未酶切质粒DNA样品液样品液 10 l 中加入中加入 2 l上样缓冲液，混匀上样缓冲液，混匀酶切质粒酶切质粒DNA样品液上样样品液上样20 l，未酶切样品上样，未酶切样品上样10 l按此顺序上样：按此顺序上样：Marker 10 ul，酶切样品，酶切样品
6、1，2，3，4，5，6，未酶切对照，未酶切对照 电泳（电泳（100 V, 1 h）紫外灯下检测紫外灯下检测3 3 实验步骤实验步骤重组质粒重组质粒BamHIHind III双酶切双酶切电泳检测电泳检测5-G A A T T C-33-C T T A A G-5BamHI5-A A G C T T-3 3-T T C G A A-5 Hind IIIPUC119（3.2Kb）U6启动子（256bp）U6启动子（256bp）电泳结果分析电泳结果分析M：Marker1：酶切样品：酶切样品12：酶切样品：酶切样品23：酶切样品：酶切样品34：未酶切质粒：未酶切质粒M321600bp200bp100bp
7、800bp1Kb400bp300bp41.5Kb二、紫外分光光度法检测二、紫外分光光度法检测DNA浓度浓度1 1 分光光度技术分光光度技术1.1 1.1 概述概述 分分光光光光度度技技术术是是利利用用物物质质特特有有的的吸吸收收光光谱谱对其进行定性、定量分析的实验技术对其进行定性、定量分析的实验技术。131.2 1.2 特点特点 灵敏度高：测定下限可达灵敏度高：测定下限可达10105 510106 6mol/Lmol/L准确度高：能够满足微量组分的测定要求，相对误准确度高：能够满足微量组分的测定要求，相对误差差2 25 5（1 12 2）; ;操作简便快速操作简便快速; ;应用广泛。应用广泛。
8、142 2 原理原理2.1 2.1 有关光学原理有关光学原理2.1.1 2.1.1 光的本质是电磁波光的本质是电磁波c 传播速度传播速度 频率频率 c / 波长波长15光谱分区16远紫外远紫外远紫外远紫外近紫外近紫外近紫外近紫外可见光可见光可见光可见光 近红外近红外近红外近红外中红外中红外中红外中红外 远红外远红外远红外远红外（真空紫外）（真空紫外）（真空紫外）（真空紫外）10nm200nm 200nm 380nm380nm 780nm780 nm 2.5 m2.5 m 50 m50 m 300 m2.1.2 2.1.2 吸收光谱吸收光谱 在光源和棱镜之间放上某种物质的溶液，在光源和棱镜之间放
9、上某种物质的溶液，光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而光源发射光谱中某些波长的光因溶液吸收而消失，这种被溶液吸收的光谱称为该消失，这种被溶液吸收的光谱称为该溶液的溶液的吸收光谱吸收光谱。17苯苯和和甲苯甲苯在环己烷中的吸收光谱在环己烷中的吸收光谱苯苯(254nm)甲苯甲苯(262nm)A 230 250 270 182.1.3 2.1.3 入射光、透过光入射光、透过光入射光反射光分散光吸收光透过光用蒸馏水或溶剂作为“空白”校正反射光、分散光，得：入射光（I0）吸收光透过光（It）192.2 2.2 光吸收基本定律光吸收基本定律: Lambert-Beer: Lambert-Beer定律定律2
10、0透光度百分比透光度百分比 T T: : T = It / I0100%光密度光密度 D D，是光被吸收的程度，是光被吸收的程度: : D = lg1/T = lg(I0/It)21ItI0LdxI I-dIs朗伯定律朗伯定律(1760)(1760) D=lg(I0/It)=k1L 比尔定律比尔定律(1852)(1852) D=lg(I0/It)=k2CLambert-Beer定律定律 DK C L 吸光度吸光度 摩尔消光系数摩尔消光系数 吸收物质的光径吸收物质的光径（cm） 溶液浓度（溶液浓度（mol/L）222.3 2.3 分光光度法分析的依据：分光光度法分析的依据：物质对光是有选择的吸收
11、，其吸收光谱取物质对光是有选择的吸收，其吸收光谱取决于物质的结构，这就是分光光度法决于物质的结构，这就是分光光度法定性定性分析的依据；分析的依据；其吸收光谱的强度与物质的浓度有关，这其吸收光谱的强度与物质的浓度有关，这是分光光度法是分光光度法定量定量分析的依据。分析的依据。232.4 2.4 分光光度计的基本部件分光光度计的基本部件光光 电电242.4.1 2.4.1 光源光源分光光度计上常用的光源有两种：分光光度计上常用的光源有两种： 近紫外光区近紫外光区 可见光区可见光区 钨丝灯钨丝灯 近红外光近红外光 紫外光区紫外光区 氢灯、氘灯氢灯、氘灯252.4.2 2.4.2 单色器单色器是把混合
12、光波分解为单一波长光的装置。是把混合光波分解为单一波长光的装置。棱镜棱镜：光波通过棱镜时，不同波长的光折：光波通过棱镜时，不同波长的光折射率不同，折射率与波长成负相关。射率不同，折射率与波长成负相关。衍射光栅衍射光栅: :在石英或玻璃的表面刻划许多平在石英或玻璃的表面刻划许多平行线，通过光的干涉和衍射，形成光谱。行线，通过光的干涉和衍射，形成光谱。狭缝狭缝: :由一对隔板在光通路上形成的缝隙，由一对隔板在光通路上形成的缝隙，通过调节缝隙的大小调节入射单色光的强度，通过调节缝隙的大小调节入射单色光的强度，以适应检测器的需要。以适应检测器的需要。26棱镜：棱镜：依据不同波长光通过棱镜时折射率不同依
13、据不同波长光通过棱镜时折射率不同27入射狭缝入射狭缝准直透镜准直透镜棱镜棱镜聚焦透镜聚焦透镜出射狭缝出射狭缝白光白光红红紫紫1 12 2800 600 5004002.4.3 2.4.3 吸收池吸收池或称比色杯、比色皿、比色池，是用来盛装或称比色杯、比色皿、比色池，是用来盛装被测溶液和决定透光液层厚度的器件。被测溶液和决定透光液层厚度的器件。一般由玻璃或石英制成，一般由玻璃或石英制成，注意：注意：a. a. 与光束垂直；与光束垂直； b. b. 规格相同；规格相同； c. c. 清洁。清洁。282.4.4 2.4.4 检测器检测器光光 电，并逐级放大。电，并逐级放大。2.4.5 2.4.5 测
14、量装置测量装置电流表、记录器和数字示值读数单元电流表、记录器和数字示值读数单元。 29722722型分光光度计结构方框图型分光光度计结构方框图光光源源吸收池吸收池检测系统检测系统分光分光系统系统302.5 2.5 紫外分光光度法检测紫外分光光度法检测DNADNA的原理的原理原理：核酸分子含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，原理：核酸分子含有嘌呤环和嘧啶环的共轭双键，在在260nm处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核处有特异的紫外吸收峰，其吸收强度与核酸浓度成正比。酸浓度成正比。优点：简单、快速、灵敏、样品可以回收。优点：简单、快速、灵敏、样品可以回收。缺点：有一定的误差（原因）；受蛋白类物质干扰。缺
15、点：有一定的误差（原因）；受蛋白类物质干扰。31产生误差的原因：产生误差的原因： 1.1.单色性不纯的影响；单色性不纯的影响； 2.2.杂散光的影响；杂散光的影响； 3.3.比色皿的影响；比色皿的影响； 4.4.温度、温度、pHpH值的影响；值的影响； 5.5.吸光度读数时的误差。吸光度读数时的误差。323 3 实验步骤实验步骤1.1.用实验室用实验室DNADNA标准品，用标准品，用TETE稀释稀释10001000倍；倍；2.2.TETE作作为为空空对对照照, ,在在波波长长260nm260nm（检检测测核核酸酸）、280nm280nm（检检测测蛋蛋白白质质）、310nm310nm（检测背景）
16、处分别测标准（检测背景）处分别测标准DNADNA样品的样品的ODOD值值（每次换波长先调零：将空对照透射比调为（每次换波长先调零：将空对照透射比调为100%100%，吸光度调为，吸光度调为0 0）3. 3. 根据根据ODOD值计算值计算DNADNA浓度（浓度（ g/mlg/ml） 单链DNAssDNA=3333(OD(OD260260ODOD310310) )稀释倍数 双链DNAdsDNA=5050(OD(OD260260ODOD310310) )稀释倍数4. DNA4. DNA的纯度鉴定的纯度鉴定 ODOD260260/ OD/ OD280280=1.8 =1.8 （RNARNA为为2 .0
17、2 .0） 1.8 1.8 可能有可能有RNARNA污染污染 1.8 1.8 可能有蛋白质污染可能有蛋白质污染33测定标准DNA液的吸光度1.1.预热预热2.2.设定波长设定波长3.3.置入空白置入空白4.4.置标尺为透射比，打开式样盖，按置标尺为透射比，打开式样盖，按0%0%键键5.5.关上式样盖，将空对照置入光路，按关上式样盖，将空对照置入光路，按 100%100%键键6.6.置标尺为吸光度，空对照吸光度为置标尺为吸光度，空对照吸光度为0 07.7.样品置入光路样品置入光路8.8.读出数据读出数据以以上上步步骤骤重重复复3次次：在在波波长长260nm（检检测测核核酸酸）、280nm（检检测
18、测蛋蛋白白质质）、310nm（检检测测背背景景）处处分分别别测测标标准准DNA样样品品的的OD值，每次以值，每次以TE作为空对照调零，最后计算标准品的浓度作为空对照调零，最后计算标准品的浓度本周作业本周作业结合基因信息传递的原理，描述怎样用基结合基因信息传递的原理，描述怎样用基因工程的方法高效表达人胰岛素，怎样鉴因工程的方法高效表达人胰岛素，怎样鉴定所表达出的蛋白质产物？在整个过程中定所表达出的蛋白质产物？在整个过程中需运用哪些分子医学技术？需运用哪些分子医学技术？下周：自主学习及作业下周：自主学习及作业查阅查阅5-85-8篇有关分子医学或分子生物学计数篇有关分子医学或分子生物学计数的综述性论文。写出的综述性论文。写出3 3种你较熟悉的分子医种你较熟悉的分子医学技术，论述其技术原理和应用价值。学技术，论述其技术原理和应用价值。（写在实验记录本上，同时列出你所阅读（写在实验记录本上，同时列出你所阅读的论文目录的论文目录刊物名称、期号、页码）刊物名称、期号、页码）
