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1、纤维素降解菌X-3的GFP标记 2021/7/221gfp质粒的提取质粒的提取试验路线gfp质粒质粒+X-3感受态细胞感受态细胞 X-3感受态细胞的制备感受态细胞的制备电击转化电击转化X-3-gfp标记菌标记菌经过传代培养验证其稳定性，同时检测其经过传代培养验证其稳定性，同时检测其相关理化特性（相关理化特性（ph，温度，含氧量，转速，温度，含氧量，转速等）是否受到影响，确定等）是否受到影响，确定gfp标记的细菌标记的细菌可以用于进一步研究可以用于进一步研究2021/7/222GFP标记菌落观察油镜观察2021/7/223本实验所需的的材料1.LB培养基：蛋白胨培养基：蛋白胨 10g，NaCl
2、10 g，酵母浸膏，酵母浸膏5 g，蒸馏水，蒸馏水 1000ml，pH 7.02.抗生素壮观霉素（抗生素壮观霉素（Spectinomycine Spe）购自）购自Sigma公司公司3.PEB洗涤液：蔗糖洗涤液：蔗糖93.1g， MgCl2 0.2g，KH2PO4 0.953g,H2O 1000ml, pH 7.43.电转仪：伯乐电转仪：伯乐MicroPulser电穿孔仪电穿孔仪4.立体荧光显微镜：（立体荧光显微镜：（Leica MZ12）为瑞士莱卡仪器公司产品）为瑞士莱卡仪器公司产品5.荧光显微镜：荧光显微镜：ECLIPSE 80i高级研究型显微镜高级研究型显微镜6.离心机：离心机：EPPEN
3、DORF7.凝胶成像仪：凝胶成像仪：BIO-RAD Universal Hood Gel-Doc UV Imaging System8.质粒质粒DNA：购自：购自AxyGEN生产的生产的AxyPrep质粒质粒DNA 2021/7/224一.gfp质粒的提取 1.先在卡那培养基上过夜培养菌液，然后提取该菌液进行实验先在卡那培养基上过夜培养菌液，然后提取该菌液进行实验2.按照按照AxyGEN生产的生产的AxyPrep质粒质粒DNA说明书上的方法进行相说明书上的方法进行相关操作关操作3.采用采用1%琼脂糖凝胶电泳进行质粒琼脂糖凝胶电泳进行质粒DNA检测检测 a.凝胶制备：琼脂糖凝胶制备：琼脂糖 （1
4、g）+TAE（100ml） 微波加热微波加热至透明倒至透明倒 入制胶板中入制胶板中 b.2 l质粒质粒+2 l单染料滴在制胶板上，同时做单染料滴在制胶板上，同时做mark对照对照 c.140v，30min d.电泳结束后，用紫外凝胶成像仪和紫外凝胶成像系统观察电泳结束后，用紫外凝胶成像仪和紫外凝胶成像系统观察结果，并记录结果，并记录2021/7/225二.X-3感受态细胞的制备1.从LB固体平板上挑取新鲜的x-3菌株单菌落于50 ml LB液体培养基中，30，170 r/min 振荡培养过夜，按照 1%接种比例接入100 ml LB液体培养基中，30，170 r/min 振荡培养，每1 h 测
5、定1 次 OD6002.收集生长中期的培养物于冰水浴中放置20 min 后，用PEB洗涤液冲洗细胞4 次 。具体过程：用50ml PEB洗涤液冲洗离心过的菌体，轻轻混匀，然后放于离心机（8000r,5min）离心，重复四次。这些过程都需要随时放在冰盒上，保持冷却。2021/7/226三.电击转化及荧光观察1.用用250lPEB洗涤液冲洗最后一次离心的菌体，分别分装到洗涤液冲洗最后一次离心的菌体，分别分装到50l的离的离心管中心管中2.取取50l感受态细胞感受态细胞+1l质粒（梯度分别为质粒（梯度分别为1l，2.5l，5l）置于电）置于电转杯上，用枪头轻轻吹吸，冰上冷却转杯上，用枪头轻轻吹吸，冰上冷却3.电转仪电击电转仪电击4.立即用立即用LB培养液活化（培养液活化（1ml），转移到离心管中，震荡培养），转移到离心管中，震荡培养1h(120r,37)5.取转化后的菌液，分别取取转化后的菌液，分别取10 ，50， 100l菌液涂布于含有菌液涂布于含有100g/ml壮观霉素的壮观霉素的LB固体培养基上，固体培养基上，30培养培养6.取相关切片在荧光显微镜下观察是否标记上。取相关切片在荧光显微镜下观察是否标记上。2021/7/227
