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1、An RNA-directed nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells 果蝇细胞中RNA指导的核酸酶调节的转录后基因沉默这是我的理解：本文章于2000年一月26日接收。2006年诺贝尔生理及医学奖授予该方面的研究。RNAi机制现在已研究比较透彻。文章主要讲的是RNA干扰（RNA interference）的早期发现阶段的相关研究。2000年 Hammond等使用体外培养的果蝇细胞进行研究发现了：外源性dsRNA通过耗能过程降解成小干扰RNA引发RNAi。RNAi mechanism :病
2、毒基因、人工转入基因、转座子等外源性基因随机整合到宿主细胞基因组内，并利用宿主细胞进行转录时，常产生一些dsRNA。宿主细胞对这些dsRNA迅即产生反应，其胞质中的核酸内切酶Dicer将dsRNA切割成多个具有特定长度和结构的小片段RNA（大约2123 bp），即siRNA。siRNA在细胞内RNA解旋酶的作用下解链成正义链和反义链，继之由反义siRNA再与体内一些酶（包括内切酶、外切酶、解旋酶等）结合形成RNA诱导的沉默复合物（RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC与外源性基因表达的mRNA的同源区进行特异性结合，RISC具有核酸酶的功能，在结合部位
3、切割mRNA，切割位点即是与siRNA中反义链互补结合的两端。被切割后的断裂mRNA随即降解，从而诱发宿主细胞针对这些mRNA的降解反应。siRNA不仅能引导RISC切割同源单链mRNA，而且可作为引物与靶RNA结合并在RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase，RdRP）作用下合成更多新的dsRNA，新合成的dsRNA再由Dicer切割产生大量的次级siRNA，从而使RNAi的作用进一步放大，最终将靶mRNA完全降解。你因该可以看懂，就是通过小RNA片段序列互补识别，来决定mRNA降解的特异性，之后产生的次级小RNA加强特异降解，最终该基因的mRNA全部或大部分被
4、讲解，使其功能丧失，因为在mRNA水平，因此叫转录后的基因沉默PTGS(post-transcriptional gene silencing )RNAi 可能是生物自身基因调节的一种机制，也可能是生物体防御外来核酸入侵的一种方式，比如在植物中，它没有免疫系统，但RNAi可以 起到一种分子免疫作用，病毒侵染植物后会进行大量的核酸复制，其间必然形成双链RNA（dsRNA）,而dsRNA一旦形成，就会引发植物体内的dicer 酶的切割，进而引发 RNAi机制，讲解病毒核酸。这也应该是长期进化的选择的结果吧，之后还有病毒会产生沉默抑制现象，抑制植物对其核酸的降解，他们是相互生存竞争中逐渐进化的。人们
5、发现后利用这种现象做基因功能敲除技术，你可以了解一下VIGS（病毒诱导的基因沉默），估计你导师可能想用RNAi做基因敲除来研究细胞中某基因的功能。你也可以查查Cas9 （小猛她们假期就做的这个）利用CRISPR方法引导Cas9 进行基因组的编辑，定点打靶。你文章中的实验为证明RNAi现象用果蝇S2细胞做的验证实验：实验一：lacZ （外源基因）基因的敲出首先将lacZ基因转入果蝇S2细胞，然后导与lacZ基因（在特定底物培养基上可呈现蓝斑）序列相似的300nt的dsRNA同时用CD8基因的dsRNA做负对照只有IacZ dsRNA 导入后会导致IacZ功能的丧失（几乎无蓝斑）Assay 2：c
6、yclinE （内源基因）基因的沉默Cyclin（控制细胞S期）起始540nt的dsRNA/ IacZ dsRNA （Ck）可见Cyclin dsRNA细胞周期停滞不能越过S期进入G2，而IacZ dsRNA 正常Assay 3：mRNA level to prove gen was silenced用Northen探针杂交法检测总RNA中被dsRNA沉默的mRNA含量cyclinE/fizzy/cyclinA的mRNA明显减少,这也说明它是转录后沉默实验1.2.3都是体内实验，之后作者开展了体外RNAi现象证明：Assay 4 ：proved RNAi in vitro将导入cycE与Iac
7、Z的S2细胞胞浆提取液加入到cycE与IacZ转录反应体系中（不同时间间隔），看其是否能抑制其mRNA的合成cycE 转录的过程可被抑制，而IacZ的转录很稳定Assay 5 : Explorate the appropriate size of dsRNa for RNAi 不同时间段，不同dsRNA 长度探究发生RNAi的最适dsRNA长度同样是用Northern检测的吧，条带越弱说明mRNA被讲解越严重Assay 6 : RISC复合物（小RNA与核糖核蛋白的复合物）的底物要求通过Northern检测目标mRNA的有无，判断某种第五是不是RISC形成所必须的，只有RISC的形成才能降解靶
8、mRNA Assay 7 : To demonstrate that RISC cintains a guide RNA他们用的什么色谱分析，阴离子交换的方法分离RISC的成分，又用Northern检测目标mRNA的存在，我也没看特别懂这是2000年的文章，里面说的一些uncertain现在很多都certain了，但是听老师说用RNAi做基因敲除得其缺失突变体如VIGS技术好像还不是很成熟，其这些都是生命科学的常规研究方法，无论你做什么植物/动物还是细胞。尤其是现在后基因组时代的到来，伴随各物种全基因组的测序，我们今后很长一段时间要做的工作就是探究这些海量基因的功能，我是这么想的，所以没准真会考bioinformatics。在实验室注意安全尤其接触那些有毒的药品，保护好自己。 come on . Saturday September 21 2013 yjl
