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1、神经束路追踪技术是利用神经元轴神经束路追踪技术是利用神经元轴浆运输（浆运输（axoplasmic transportaxoplasmic transport）现象的示（追）踪法，主要用于研现象的示（追）踪法，主要用于研究神经元间广泛的神经纤维联系。究神经元间广泛的神经纤维联系。轴浆运输包括从胞体向轴突及其终轴浆运输包括从胞体向轴突及其终末的顺行运输和从轴突及其终末向末的顺行运输和从轴突及其终末向胞体的逆行运输。胞体的逆行运输。神经束路追踪法主要有辣根过氧化神经束路追踪法主要有辣根过氧化物酶示踪技术、荧光素示踪技术、物酶示踪技术、荧光素示踪技术、同位素示踪技术及顺行示踪技术等。同位素示踪技术及顺
2、行示踪技术等。目前较常应用辣根过氧化物酶法进目前较常应用辣根过氧化物酶法进行神经束路追踪，本章对其作重点行神经束路追踪，本章对其作重点介绍介绍。19711971年年KristensonKristenson和和OlssonOlsson首首先先报报道道HRPHRP可可被被神神经经末末梢梢摄摄取取，经经逆逆行行轴轴浆浆运运输输至至神神经经元元胞胞体体后后，可可用用组组织织化化学学方方法法显显示示胞胞体体的的位位置置，从从而而创创建建了了辣辣根根过过氧氧化化物物酶酶（horseradish horseradish peroxidase, peroxidase, HRPHRP）追踪神经元法）追踪神经元法
3、。HRPHRP法法是是基基于于神神经经元元轴轴浆浆运运输输的的生生理理现现象象，即即将将HRP注注射射至至中中枢枢神神经经系系统统或或周周围围神神经经的的一一定定部部位位，HRPHRP可可被被神神经经末末梢梢以以胞胞饮饮的的方方式式摄摄入入，逆逆行行运运送送至至胞胞体体，经经过过一一定定时时间间后后取取相相应应的的部部位位固固定定、切切片片，然然后后用用组组织织化化学方法显示学方法显示HRPHRP的标记的标记。该该方方法法的的问问世世，得得到到神神经经科科学学界界的的 高高 度度 评评 价价 。 它它 结结 束束 了了 自自MarchiMarchi（18861886年年）开开始始长长达达近近一
4、一个个世世纪纪的的唯唯一一用用银银染染法法追追踪踪选选择择性性溃溃变变纤纤维维的的年年代代，在在神神经经束束路路及及其其功功能的研究中具有划时代的意义。能的研究中具有划时代的意义。HRPHRPHRPHRP的特性的特性：HRPHRP是是从辣根中提取出来的一组同功是是从辣根中提取出来的一组同功酶的混合物，为糖蛋白，含有其组织酶的混合物，为糖蛋白，含有其组织化学活动所必需的正铁血红素族，在化学活动所必需的正铁血红素族，在H H2 2O O2 2作用下催化某些化合物（成色原）作用下催化某些化合物（成色原）而氧化产生可见的反应物。而氧化产生可见的反应物。分子量为分子量为4040，000000道尓顿，分子
5、半径约道尓顿，分子半径约为为3.0nm3.0nm。HRPHRPHRPHRP的细胞外给药法的细胞外给药法：加压注射加压注射法法 微量注射器或微玻管注射，常用。微量注射器或微玻管注射，常用。离子透入注射法离子透入注射法 离子透入技术是以负载电荷的化学离子透入技术是以负载电荷的化学分子或示踪剂注入组织的方法。分子或示踪剂注入组织的方法。 HRPHRPHRPHRP的结合与扩散的结合与扩散: : :终末摄取终末摄取 电镜显示，注入电镜显示，注入HRPHRP后，依次出现于胞后，依次出现于胞饮小泡、膜性囊和小管以及多泡体和致饮小泡、膜性囊和小管以及多泡体和致密体内。较长时间后，密体内。较长时间后， HRPH
6、RP从这些成分从这些成分中消失，说明这些细胞器与示踪剂的结中消失，说明这些细胞器与示踪剂的结合、存储及溶酶体降解有关。合、存储及溶酶体降解有关。 由神经终末摄取的由神经终末摄取的HRPHRP直接与它的突触直接与它的突触活动有关。活动有关。轴索摄取轴索摄取 轴索暂时受损（如注射区）或经挤压轴索暂时受损（如注射区）或经挤压与切断而受到严重损伤时，即可摄取与切断而受到严重损伤时，即可摄取HRPHRP并填充于损伤处的远端和近端。并填充于损伤处的远端和近端。逆行性轴索输送逆行性轴索输送 通过细胞器经轴索逆行运输到神经元通过细胞器经轴索逆行运输到神经元胞体，与微管的完整性有关。胞体，与微管的完整性有关。
7、胞体摄取与顺行性轴索输送胞体摄取与顺行性轴索输送 神经元胞体直接摄取神经元胞体直接摄取HRPHRP的现象几的现象几乎发生于注射区或其附近，或在高乎发生于注射区或其附近，或在高浓度浓度HRPHRP处的神经元。处的神经元。HRPHRP输送到细胞体的命运输送到细胞体的命运 HRPHRP标记的微管、小囊和小泡被运标记的微管、小囊和小泡被运送到胞体并积聚于核周质高尔基复合体送到胞体并积聚于核周质高尔基复合体附近，即互相融合成较大的结构（如溶附近，即互相融合成较大的结构（如溶酶体），最后全细胞及树突都为酶体），最后全细胞及树突都为HRPHRP溶溶酶体所充满。酶体所充满。 早在早在HRPHRP被输送到胞体的
8、前三天，被输送到胞体的前三天，由于溶酶体降解作用而使由于溶酶体降解作用而使HRPHRP含量显著含量显著减少，在减少，在4-84-8天大部分溶酶体内已无天大部分溶酶体内已无HRPHRP。HRPHRPHRPHRP示踪的常用方法示踪的常用方法（TMBTMBTMBTMB法法）基本原理：基本原理： 神经组织的冰冻切片或振动切片在神经组织的冰冻切片或振动切片在含含H H2 2O O2 2的的TMBTMB（四甲基联苯胺（四甲基联苯胺) )溶液中溶液中孵育，组织内之孵育，组织内之HRPHRP与与H H2 2O O2 2结合成结合成（HRP-HHRP-H2 2O O2 2）络合物，此络合物可氧）络合物，此络合物
9、可氧化供氢的化供氢的TMBTMB，使之形成深兰色沉淀，使之形成深兰色沉淀物，沉积在物，沉积在HRPHRP周围。周围。TMBTMB法特点：法特点： 灵敏度高，产物在光镜下易观察，于灵敏度高，产物在光镜下易观察，于明视野下颗粒呈蓝至深蓝色，暗视野呈明视野下颗粒呈蓝至深蓝色，暗视野呈金色；不宜电镜检查。改良金色；不宜电镜检查。改良TMBTMB法可避法可避免其缺点（反应产物过度的结晶形成、免其缺点（反应产物过度的结晶形成、反应的不稳定性、易褪色消失等）。反应的不稳定性、易褪色消失等）。 n实验步骤： 麻醉动物麻醉动物 导入导入HRP 动物存活动物存活 灌注固定灌注固定 取材取材 切片切片 组织化学反应
10、组织化学反应 显微镜观察显微镜观察1.1.麻醉大鼠：麻醉大鼠：2 2% %戊巴比妥（戊巴比妥（40mg/kg)40mg/kg)腹腹腔注射。麻醉不宜过深，以免苏醒过慢，腔注射。麻醉不宜过深，以免苏醒过慢，影响影响HRPHRP被神经元摄取及在其内的运输被神经元摄取及在其内的运输。2.2.注入注入HRPHRP：动物麻醉后，分离坐骨神经，动物麻醉后，分离坐骨神经，用微量注射器将用微量注射器将1%CB-HRP(1%CB-HRP(霍乱原霍乱原B B亚单亚单位结合辣根过氧化物酶）位结合辣根过氧化物酶）2.5ul2.5ul 缓慢缓慢注入坐骨神经。注射后原位注入坐骨神经。注射后原位留针留针10min10min，
11、缝合切口，将大鼠置于原环境中，缝合切口，将大鼠置于原环境中继续存活。继续存活。3.3.存活期存活期：指指HRPHRP注入后，动物需存活一注入后，动物需存活一段时间，以利于段时间，以利于HRPHRP的摄取、运输及积累。的摄取、运输及积累。存活期的长短依赖于运送速度、运送距存活期的长短依赖于运送速度、运送距离及胞体内离及胞体内HRPHRP在溶酶体的降解速度，一在溶酶体的降解速度，一般为般为24-7224-72小时。小时。 4. 4.灌注固定灌注固定：动物麻醉同前，开胸，经左动物麻醉同前，开胸，经左心室心室-主动脉插管，灌注温的（主动脉插管，灌注温的（3737）生）生理盐水冲洗血液至液体清亮，约理盐
12、水冲洗血液至液体清亮，约100 ml100 ml。 再灌注再灌注冷冷的固定液（的固定液（1%1%多聚甲醛和多聚甲醛和1.25%1.25%戊二醛的戊二醛的0.1mol/l0.1mol/l磷酸盐缓冲液，磷酸盐缓冲液，PH7.4PH7.4， 4 4C)C)，约，约500ml ,30500ml ,30分钟。灌注后用分钟。灌注后用含含10%10%蔗糖的蔗糖的0.1mol/l PBS100ml0.1mol/l PBS100ml0.1mol/l PBS100ml0.1mol/l PBS100ml冲洗。冲洗。冲洗。冲洗。 . .取材取材：取脊髓，切成小块，放入含取脊髓，切成小块，放入含25%25%蔗蔗糖的糖的
13、0.1mol/l PBS0.1mol/l PBS（ PH7.4PH7.4）于）于44 冰箱过夜。冰箱过夜。. .切片切片：待脊髓在蔗糖液中沉底后，标本：待脊髓在蔗糖液中沉底后，标本以磷酸缓冲液略洗，冷冻切片机冠状切脊以磷酸缓冲液略洗，冷冻切片机冠状切脊髓，厚髓，厚15-20um15-20um，贴于多聚赖氨酸载玻片，贴于多聚赖氨酸载玻片上，回至室温凉或烘干上，回至室温凉或烘干 。. .后固定后固定：切片入丙酮溶液固定：切片入丙酮溶液固定10min10min，蒸，蒸馏水冲洗馏水冲洗2 23 3次，每次次，每次2 23min3min。. .预浸预浸：入入2020预孵育液，在预孵育液，在避光避光条件下
14、，条件下，恒温恒温孵育孵育20 min 20 min 。 预孵育液：预孵育液：500mg500mg钨酸钠溶解在钨酸钠溶解在23.5ml23.5ml 蒸馏水中，过滤，后加入蒸馏水中，过滤，后加入0.2mol/l0.2mol/l的的PBS25mlPBS25ml及及1NHCL0.75ml1NHCL0.75ml，搅拌混匀，呈色，搅拌混匀，呈色反应前加反应前加 TMBTMB液液(TMB3.5mg(TMB3.5mg用用0.25ml0.25ml丙酮丙酮溶解后，加溶解后，加0.5ml0.5ml无水乙醇）。无水乙醇）。. .呈色反应呈色反应：呈色开始时，于反应液中：呈色开始时，于反应液中加入加入 0.3%H0.
15、3%H2 2O O2 2 0.35ml 0.35ml，以后每，以后每 10min 10min 加加0.35ml 0.35ml 在在避光避光条件下反应，条件下反应，历时历时1 1小时。小时。10.10.清洗清洗：反应结束用：反应结束用0.05mol/lPB0.05mol/lPB洗洗4-64-6次，每次次，每次2-3min2-3min。11.11.复染复染：切片经苏木素短时复染：切片经苏木素短时复染。12.12.封片封片：切片经蒸馏水漂洗切片经蒸馏水漂洗30s30s，再，再用用70%70%、80%80%、95%95%酒精逐级脱水各酒精逐级脱水各1min1min，二甲苯透明两次，共，二甲苯透明两次，
16、共4-10min4-10min，树胶封片。，树胶封片。13.13.镜检镜检：光镜下观察染色结果。光镜下观察染色结果。注意事项：注意事项： 1. 1. HRPHRPHRPHRP运输到预定部位的时间取决于传送运输到预定部位的时间取决于传送运输到预定部位的时间取决于传送运输到预定部位的时间取决于传送速度及距离。传送速度因动物的种类及纤速度及距离。传送速度因动物的种类及纤速度及距离。传送速度因动物的种类及纤速度及距离。传送速度因动物的种类及纤维系统而有不同，故每组实验必须具体试维系统而有不同，故每组实验必须具体试维系统而有不同，故每组实验必须具体试维系统而有不同，故每组实验必须具体试验以求最佳动物存活
17、期，一般验以求最佳动物存活期，一般验以求最佳动物存活期，一般验以求最佳动物存活期，一般2 2 2 23 3 3 3天比较天比较天比较天比较合适。而时间过长，合适。而时间过长，合适。而时间过长，合适。而时间过长，HRPHRPHRPHRP可被胞体内的溶酶可被胞体内的溶酶可被胞体内的溶酶可被胞体内的溶酶体逐渐破坏水解。体逐渐破坏水解。体逐渐破坏水解。体逐渐破坏水解。2.2.注射注射HRPHRP必须缓慢，原位留针，缓必须缓慢，原位留针，缓慢退针。慢退针。3.3.固定液必须新鲜，特别是戊二醛必固定液必须新鲜，特别是戊二醛必须在临灌注时加入，一次用完。须在临灌注时加入，一次用完。4.4.孵育时需保持恒温孵
18、育时需保持恒温2020且避光条件。且避光条件。预孵育液临用时配。预孵育液临用时配。实验结果：实验结果：CB-HRP CB-HRP 的反应产的反应产物在明视野下呈青兰色物在明视野下呈青兰色, ,标记标记的细胞和轴突的形态悦目细腻。的细胞和轴突的形态悦目细腻。逆行标记的细胞胞体和突起中逆行标记的细胞胞体和突起中的反应产物呈均质性或排列极的反应产物呈均质性或排列极为密集的小颗粒为密集的小颗粒, ,神经元胞体神经元胞体结构清晰。结构清晰。TH酪氨酸羟化酶酪氨酸羟化酶辣根过氧化物酶示踪法HRP labelling neurons in oculomotor nucleus of catHRP label
19、ling neurons in dLGN（背外（背外侧膝状核）膝状核）Double-labelling Double-labelling of HRP and of HRP and Glutamate in rat Glutamate in rat lateral lateral geniculate geniculate nucleusnucleus （外侧（外侧（外侧（外侧膝状核）膝状核）膝状核）膝状核）HRPHRPHRPHRP法的优缺点法的优缺点优点：优点： 1.HRP1.HRP法能在混合的神经元总体法能在混合的神经元总体内定位它所起源的特异性细胞。内定位它所起源的特异性细胞。 2.2.用新近的用新近的HRPHRP技术，灵敏度高，技术，灵敏度高，耗时短。耗时短。3.3.如用如用DABDAB作成色剂，可供电镜镜检。作成色剂，可供电镜镜检。4.4.无论是单用或与其他方法相结合，无论是单用或与其他方法相结合，HRPHRP法都可用于追踪侧支投射。还可法都可用于追踪侧支投射。还可成功地结合多种组织化学法以显示与成功地结合多种组织化学法以显示与递质有关的酶类。递质有关的酶类。 缺点：缺点： 1.1.难确定有效注射部位难确定有效注射部位 2.2.几种常规使用的成色剂都有致癌性几种常规使用的成色剂都有致癌性
