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1、曲霉菌实时荧光定量曲霉菌实时荧光定量PCR检检测体系的建立测体系的建立研究生研究生导导 师师学学 院院 Theestablishmentofreal-timefluorescentquantitativePCRassaysforthedetectionofAspergillus221. 1. 研究背景研究背景2. 2. 研究目的研究目的3. 3. 实验路线实验路线4. 4. 第一部分第一部分曲霉菌标准株的培养与曲霉菌标准株的培养与DNA提取提取5. 5. 第二部分第二部分 曲霉菌曲霉菌FQ-PCRFQ-PCR检测体系的建立及评价检测体系的建立及评价6. 6. 结果与讨论结果与讨论7. 7. 全
2、文结论全文结论目目 录录33研究背景研究背景44 研究背景研究背景曲霉菌属曲霉菌属( (aspergillus ) )： 属丝状真菌，是属丝状真菌，是一种常见的条件致病性真菌，好发于一种常见的条件致病性真菌，好发于免疫低下及缺陷的人群免疫低下及缺陷的人群 在免疫缺陷、恶性肿瘤、器官移植在免疫缺陷、恶性肿瘤、器官移植 患者中的感染率呈上升趋势患者中的感染率呈上升趋势 YuY,AmJperinatol,2013MelladoE.RevlberoamMicol,2013Armstrong-JamesD.Trendsinmicrobiology,2014KauffmanCA.Fungalinfecti
3、ons.20135研究背景研究背景地方性真菌地方性真菌1%地方性真菌地方性真菌3.5%19901990年年-1999-1999年年20002000年年-2008-2008年年leukemiapatients,M.D.AndersonCancercenter,CID,2010,50:405-15杨尚伦.急性淋巴细胞白血病真菌感染临床特点分析J.实用癌症志,2014(9):1182-1184.20082008年年-2013-2013年年66 研究背景研究背景侵袭性曲霉菌病（侵袭性曲霉菌病（InvasiveAspergillosis,IA）：）：是感染曲霉菌所引起的一种慢性霉菌病是感染曲霉菌所引起的
4、一种慢性霉菌病最常见的致病性曲霉菌：烟曲霉菌、黄曲霉菌最常见的致病性曲霉菌：烟曲霉菌、黄曲霉菌土曲霉菌、黑曲霉菌土曲霉菌、黑曲霉菌ArvanitisM.ClinicalInfectiousDiseases,2015Kwon-ChungKJ.PLoSPathog.201377 研究背景研究背景培培 养养直接涂直接涂片镜检片镜检影像学影像学GMGM实验实验组织病组织病理理FQ-PCR曲曲霉霉菌菌辅辅助助检检查查方方法法直接涂片直接涂片和培养和培养阳性率低阳性率低取材有创、取材有创、困难困难真菌感染真菌感染诊断的研诊断的研究热点究热点缺乏特异性，缺乏特异性，特征性表现特征性表现出现晚出现晚灵敏性、特
5、异性高，灵敏性、特异性高，但易受影响，出现假但易受影响，出现假阳性及假阴性阳性及假阴性8FQ-PCRFQ-PCR技术在病毒感染的诊断检查技术方面已经成熟技术在病毒感染的诊断检查技术方面已经成熟目前没有标准的用于临床的曲霉菌目前没有标准的用于临床的曲霉菌FQ-PCRFQ-PCR检测试剂盒检测试剂盒（CFDACFDA检索）检索）前期已成功建立了念珠菌及新型隐球菌实时荧光定量前期已成功建立了念珠菌及新型隐球菌实时荧光定量PCRPCR检测体系检测体系8 研究背景研究背景LauAMethodsMolBiol,2013AittakorpiA.Journalofclinicalmicrobiology,20
6、129建立曲霉菌建立曲霉菌实时荧光定量实时荧光定量PCRPCR检测体系检测体系，关键在于，关键在于曲曲霉菌霉菌DNA的提取的提取和和特异性引物探针的设计特异性引物探针的设计研究背景研究背景1010研究背景研究背景曲霉菌曲霉菌DNADNA提取方法提取方法史俊艳.临床常见曲霉菌体外药物敏感性及分子生物学鉴定方法研究D.中国协和医科大学,2010.Klimek-OchabM.FoliaMicrobiologica,20111111 研究背景研究背景曲霉菌曲霉菌DNADNA提取方法的选取提取方法的选取 物理方法物理方法液氮研磨法液氮研磨法：次之，已有商品化试剂盒：次之，已有商品化试剂盒玻璃珠机研磨法：
7、最佳，但耗时长玻璃珠机研磨法：最佳，但耗时长超声波降解法超声波降解法化学方法化学方法CTAB缓冲液加微波法冲液加微波法酶消化法酶消化法：快速有效：快速有效高渗震扰法高渗震扰法Klimek-OchabM.FoliaMicrobiologica,2011RittenourWR.JournalofEnvironmentalMonitoring,2012OConnorL.US20110311969P.201112理论理论18SrDNA、28SrDNA、5.8SrDNA、ITS1、ITS2实际实际A.fumigatuseasLgene、A.flavusaflEgene、A.terreusCBMAI019
8、3gene、A.nigeralpha-1,3-glucansynthasegene研究背景研究背景GadeL,EukaryotCell,2013OgawaM.GraefesArchClinExpOphthalmol,2012RobinsonSL.Mycologia,2012YuquanX.Applied&EnvironmentalMicrobiology,2013扩增靶序列的选取扩增靶序列的选取1.1.探针不保守探针不保守 2.2.引引物物TmTm值值不不达达要求要求 1313初步设计合成的四种曲霉菌引物探针序列（每种初步设计合成的四种曲霉菌引物探针序列（每种2套）套）菌菌种种引引物物探探针针
9、序序列列Tm值值()A.fumigatus1F：CCTCCAGCCAAACCTGAACTTP：GGCACCAGAACCTCCCGCTGAAAATGR：TTCGTCATTGTTTAGAGCCACCT60.167.460.2A.fumigatus2F：AGCCTCGGGATGTGGTTCAP：CTGGACCCATGACCAATCTTCTGTGTGR：TCGTCGGTCACTTTCCTTGC61.963.362.5A.flavus1F：TGGGCTGTTTTGCTGTATGGTTP：AATTCGTCTCATCAAAGAGGCATCCTCGCR：TGCTGAAGGACTAAAAGGACAAGG62.1
10、64.660.3A.flavus2F：ATCCGTCGCCTCCCATCTTP：AGCCACTGGCAGAAGGAAGCACTTCR：CTTCTCGCTCTTCGTTCTACTCG60.667.959.0A.terreus1F：ACGCACTCTTCGTCACAACCP：GCTCGCAAGCCTCTGCTGCCTR：CCCAACATACCCTTTCCACCC61.168.459.4A.terreus2F：GGACCAAGTGTAAGTCACCCAATA61.9P：CAACCATCCCGGTCCGTTAGAGC63.4R：ACGGCAACCAACGACGAG59.1A.niger1F：GCCCA
11、ACCCTGACCCAACT65.9P：GATACGGCGGCCCTAGAGGATACT67.1R：TAGACCAGCGACCGACGAAC61.3A.niger2F：TCACCGCTGCTGTTCTTGC60.9P：CATGCCCGGTGGCTCTCCTTCC68.5R：CACTTGTCTTCGGCCTGCTT60.4研究背景研究背景1414研究目的研究目的寻找曲霉菌寻找曲霉菌DNA提取方提取方法法设计特异性设计特异性引物探针引物探针建立曲霉建立曲霉菌菌FQ-PCR检测检测体系体系15课题来源课题来源湖南省科技厅科技计划项目（湖南省科技厅科技计划项目（2013FJ60282013FJ6028
12、）儿童血液肿瘤疾病侵袭性真菌感染的）儿童血液肿瘤疾病侵袭性真菌感染的PCRPCR检测研究检测研究湖南省科技厅科技计划项目（湖南省科技厅科技计划项目（2013FJ60282013FJ6028）儿童血液肿瘤疾病侵袭性真菌感染的）儿童血液肿瘤疾病侵袭性真菌感染的PCRPCR检测研究检测研究湖南省科技厅科技计划项目（湖南省科技厅科技计划项目（2013FJ60282013FJ6028）儿童血液肿瘤疾病侵袭性真菌感染的）儿童血液肿瘤疾病侵袭性真菌感染的PCRPCR检测研究检测研究湖南省科技厅科技计划项目湖南省科技厅科技计划项目（2013FJ6028）儿童血液肿瘤疾病侵袭性真）儿童血液肿瘤疾病侵袭性真菌感染
13、的菌感染的PCR检测研究检测研究1616实验线路实验线路17曲霉菌标准株的接种及培养曲霉菌标准株的接种及培养制备提取制备提取DNADNA的标本的标本200mg左右的左右的固体固体组织105个孢子个孢子/ml的混悬液的混悬液液氮研磨法液氮研磨法一步结合加热法一步结合加热法下载曲霉菌特异性序列下载曲霉菌特异性序列设计引物探针并设计引物探针并Blast对比对比筛选引物探针筛选引物探针建立的荧光定量建立的荧光定量PCRPCR检测体系，并进行重复性、特异性、灵敏性评估检测体系，并进行重复性、特异性、灵敏性评估1.1.分光光度计进行比较分光光度计进行比较2.2.荧光定量荧光定量PCRPCR进行比较进行比较
14、引物探针送上海合成引物探针送上海合成1818第一部分第一部分 曲霉菌标准株的培养与曲霉菌标准株的培养与 DNADNA提取方法的比较提取方法的比较1919材料与方法材料与方法20实验材料实验材料实验菌株实验菌株真菌标准株：烟曲霉真菌标准株：烟曲霉(CGMCC3.5305)、黄曲霉、黄曲霉(CGMCC3.5306)、土曲霉、土曲霉(CGMCC3.4341)、黑曲霉、黑曲霉(CGMCC3.4335)购买于中国通微生物菌种保藏管理中心购买于中国通微生物菌种保藏管理中心 主要试剂主要试剂 一步法结合加热法一步法结合加热法DNA提取试剂盒：湖南圣湘生物有限公司提取试剂盒：湖南圣湘生物有限公司 E.Z.N.
15、A. TM Fungal DNA Mini Kit(真菌真菌DNA提取试剂盒提取试剂盒)：OMEGA公司公司 2021实验方法实验方法 1.SDA培养基培养曲霉菌培养基培养曲霉菌2.制备制备DNA提取标本及提取提取标本及提取DNA3.分光光度计检测两种方法的分光光度计检测两种方法的DNA浓度及浓度及OD值值4.荧光定量荧光定量PCR比较两种方法，观察曲线比较两种方法，观察曲线 5.利用利用SPSS19.0SPSS19.0统计软件分析不同方法提取统计软件分析不同方法提取DNADNA扩增扩增的效果的效果 212222实验结果与讨论实验结果与讨论2323不同曲霉菌在不同曲霉菌在SDA培养基上生长形态
16、培养基上生长形态烟烟曲曲霉霉菌菌黄黄曲曲霉霉菌菌土土曲曲霉霉菌菌黑黑曲曲霉霉菌菌结果与讨论：结果与讨论：1.1.曲霉菌的培养曲霉菌的培养2424不同曲霉菌光镜下菌落形态不同曲霉菌光镜下菌落形态烟烟曲曲霉霉菌菌（ X100 ）黄黄曲曲霉霉菌菌（ X100 ）土土曲曲霉霉菌菌（ X100 ）黑黑曲曲霉霉菌菌（ X40 ）结果与讨论：结果与讨论：1.1.曲霉菌的培养曲霉菌的培养2525生生长速度速度肉眼形肉眼形态肉眼肉眼颜色色镜下形下形态烟曲霉菌烟曲霉菌3-4天天见色色素素扁平状扁平状深浅不同深浅不同的的绿色色烧瓶状瓶状黄曲霉菌黄曲霉菌3-4天天见色色素素褶褶皱呈呈脑回状回状黄黄绿色色球型或近球型或
17、近球型球型土曲霉菌土曲霉菌2-3天天见色色素素扁平状扁平状黄白色黄白色半球形半球形黑曲霉菌黑曲霉菌3-4天天见色色素素褶褶皱呈呈脑回状回状黑色黑色球型或近球型或近球型球型肉眼观察肉眼观察SDA培养基上四种的菌落形态及颜色培养基上四种的菌落形态及颜色结果与讨论：结果与讨论：1.1.曲霉菌的培养曲霉菌的培养2626结果与讨论：结果与讨论：1.1.曲霉菌的培养曲霉菌的培养曲霉菌培养的污染问题曲霉菌培养的污染问题因空气中广泛存在各种霉菌孢子，因空气中广泛存在各种霉菌孢子，接种时若培养基长期暴露在空气中，接种时若培养基长期暴露在空气中，则容易被污染则容易被污染同时高浓度培养的标准株若孢子纷同时高浓度培养
18、的标准株若孢子纷飞可对实验室造成灾难性的损害，飞可对实验室造成灾难性的损害，所以曲霉菌的接种及标本的制备必所以曲霉菌的接种及标本的制备必须在至少须在至少2级生物安全柜中进行，于级生物安全柜中进行，于接种前紫外灯照射半小时，接种后接种前紫外灯照射半小时，接种后至少照射至少照射2小时小时2727表：分光光度计测量液氮研磨法提取的表：分光光度计测量液氮研磨法提取的DNA纯度和纯度和OD值值菌种浓度(ng/ul)OD260/OD280A.fumigatus2391.84A.flavus3121.91A.terreus2781.73A.niger2961.80均值281.11.82参考值200-5001
19、.7-1.9注：一步结合加热法提取的注：一步结合加热法提取的DNA量少，低于分光光度计检测的下限，未量少，低于分光光度计检测的下限，未能检测出能检测出OD值，值，但两者样本的基础组织量不同，不具有可比性但两者样本的基础组织量不同，不具有可比性结果与讨论：结果与讨论：2.DNA2.DNA提取方法的比较提取方法的比较2828结果与讨论：结果与讨论：2.DNA2.DNA提取方法的比较提取方法的比较液氮研磨法与一步结合加热法提取液氮研磨法与一步结合加热法提取DNA行实行实时荧光定量时荧光定量PCR的比较的比较液氮研磨法液氮研磨法一步结合加热法一步结合加热法扩增曲线均为扩增曲线均为“S”型型2929结果
20、与讨论：结果与讨论：2.DNA2.DNA提取方法的比较提取方法的比较方法方法液氮研磨法液氮研磨法一步一步结合加合加热法法均均值31.7332.07标准准误1.931.93t值-0.124P0.903两种两种DNA提取方法提取方法Ct值的比较值的比较P P0.050.05，差异无统计学意义，即两种方法提取，差异无统计学意义，即两种方法提取DNADNA进行荧光定量进行荧光定量PCRPCR检测无明显统计学差异检测无明显统计学差异3030液氮研磨法液氮研磨法一步结合加热法一步结合加热法来源来源商品化的商品化的试剂盒盒圣湘公司开圣湘公司开发中的中的试剂盒盒优点点提取出的提取出的DNA浓度、度、纯度度高、
21、完整性好高、完整性好操作操作简单、快捷、快捷缺点缺点耗耗时长、操作复、操作复杂、标本本要求量大且限定、易要求量大且限定、易污染染较液氮研磨法液氮研磨法DNA提取提取的的浓度、度、纯度低度低标本本类型型200mg固体固体组织标准株准株悬浮液浮液PCR曲曲线典型典型“S”型型“S”型型临床适床适应标本本组织病理病理标本本肺泡灌洗液、血清等液体肺泡灌洗液、血清等液体标本本展望展望基本不能基本不能应用于用于临床床有待更多的有待更多的临床床标本本进行行检测两种两种DNA提取方法的对比提取方法的对比结果与讨论：结果与讨论：DNADNA提取方法的比较提取方法的比较3131第二部分第二部分 曲霉菌曲霉菌FQ-
22、PCRFQ-PCR检测检测体系的建立及评价体系的建立及评价3232材料与方法材料与方法3333实验菌株菌株实验用真菌用真菌标准株：多种曲霉菌准株：多种曲霉菌购买于中国普通微生物菌种于中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏管理中心湖南省微生物室提供多种湖南省微生物室提供多种细菌。菌。湖南圣湘生物有限提供乙肝病毒、支原体、衣原体、巨湖南圣湘生物有限提供乙肝病毒、支原体、衣原体、巨细胞胞病毒、病毒、结核菌、核菌、EB病毒。病毒。主要试剂主要试剂Taq酶、酶、Tris-HClEDTA、Buffer、dNTP（0.1mol/L）、）、MgCl2（1mol/L）、）、PCR引物和探针引物和探针 实验材料实验材
23、料3434 实验方法实验方法1.设计引物探引物探针2.筛选引物探引物探针3.PCR扩增增产物送物送检测序序4.培养其他曲霉菌及收集培养其他曲霉菌及收集实验室室标本本评估体系特异性估体系特异性5.检测体系重复性：采用三种不同体系重复性：采用三种不同浓度的度的标本，批内：每一本，批内：每一浓度度同一天重复点同一天重复点样20次，批次，批间：每一：每一浓度度连续5天重复点天重复点样20次，次，计算算Ct值变异系数（异系数（CV），若），若CV5%，重复性好，重复性好6.灵敏性灵敏性检测：取取102个孢子个孢子/ml标准菌株悬浮液按标准菌株悬浮液按1:1、1:2、1:3的比例稀释进行的比例稀释进行FQ
24、-PCR3535反应体系反应体系CnPCRBuffer(l)36Mg2+(1mol/L)(l)0.2dNTPs(0.1mol/L)(l)0.8ForwardPrimers(pmol)10ReversePrimers(pmol)10Probes(pmol)5TaqDNAPolymerase(2U/l)(l)2TemplateDNA(l)*10实时荧光定量扩增条件：实时荧光定量扩增条件：94C预变性预变性5min后进入循环，后进入循环，94C15s、57C30s，共，共45个循环，在每个循环末收集荧光信号。个循环，在每个循环末收集荧光信号。实时荧光定量实时荧光定量PCR反应体系反应体系（50ul）
25、实验方法实验方法3636 实验结果与讨论实验结果与讨论3737液氮研磨法提取的液氮研磨法提取的DNA为底物，四种曲霉菌不同引物、探底物，四种曲霉菌不同引物、探针行行实时荧光定量光定量PCR扩增曲增曲线A.fumigatus引物探针引物探针1A.fumigatus引物探针引物探针2A.flavus引物探针引物探针1A.flavus引物探引物探针2结果与讨论：结果与讨论：1.1.引物探针的筛选引物探针的筛选3838液氮研磨法提取的液氮研磨法提取的DNADNA为底物，四种曲霉菌不同引物、探底物，四种曲霉菌不同引物、探针行行实时荧光定量光定量PCRPCR扩增曲增曲线A.terreus引物探针引物探针1
26、A.terreus引物探针引物探针2A.niger引物探针引物探针1A.niger引物探针引物探针2结果与讨论：结果与讨论：1.1.引物探针的筛选引物探针的筛选39菌菌种种引引物物探探针针序序列列Tm值值()A.fumigatus1F：CCTCCAGCCAAACCTGAACTTP：GGCACCAGAACCTCCCGCTGAAAATGR：TTCGTCATTGTTTAGAGCCACCT60.167.460.2A.flavus1F：TGGGCTGTTTTGCTGTATGGTTP：AATTCGTCTCATCAAAGAGGCATCCTCGCR：TGCTGAAGGACTAAAAGGACAAGG62.164
27、.660.3A.terreus2F：GGACCAAGTGTAAGTCACCCAATA61.9P：CAACCATCCCGGTCCGTTAGAGC63.4R：ACGGCAACCAACGACGAG59.1A.niger1F：GCCCAACCCTGACCCAACT65.9P：GATACGGCGGCCCTAGAGGATACT67.1R：TAGACCAGCGACCGACGAAC61.3结果与讨论：结果与讨论：1.1.引物探针的筛选引物探针的筛选四种曲霉菌筛选完成的引物探针序列四种曲霉菌筛选完成的引物探针序列4040结果与讨论：结果与讨论：2.2.扩增产物测序扩增产物测序普通普通PCRPCR扩增产物进行电泳
28、分析扩增产物进行电泳分析四种曲霉菌四种曲霉菌DNA的特异性序列的特异性序列扩增增产物物电泳条泳条带清晰、亮度清晰、亮度高，无拖高，无拖带、涂抹、涂抹带现象，象，扩增增产物物长度均度均约为100bp左右，左右，扩增增产物完整性好物完整性好4141结果与讨论：结果与讨论：2.2.扩增产物测序扩增产物测序PCRPCR扩增扩增产物产物送送至上海公司测序至上海公司测序Blast结果结果4242结果与讨论：结果与讨论：3.3.特异性检测特异性检测四种曲霉菌四种曲霉菌FQ-PCRFQ-PCR特异性检测特异性检测其他曲霉菌、真菌及细菌、人类基因均未见扩增曲线，引物其他曲霉菌、真菌及细菌、人类基因均未见扩增曲线
29、，引物探针特异性好，与其他真菌、细菌、人类基因无交叉反应。探针特异性好，与其他真菌、细菌、人类基因无交叉反应。43结果与讨论：结果与讨论：4.4.重复性实验重复性实验四种曲霉菌批内重复性试验四种曲霉菌批内重复性试验A.fumigatusA.flavusA.terreusA.niger44结果与讨论：结果与讨论：4.4.重复性实验重复性实验批内重批内重复性复性试验试验Ct均值与标准差均值与标准差45结果与讨论：结果与讨论：4.4.重复性实验重复性实验批间重复性试验批间重复性试验Ct均值与标准差均值与标准差批内、批间重复性试验批内、批间重复性试验CV最大值均最大值均5%，反应体系重复性好，反应体系
30、重复性好4646结果与讨论：结果与讨论：5.5.灵敏度检测灵敏度检测四种曲霉菌四种曲霉菌FQ-PCR灵敏度检测曲线灵敏度检测曲线A.fumigatusA.flavusA.terreusA.niger不同真菌、每一浓度均可见扩增曲线，且每一种稀释浓度的重复样本扩不同真菌、每一浓度均可见扩增曲线，且每一种稀释浓度的重复样本扩增比例均大于增比例均大于95%，结果显示灵敏度均为，结果显示灵敏度均为35个孢子个孢子/ml4747全文结论全文结论48全文结论全文结论1.对于对于曲霉菌属曲霉菌属固体组织标本，液氮研磨法提取固体组织标本，液氮研磨法提取DNADNA浓度、纯度高，对于曲霉菌浓度、纯度高，对于曲霉
31、菌属属标准株培养标准株培养的孢子冲洗标本，一步结合加热法提取曲霉菌的孢子冲洗标本，一步结合加热法提取曲霉菌DNADNA操作简单、能有效的运用于实时荧光定量操作简单、能有效的运用于实时荧光定量PCRPCR检测。检测。4849全文结论全文结论2.成功筛选出烟曲霉菌、黄曲霉菌、土曲霉菌、成功筛选出烟曲霉菌、黄曲霉菌、土曲霉菌、黑曲霉菌引物探针，并建立了曲霉菌实时荧光黑曲霉菌引物探针，并建立了曲霉菌实时荧光定量定量PCR检测体系，其检测体系特异性、灵敏检测体系，其检测体系特异性、灵敏性高及重复性好。性高及重复性好。4950展望展望本实验已成功建立了特异性、灵敏性高、重复性好的曲本实验已成功建立了特异性
32、、灵敏性高、重复性好的曲霉菌实时荧光定量霉菌实时荧光定量PCR检测体系检测体系后续实验将继续收集更多临床标本，对后续实验将继续收集更多临床标本，对DNA提取方法提取方法及引物探针进行验证及引物探针进行验证可能存在的问题：可能存在的问题：1.血浆、肺泡灌洗液等临床标本，可能存在影响血浆、肺泡灌洗液等临床标本，可能存在影响DNA提取效提取效果的成分果的成分2.最好探索出通用型的曲霉菌属探针，用于临床感染的筛查最好探索出通用型的曲霉菌属探针，用于临床感染的筛查5051特别致谢特别致谢导师导师湖南省人民医院儿童医学中心团队湖南省人民医院儿童医学中心团队湖南省人民医院湖南省人民医院特别鸣谢湖南圣湘生物科技有限公司特别鸣谢湖南圣湘生物科技有限公司给与的实验支持与帮助给与的实验支持与帮助
