最新发酵产物分离纯化ppt课件

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1、进入夏天，少不了一个热字当头，电扇空调陆续登场，每逢此时，总会想起进入夏天，少不了一个热字当头，电扇空调陆续登场，每逢此时，总会想起那一把蒲扇。蒲扇，是记忆中的农村，夏季经常用的一件物品。记忆中的故那一把蒲扇。蒲扇，是记忆中的农村，夏季经常用的一件物品。记忆中的故乡，每逢进入夏天，集市上最常见的便是蒲扇、凉席，不论男女老少，个个手持乡，每逢进入夏天，集市上最常见的便是蒲扇、凉席，不论男女老少，个个手持一把，忽闪忽闪个不停，嘴里叨叨着一把，忽闪忽闪个不停，嘴里叨叨着“怎么这么热怎么这么热”，于是三五成群，聚在大树，于是三五成群，聚在大树下，或站着，或随即坐在石头上，手持那把扇子，边唠嗑边乘凉。孩

2、子们却在周下，或站着，或随即坐在石头上，手持那把扇子，边唠嗑边乘凉。孩子们却在周围跑跑跳跳，热得满头大汗，不时听到围跑跑跳跳，热得满头大汗，不时听到“强子，别跑了，快来我给你扇扇强子，别跑了，快来我给你扇扇”。孩。孩子们才不听这一套，跑个没完，直到累气喘吁吁，这才一跑一踮地围过了，这时子们才不听这一套，跑个没完，直到累气喘吁吁，这才一跑一踮地围过了，这时母亲总是，好似生气的样子，边扇边训，母亲总是，好似生气的样子，边扇边训，“你看热的，跑什么？你看热的，跑什么？”此时这把蒲扇，此时这把蒲扇，是那么凉快，那么的温馨幸福，有母亲的味道！蒲扇是中国传统工艺品，在是那么凉快，那么的温馨幸福，有母亲的味

3、道！蒲扇是中国传统工艺品，在我国已有三千年多年的历史。取材于棕榈树，制作简单，方便携带，且蒲扇的表我国已有三千年多年的历史。取材于棕榈树，制作简单，方便携带，且蒲扇的表面光滑，因而，古人常会在上面作画。古有棕扇、葵扇、蒲扇、蕉扇诸名，实即面光滑，因而，古人常会在上面作画。古有棕扇、葵扇、蒲扇、蕉扇诸名，实即今日的蒲扇，江浙称之为芭蕉扇。六七十年代，人们最常用的就是这种，似圆非今日的蒲扇，江浙称之为芭蕉扇。六七十年代，人们最常用的就是这种，似圆非圆，轻巧又便宜的蒲扇。蒲扇流传至今，我的记忆中，它跨越了半个世纪，圆，轻巧又便宜的蒲扇。蒲扇流传至今，我的记忆中，它跨越了半个世纪，也走过了我们的半个人

4、生的轨迹，携带着特有的念想，一年年，一天天，流向长也走过了我们的半个人生的轨迹，携带着特有的念想，一年年，一天天，流向长长的时间隧道，袅长的时间隧道，袅发酵产物分离纯化FERMENTATIONProcess ControlFermentationengineering上游工程上游工程UPSTREAMPROCESSES下游工程下游工程DOWNSTREAMPROCESSES发 酵 工 程 组 成从从 广广 义义 上上 讲讲 ， 由由 三三 部部 分分 组组 成成 ： 上游工程、发酵工程、下游工程上游工程、发酵工程、下游工程一、建立分离纯化工艺的根据一、建立分离纯化工艺的根据1、含目的产物的起始物料

5、的特点、含目的产物的起始物料的特点2、物料中杂质的种类和性质、物料中杂质的种类和性质3、目的产物特性、目的产物特性4、产品质量的要求、产品质量的要求 （1 1）菌菌菌菌种种种种类类类类型型型型及及及及其其其其代代代代谢谢谢谢特特特特性性性性：包包包包括括括括菌菌菌菌种种种种的的的的生生生生物物物物学学学学性性性性质质质质，产产产产物物物物和和和和副副副副产产产产物物物物种种种种类类类类、产产产产物物物物在在在在细细细细胞胞胞胞内内内内所所所所处处处处的的的的位位位位置置置置，表表表表达达达达方方方方式式式式（胞胞胞胞内内内内、胞胞胞胞外外外外、包包包包含含含含体体体体），代代代代谢谢谢谢物物物

6、物种种种种类类类类、产产产产物物物物类类类类似似似似物物物物、毒毒毒毒素素素素和和和和能能能能降降降降解解解解产产产产物物物物的的的的酶酶酶酶类类类类等；等；等；等； （2 2）原材料和培养基的来源及其质量原材料和培养基的来源及其质量原材料和培养基的来源及其质量原材料和培养基的来源及其质量； （3 3）生生生生产产产产工工工工艺艺艺艺和和和和条条条条件件件件：包包包包括括括括灭灭灭灭菌菌菌菌方方方方式式式式和和和和条条条条件件件件，生生生生产产产产方方方方式式式式（连连连连续续续续、批批批批式式式式、半半半半连连连连续续续续），生生生生产产产产周周周周期期期期，生生生生产产产产能能能能力力力力

7、，工工工工艺艺艺艺控控控控制制制制条条条条件件件件因因因因素素素素几几几几方方方方式等；式等；式等；式等； （4 4）初初初初始始始始物物物物料料料料的的的的物物物物理理理理、化化化化学学学学和和和和生生生生物物物物学学学学特特特特性性性性：包包包包括括括括产产产产物物物物浓浓浓浓度度度度、主主主主要要要要杂杂杂杂质质质质种种种种类类类类和和和和浓浓浓浓度度度度、盐盐盐盐的的的的种种种种类类类类和和和和浓浓浓浓度度度度、溶溶溶溶解解解解度度度度、pHpH、黏黏黏黏度度度度、流流流流体体体体力学性质和热力学性质。力学性质和热力学性质。力学性质和热力学性质。力学性质和热力学性质。 物料中杂质的含量

8、、性质、结构、相对物料中杂质的含量、性质、结构、相对分子质量、电荷性质及数量、生物学特分子质量、电荷性质及数量、生物学特性、稳定性、溶解度、分配系数、挥发性、稳定性、溶解度、分配系数、挥发性、吸附性能等。性、吸附性能等。n n产产物物的的化化学学、物物理理和和生生物物学学特特性性，包包括括化化学学组组成成、相相对对分分子子质质量量、等等电电点点、电电荷荷分分布布及及密密度度、溶溶解解度度、稳稳定定性性、疏疏水水性性、扩扩散散性性、扩扩散散系系数数、分分配配系系数数、吸吸附附性性能能、生生物物学学活活性性、亲亲和和性性、配配基基种种类、表面活性等。类、表面活性等。n n产产品品质质量量标标准准和

9、和用用途途对对产产品品纯纯度度、生生物物活活性性、比比活活的的要要求求。包包括括允允许许的的杂杂质质种种类类和和最最大大允允许许含含量量，特特殊殊杂杂质质的的种种类类和和最最大大允允许许量量，以以及及杂杂质质对对使使用用的的影影响响，产品剂型、贮存稳定性等。产品剂型、贮存稳定性等。分离纯化的一般流程分离纯化的一般流程1)培养液（发酵液）的预处理和固液分离；培养液（发酵液）的预处理和固液分离；2)初步纯化（提取）；初步纯化（提取）；3)高度纯化（精制）；高度纯化（精制）；4)成品加工。成品加工。一般分离纯化过程可分为一般分离纯化过程可分为4 4个阶段：个阶段：预处理和固液分离预处理和固液分离 ：

10、目的是分离发酵液中目的是分离发酵液中目的是分离发酵液中目的是分离发酵液中的菌体细胞和不溶性固体杂质。的菌体细胞和不溶性固体杂质。的菌体细胞和不溶性固体杂质。的菌体细胞和不溶性固体杂质。初步分离初步分离 ：目的是除去与产物性质差异较：目的是除去与产物性质差异较：目的是除去与产物性质差异较：目的是除去与产物性质差异较大的杂质，为精制工序创造有利条件。大的杂质，为精制工序创造有利条件。大的杂质，为精制工序创造有利条件。大的杂质，为精制工序创造有利条件。 高度纯化高度纯化 ：去除与产物的物理化学性质比：去除与产物的物理化学性质比：去除与产物的物理化学性质比：去除与产物的物理化学性质比较接近的杂质。较接

11、近的杂质。较接近的杂质。较接近的杂质。成品制作成品制作 ：成品形式由产品的最终用途决：成品形式由产品的最终用途决：成品形式由产品的最终用途决：成品形式由产品的最终用途决定。定。定。定。 下下游游加加工工过过程程的的一一般般流流程程（沉淀、吸附、萃取、超滤、结晶）（沉淀、吸附、萃取、超滤、结晶）发酵液发酵液初步纯化初步纯化细胞碎片分离细胞碎片分离细胞破碎细胞破碎细胞分离细胞分离高度纯化高度纯化成品加工成品加工预处理预处理胞胞外外产产物物（加热、调（加热、调pH、絮凝）、絮凝）（过滤、离心分离、膜分离（过滤、离心分离、膜分离)（化学、研磨、酶解）（化学、研磨、酶解）（离心分离、双水相萃取、膜分离）

12、（离心分离、双水相萃取、膜分离）（重结晶、离子交换、色谱分离、膜分离）（重结晶、离子交换、色谱分离、膜分离）（浓缩、无菌过滤、干燥、成型）（浓缩、无菌过滤、干燥、成型）胞胞内内产产物物提取提取精制精制产产品品的的收收得得率率和和质质量量控控制制。二、发酵液预处理与固液分离二、发酵液预处理与固液分离1 、发酵液的预处理、发酵液的预处理2 、发酵液的固液分离、发酵液的固液分离1 、发酵液的预处理、发酵液的预处理n n目目 的的除除去去部部分分可可溶溶性性杂杂质质和和改改变变滤滤液性质，以利于提取和精制的顺利进行。液性质，以利于提取和精制的顺利进行。1 、发酵液的预处理、发酵液的预处理n n细细菌菌

13、及及某某些些放放线线菌菌菌菌体体细细小小，发发酵酵液液粘粘度度大，不能直接过滤；大，不能直接过滤；n n 由由于于菌菌体体自自溶溶，核核酸酸、蛋蛋白白质质及及其其它它有有机机粘粘性性物物质质的的存存在在会会造造成成滤滤液液浑浑浊浊，滤滤速速极慢；极慢；n n真真真真菌菌菌菌的的的的菌菌菌菌丝丝丝丝比比比比较较较较粗粗粗粗大大大大，发发发发酵酵酵酵液液液液容容容容易易易易过过过过滤滤滤滤，常常常常不不不不需需需需特特特特殊殊殊殊处处处处理理理理。其其其其滤滤滤滤渣渣渣渣呈呈呈呈紧紧紧紧密密密密饼饼饼饼状状状状物物物物，很很很很容容容容易易易易从从从从滤滤滤滤布布布布上上上上刮刮刮刮下下下下来来来

14、来，故故故故可可可可采采采采用用用用鼓鼓鼓鼓式式式式真真真真空空空空过过过过滤滤滤滤机过滤。机过滤。机过滤。机过滤。n n放放放放线线线线菌菌菌菌发发发发酵酵酵酵液液液液菌菌菌菌丝丝丝丝细细细细而而而而分分分分枝枝枝枝，交交交交织织织织成成成成网网网网络络络络状状状状。还还还还含含含含有有有有很很很很多多多多多多多多糖糖糖糖类类类类物物物物质质质质，粘粘粘粘性性性性强强强强，过过过过滤滤滤滤较较较较困困困困难，一般需经预处理，以凝固蛋白质等胶体。难，一般需经预处理，以凝固蛋白质等胶体。难，一般需经预处理，以凝固蛋白质等胶体。难，一般需经预处理，以凝固蛋白质等胶体。n n细细细细菌菌菌菌发发发发

15、酵酵酵酵液液液液的的的的菌菌菌菌体体体体更更更更细细细细小小小小，因因因因此此此此，过过过过滤滤滤滤十十十十分分分分困困困困难难难难，如如如如不不不不用用用用絮絮絮絮凝凝凝凝等等等等方方方方法法法法预预预预处处处处理理理理发发发发酵酵酵酵液液液液，往往往往往难以采用常规过滤的设备来完成过滤操作。往难以采用常规过滤的设备来完成过滤操作。往难以采用常规过滤的设备来完成过滤操作。往难以采用常规过滤的设备来完成过滤操作。预处理的方法预处理的方法n n采采用用絮絮凝凝或或凝凝聚聚的的方方法法，设设法法增增大大悬悬浮浮液液中中固体粒子的大小，提高其沉降速度；固体粒子的大小，提高其沉降速度；n n采采用用稀

16、稀释释、加加热热等等方方法法降降低低粘粘度度，以以利利于于过过滤；滤；凝聚和絮凝技术凝聚和絮凝技术n n凝凝聚聚和和絮絮凝凝技技术术能能有有效效地地改改变变细细胞胞、菌菌体体和和蛋蛋白白质质等等胶胶体体粒粒子子的的分分散散状状态态，使使它它们们聚聚集集起起来来，增增大大体体积积，以以便便于于过过滤滤，常常用用于于菌菌体体细细小小而而且且粘粘度度大大的的发发酵酵液液的的预预处处理理中。中。凝聚和絮凝凝聚和絮凝机理机理n n凝聚:电电解解质质将将胶胶体体粒粒子子表表面面上上的的电电荷荷中中和和，减减少少存存在在于于胶胶体体粒粒子子间间的的静静电电斥斥力力，范范德德华华吸吸引引力力占占优优势势，这这

17、样样胶胶体体就就会会凝凝聚成较大、较密实的粒子聚成较大、较密实的粒子n n絮凝:在在某某些些高高分分子子絮絮凝凝剂剂存存在在下下，使使胶胶粒形成粗大的絮凝团使之更容易过滤。粒形成粗大的絮凝团使之更容易过滤。n n凝凝聚聚是是在在中中性性盐盐作作用用下下，而而使使胶胶体体体体系系不不稳稳定的现象。定的现象。n n常常用用的的凝凝聚聚剂剂电电解解质质有有：Al2(SO4)318H2O(明明 矾矾 )； AlC136H2O； FeC13； ZnSO4；MgCO3等。等。絮絮凝凝是是指指在在某某些些高高分分子子絮絮凝凝剂剂存存在在下下，使使胶胶粒粒形形成成粗粗大大的的絮絮凝凝团团的的过过程程，是是一一

18、种种以以物物理理的集合为主的过程。的集合为主的过程。目目前前最最常常见见的的高高分分子子聚聚合合物物絮絮凝凝剂剂是是有有机机合合成的聚丙烯酰胺类衍生物。成的聚丙烯酰胺类衍生物。2、发酵液的固液分离、发酵液的固液分离n n常用的操作方法有过滤和离心。常用的操作方法有过滤和离心。n n产产胞胞内内产产物物的的菌菌体体收收集集菌菌体体后后需需要要使使细胞破碎细胞破碎。 细胞的破碎方法细胞的破碎方法 按按所所用用方方法法属属性性分分为为物物理理法法（匀匀浆浆 法法、珠珠磨磨法法、超超声声法法）、化化学学法法（渗渗透透冲冲击击、增增溶溶法法、脂脂溶溶法法）、生生物物法法（酶酶溶法）。溶法）。 物理破碎法

19、物理破碎法 a 高压匀浆法高压匀浆法 b 高速珠磨法高速珠磨法 c 超声破碎法超声破碎法 d 反复冻融法反复冻融法 e 冷热交替法冷热交替法 化学破碎法化学破碎法a 渗透冲击渗透冲击 利用渗透压的变化破碎细胞。利用渗透压的变化破碎细胞。b 增溶法增溶法 利利用用表表面面活活性性剂剂等等化化学学试试剂剂的的增增溶溶作作用用，增增加加细细胞壁和膜的通透性使细胞破碎。胞壁和膜的通透性使细胞破碎。c 脂溶法脂溶法 许许多多有有机机溶溶剂剂能能与与细细胞胞壁壁和和膜膜上上的的脂脂质质作作用用，导导致细胞壁膨胀、破裂，释放出胞内物质。致细胞壁膨胀、破裂，释放出胞内物质。生物破碎法生物破碎法 加酶促进法加酶

20、促进法 利用生物酶消化溶解细胞壁和细胞膜的方法。利用生物酶消化溶解细胞壁和细胞膜的方法。三、初步纯化三、初步纯化常用的操作方法：常用的操作方法：1. 1.沉淀法沉淀法2. 2.溶剂萃取法溶剂萃取法3. 3.双水相萃取法双水相萃取法4. 4.吸附法吸附法5. 5.蒸发和膜分离法蒸发和膜分离法1、沉淀法、沉淀法（1）盐析法）盐析法（2）有机溶剂沉淀法）有机溶剂沉淀法（3）等电点沉淀法）等电点沉淀法（4）非离子型聚合物沉淀法）非离子型聚合物沉淀法（5）聚电解质沉淀法）聚电解质沉淀法（6）盐复合物沉淀法）盐复合物沉淀法（7）热、酸碱变性沉淀法）热、酸碱变性沉淀法（1）盐析法）盐析法n n中性盐的加入，

21、破坏了蛋白质、酶的胶体中性盐的加入，破坏了蛋白质、酶的胶体性质，中和微粒上的电荷，促使蛋白质等性质，中和微粒上的电荷，促使蛋白质等的沉淀，多用于提取各种蛋白质和酶。的沉淀，多用于提取各种蛋白质和酶。n n中性盐一般为硫酸铵。中性盐一般为硫酸铵。 （2）有机溶剂沉淀法）有机溶剂沉淀法n n与与水水互互溶溶的的有有机机溶溶剂剂（乙乙醇醇、丙丙酮酮等等）能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。能使蛋白质在水中的溶解度显著降低。n n多多用用于于生生物物小小分分子子、多多糖糖、核核酸酸和和蛋蛋白白质等产品的提取。质等产品的提取。有机溶剂在这个过程的主要作用：有机溶剂在这个过程的主要作用：n n降降低低溶溶液

22、液的的介介电电常常数数，因因为为分分子子间间的的静静电电引引力力和和溶溶剂剂的的介介电电常常数数成成反反比比，加加入入有有机机溶溶剂剂，蛋蛋白白质质分分子子间间的的引引力力增增加加，溶溶解解度度降低。降低。n n有有机机溶溶剂剂的的另另一一作作用用是是部部分分地地引引起起蛋蛋白白质质脱水而沉淀。脱水而沉淀。（3）等电点沉淀法）等电点沉淀法n n调调节节溶溶液液pH至至等等电电点点处处，可可使使两两性性电电解解质质所所带带净净电电荷荷为为零零，相相邻邻分分子子之之间间由由于于没没有有静静电斥力而趋于沉淀。电斥力而趋于沉淀。n n适适用用于于氨氨基基酸酸、蛋蛋白白质质和和其其他他两两性性物物质质的

23、的沉沉淀分离。淀分离。（4）非离子型聚合物沉淀法）非离子型聚合物沉淀法n n非非非非离离离离子子子子多多多多聚聚聚聚物物物物包包包包括括括括各各各各种种种种不不不不同同同同分分分分子子子子量量量量的的的的聚聚聚聚乙乙乙乙二二二二醇醇醇醇（PEGPEG）、葡葡葡葡聚聚聚聚糖糖糖糖右右右右旋旋旋旋糖糖糖糖酐酐酐酐硫硫硫硫酸酸酸酸钠钠钠钠等等等等，应应应应用用用用最最最最多的是多的是多的是多的是PEGPEG。n n其其其其操操操操作作作作条条条条件件件件温温温温和和和和，不不不不易易易易引引引引起起起起生生生生物物物物大大大大分分分分子子子子的的的的变变变变性性性性，沉沉沉沉淀淀淀淀效效效效能能能能

24、高高高高，很很很很少少少少量量量量的的的的沉沉沉沉淀淀淀淀剂剂剂剂就就就就可可可可以以以以使使使使相相相相当当当当多多多多的的的的生生生生物物物物大大大大分分分分子子子子沉沉沉沉淀淀淀淀，且且且且沉沉沉沉淀淀淀淀后后后后的的的的多多多多聚聚聚聚物物物物也也也也容容容容易易易易除除除除去去去去，无无无无毒毒毒毒、不不不不可可可可燃燃燃燃，对对对对大大大大多多多多数数数数蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质有有有有保保保保护护护护作作作作用用用用，因因因因此此此此广广广广泛泛泛泛用用用用于于于于蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质、核核核核酸酸酸酸、细细细细菌菌菌菌和和和和病病病病毒等的分离纯化。毒等的分离纯化。毒等的分

25、离纯化。毒等的分离纯化。 2、溶剂萃取法、溶剂萃取法n n利利用用不不同同物物质质在在不不同同的的溶溶剂剂中中具具有有不不同同的的溶溶解度的原理来进行不同物质的分离纯化。解度的原理来进行不同物质的分离纯化。n n一般采用有机溶剂萃取法一般采用有机溶剂萃取法n n适用于抗生素等小分子物质的分离纯化适用于抗生素等小分子物质的分离纯化3、双水相萃取法、双水相萃取法n n双双水水相相系系统统是是指指某某些些高高聚聚物物之之间间或或高高聚聚物物与与无无机机盐盐之之间间在在水水中中以以适适当当的的浓浓度度溶溶解解会会形形成成互互不不相相溶溶的的两两水水相相或或多多水水相相系系统统。通通过过溶溶质质在在相相

26、间间的的分分配配系系数数的的差差异异而而进进行行萃萃取的方法即为双水相萃取。取的方法即为双水相萃取。n n双水相技术最早出现于双水相技术最早出现于1955年。年。n n到到目目前前为为止止 ,双双水水相相技技术术几几乎乎在在所所有有的的生生物物物物质质的的分分离离纯纯化化中中得得到到应应用用 :如如氨氨基基酸酸、多多肽肽、核核酸酸、细细胞胞器器、细细胞胞膜膜、各各类类细细胞胞、病病毒毒等等 ,特特别别是是成成功功地地应应用用在蛋白质的大规模分离中。在蛋白质的大规模分离中。典型的两水相系统典型的两水相系统双水相萃取的优点双水相萃取的优点n n双双水水相相系系统统之之间间的的传传质质过过程程和和平

27、平衡衡过过程程快快速速 ,因此能耗较小因此能耗较小 , 可以实现快速分离。可以实现快速分离。n n易于进行连续化操作。易于进行连续化操作。n n相相分分离离过过程程温温和和 ,生生化化分分子子如如酶酶不不易易受受到到破破坏。坏。n n选择性高、收率高。选择性高、收率高。n n操作条件温和。操作条件温和。4、吸附法、吸附法n n吸吸附附作作用用：固固体体表表面面的的分分子子或或原原子子具具有有不不饱饱和和的的剩剩余余力力，即即存存在在表表面面力力，所所以以它它们们能能够够吸吸附附外外界界物物质质，使使这这些些外外界界物物质质在在吸吸附附剂剂表表面面形形成成多多分分子子层层或或单单分分子子层层，而

28、而降降低低固固体体表表面面能能，使使自自身身达达到到稳稳定定状状态态。一一般般将将物物质质从从流流体体相相浓浓缩缩到到固固体体表表面面的的过过程程成为吸附作用。成为吸附作用。作为吸附剂的种类：作为吸附剂的种类：无机类无机类 氧化铝、活性碳、硅胶等。氧化铝、活性碳、硅胶等。有机类有机类 淀粉、纤维素和酰胺凝胶等。淀粉、纤维素和酰胺凝胶等。5 、蒸发和膜分离法、蒸发和膜分离法（1）减压蒸发）减压蒸发（2）膜分离法）膜分离法四、高度纯化四、高度纯化n n目目的的是是除除去去各各种种微微量量杂杂质质、进进一一步步提提高高产物纯度，以达到产品规定的纯度要求。产物纯度，以达到产品规定的纯度要求。n n常常

29、用用的的方方法法是是各各类类层层析析，如如离离子子交交换换层层析析、凝凝胶胶层层析析、亲亲和和层层析析、疏疏水水层层析析等等，还可用结晶法精制小分子物质。还可用结晶法精制小分子物质。层析法n n层层层层析析析析法法法法也也也也称称称称色色色色谱谱谱谱法法法法，是是是是1906190619061906年年年年俄俄俄俄国国国国植植植植物物物物学学学学家家家家Michael Michael Michael Michael TswettTswettTswettTswett发发发发现现现现并并并并命命命命名名名名的的的的。他他他他将将将将植植植植物物物物叶叶叶叶子子子子的的的的色色色色素素素素通通通通过

30、过过过装装装装填填填填有有有有吸吸吸吸附附附附剂剂剂剂的的的的柱柱柱柱子子子子，各各各各种种种种色色色色素素素素以以以以不不不不同同同同的的的的速速速速率率率率流流流流动动动动后后后后形形形形成成成成不不不不同同同同的的的的色色色色带带带带 而而而而 被被被被 分分分分 开开开开 ， 由由由由 此此此此 得得得得 名名名名 为为为为 “色色色色 谱谱谱谱 法法法法”（Chromatography) Chromatography) Chromatography) Chromatography) 。n n后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。后来无色物质也可利用吸

31、附柱层析分离。后来无色物质也可利用吸附柱层析分离。n n1944194419441944年出现纸层析。年出现纸层析。年出现纸层析。年出现纸层析。n n以以以以后后后后层层层层析析析析法法法法不不不不断断断断发发发发展展展展，相相相相继继继继出出出出现现现现气气气气相相相相层层层层析析析析、高高高高压压压压液液液液相相相相层层层层析析析析、薄薄薄薄层层层层层层层层析析析析、亲亲亲亲和和和和层层层层析析析析、凝凝凝凝胶层析等。胶层析等。胶层析等。胶层析等。层析法的基本原理n n层析法是利用混合物中各组分物理化学性质层析法是利用混合物中各组分物理化学性质层析法是利用混合物中各组分物理化学性质层析法是

32、利用混合物中各组分物理化学性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相亲和力、分配系数等），使各组分在两相亲和力、分配系数等），使各组分在两相亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定相；另一相流过（一相为固定的，称为固定相；另一相流过（一相为固定的，称为固定相；另一相流过（一相为固定的，称为固定相；另一相流过固定相，称为流动相）中的分布程度不同，固定相，称为流动相）中的分布程度不同，固定相，称为流动相）中的分布程度不同，固定相，

33、称为流动相）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离从而使各组分以不同的速度移动而达到分离从而使各组分以不同的速度移动而达到分离从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。的目的。的目的。的目的。层析技术的分类层析技术的分类 (1) 按按流流动动相相的的状状态态分分类类：用用液液体体作作为为流流动动相相的的称称为为液液相相层层析析，或或称称液液相相色色谱谱；以以气气体体作作为流动相的称为气相层析，或称为流动相的称为气相层析，或称气相色谱气相色谱。 (2) 按按固固定定相相的的使使用用形形式式分分类类：可可分分为为柱柱层层析析(固固定定相相填填装装在在玻玻璃璃或或不不锈锈钢钢管

34、管中中构构成成层层析析柱柱) 、纸层析、薄层层析、薄膜层析纸层析、薄层层析、薄膜层析等。等。 (3) 按按分分离离过过程程所所主主要要依依据据的的物物理理化化学学原原理理分分类类：可可分分为为吸吸附附层层析析、分分配配层层析析、离离子子交交换换层析、分子排阻层析、亲和层析层析、分子排阻层析、亲和层析等。等。1 1、 离子交换层析离子交换层析(ion exchange chromatography，IEC) 以以离离子子交交换换剂剂为为固固定定相相，依依据据流流动动相相中中的的组组分分离离子子与与交交换换剂剂上上的的平平衡衡离离子子进进行行可可逆逆交交换换时时的的结结合合力力大大小小的的差差别别

35、进进行行分分离离的的一种层析方法。一种层析方法。 （1）基本原理）基本原理 离离子子交交换换剂剂（固固定定相相）是是由由载载体体、电电荷荷基基团团(或或功功能能基基团团)和和反反离离子子或或平平衡衡离离子子构构成成的的，基基质质与与电电荷荷基基因因以以共共价价键键连连接接，电电荷荷基因与反离子以离子键结合。基因与反离子以离子键结合。 离离离离子子子子交交交交换换换换剂剂剂剂与与与与水水水水溶溶溶溶液液液液中中中中离离离离子子子子或或或或离离离离子子子子化化化化合合合合物物物物的的的的反反反反应应应应主主主主要要要要以以以以离离离离子子子子交交交交换换换换方方方方式式式式进进进进行行行行，假假假

36、假设设设设以以以以RARA+ +代代代代表表表表阳阳阳阳离离离离子子子子交交交交换换换换剂剂剂剂，其其其其中中中中A A+ +为为为为反反反反离离离离子子子子，A A+ +能能能能够够够够与与与与溶溶溶溶液液液液中中中中的的的的阳阳阳阳离离离离子子子子B B+ +发发发发生生生生可可可可逆逆逆逆的的的的交交交交换换换换反反反反应应应应，反反反反应应应应式式式式为为为为：RARA+ +B+B+ + RBRB+ +A+A+ + 离子交换剂根据分离的物质所带电荷不同可分为：离子交换剂根据分离的物质所带电荷不同可分为：离子交换剂根据分离的物质所带电荷不同可分为：离子交换剂根据分离的物质所带电荷不同可分

37、为：n n阳离子交换剂阳离子交换剂 n n阴离子交换剂阴离子交换剂 阳离子交换剂 阳阳阳阳离离离离子子子子交交交交换换换换剂剂剂剂的的的的电电电电荷荷荷荷基基基基团团团团带带带带负负负负电电电电，装装装装柱柱柱柱平平平平衡衡衡衡后后后后与与与与缓缓缓缓冲冲冲冲溶溶溶溶液液液液中中中中的的的的带带带带正正正正电电电电反反反反离离离离子子子子结结结结合合合合。因因因因此此此此，可可可可以以以以与与与与待待待待分分分分离离离离溶溶溶溶液液液液中中中中的的的的正正正正电电电电荷荷荷荷化化化化合合合合物物物物或或或或阳阳阳阳离离离离子子子子进进进进行行行行交交交交换换换换反反反反应应应应。待待待待分分分

38、分离离离离溶溶溶溶液液液液中中中中可可可可能能能能有有有有正正正正电电电电荷荷荷荷、负负负负电电电电荷荷荷荷和和和和中中中中性性性性电电电电荷荷荷荷。加加加加样样样样后后后后，正正正正电电电电荷荷荷荷基基基基团团团团可可可可以以以以与与与与阳阳阳阳离离离离子子子子交交交交换换换换剂剂剂剂的的的的反反反反离离离离子子子子进进进进行行行行交交交交换换换换而而而而留留留留在在在在交交交交换换换换剂剂剂剂上上上上，负负负负电电电电荷荷荷荷和和和和中中中中性性性性电电电电荷荷荷荷则则则则随随随随流流流流动动动动相相相相流流流流出出出出。然然然然后后后后选选选选用用用用适适适适当当当当的的的的洗洗洗洗脱脱

39、脱脱液液液液将将将将结结结结合合合合的的的的各各各各种种种种正正正正电电电电荷荷荷荷按按按按照照照照与与与与交换剂的结合能力大小不同而洗脱下来。交换剂的结合能力大小不同而洗脱下来。交换剂的结合能力大小不同而洗脱下来。交换剂的结合能力大小不同而洗脱下来。 根根据据电电荷荷基基团团的的强强弱弱，又又可可将将阳阳离离子子交交换换剂剂分分为为强强酸酸型型( 带带磺磺酸酸基基团团)、中中强强酸酸型型(带带磷磷酸酸基基团团或或亚亚磷磷酸酸基基团团)和和弱弱酸酸型型(带羧基的或酚基带羧基的或酚基)三种。三种。 阴离子交换剂n n 阴阴离离子子交交换换剂剂是是在在载载体体中中分分别别引引入入季季胺胺-N(CH

40、3)3、叔叔胺胺-N(CH3)2、仲仲胺胺 -NHCH3和和伯伯胺胺-NH2基基团团构构成成的的。当当引引入入季季胺胺和和叔叔胺胺基基团团时时，分分别别为为强强阴阴性性和和中中强强阴阴性性离离子子交交换换剂剂。当当引引入入仲仲胺胺和和伯伯胺胺基基团团时时，为为弱弱阴阴性性离离子交换剂。子交换剂。 交换剂交换剂交换剂交换剂名名名名 称称称称（纤维（纤维（纤维（纤维素）素）素）素）作作作作 用用用用 基基基基 团团团团特特特特 点点点点阴离子阴离子阴离子阴离子交换剂交换剂交换剂交换剂二乙氨二乙氨二乙氨二乙氨基乙基基乙基基乙基基乙基DEAEDEAE+ +-O-C-O-C2 2HH4 4N N+ +(

41、C(C2 2HH5 5) )2 2HH最常用在最常用在最常用在最常用在pH8.6pH8.6以下以下以下以下三乙氨三乙氨三乙氨三乙氨基乙基基乙基基乙基基乙基DEAEDEAE+ +-O-C-O-C2 2HH4 4N N+ +(C(C2 2HH5 5) )2 2HH氨乙基氨乙基氨乙基氨乙基AEAE+ +-O-C-O-C2 2 H H4 4-N H-N H2 2胍乙基胍乙基胍乙基胍乙基强碱性、极高强碱性、极高强碱性、极高强碱性、极高pHpH仍有效仍有效仍有效仍有效阳离子阳离子阳离子阳离子交换剂交换剂交换剂交换剂羧甲基羧甲基羧甲基羧甲基CMCM-O-CH-O-CH2 2-COO-COO最常用在最常用在最

42、常用在最常用在pH4pH4以上以上以上以上磷酸磷酸磷酸磷酸P P-O- P O-O- P O2 2用于低用于低用于低用于低pHpH磺甲基磺甲基磺甲基磺甲基SMSM-O-CH-O-CH2 2-SO-SO3 3磺乙基磺乙基磺乙基磺乙基SESE-O-C-O-C2 2HH4 4-SO-SO3 3强酸性用于极低强酸性用于极低强酸性用于极低强酸性用于极低pHpHIon exchange chromatographyn n离子交换层析之所以能成功地把各种无离子交换层析之所以能成功地把各种无机离子、有机离子或生物大分子物质分机离子、有机离子或生物大分子物质分开，其主要依据是开，其主要依据是离子交换剂对各种离离

43、子交换剂对各种离子或离子化合物有不同的结合力子或离子化合物有不同的结合力。 两两性性离离子子如如蛋蛋白白质质、酶酶类类、多多肽肽和和核核苷苷酸酸等等物物质质与与离离子子交交换换剂剂的的结结合合力力，主主要要取取决决于于它它们们的的物物理理化化学学性性质质和和在在特特定定pH条条件件下下呈呈现现的的离离子子状状态态。当当pH低低于于等等电电点点(pI)时时，它它们们带带正正电电荷荷能能与与阳阳离离子子交交换换剂剂结结合合；反反之之，pH高高于于pI时时，它它们带负电荷能与阴离子交换剂结合们带负电荷能与阴离子交换剂结合 。等电点：当溶液在某一定等电点：当溶液在某一定pH环境中，使蛋白质所带正、负电

44、荷环境中，使蛋白质所带正、负电荷相等，净电荷为零，在电场中不向阳极也不向阴极移动。相等，净电荷为零，在电场中不向阳极也不向阴极移动。酸性氨基酸酸性氨基酸pI7,碱性氨基酸碱性氨基酸pI 7。蛋白质蛋白质pI与所含氨基酸与所含氨基酸种类和数量有关，若蛋白质中碱性种类和数量有关，若蛋白质中碱性Aa较多较多,其其pI偏碱。偏碱。pH与与pI的差值越大，带电量越大，与交换剂的结合力越强。的差值越大，带电量越大，与交换剂的结合力越强。 负电荷负电荷正电荷正电荷、离子交换层析基本操作、离子交换层析基本操作利利用用离离子子交交换换层层析析分分离离纯纯化化生生物物大大分分子子可可以采用两种方式：以采用两种方式

45、： 一一是是将将目目的的产产物物离离子子化化，然然后后被被交交换换到到介介质质上上，而而杂杂质质不不被被吸吸附附，从从柱柱中中流流出出，称称为为正吸附。正吸附。 二二是是将将杂杂质质离离子子化化后后被被交交换换，目目的的产产物物不不被交换而直接流出，称为负吸附。被交换而直接流出，称为负吸附。 n n（）离子交换剂的选择（）离子交换剂的选择n n（）离子交换剂的预处理、再生（）离子交换剂的预处理、再生和保存和保存（）离子交换剂的选择（）离子交换剂的选择n n选择合适的离子交换剂：取决于被分离物质在选择合适的离子交换剂：取决于被分离物质在选择合适的离子交换剂：取决于被分离物质在选择合适的离子交换剂

46、：取决于被分离物质在其稳定的其稳定的其稳定的其稳定的pHpH下所带的电荷，如果带正电荷则选用下所带的电荷，如果带正电荷则选用下所带的电荷，如果带正电荷则选用下所带的电荷，如果带正电荷则选用阳离子交换剂；如带负电荷则选用阴离子交换剂。阳离子交换剂；如带负电荷则选用阴离子交换剂。阳离子交换剂；如带负电荷则选用阴离子交换剂。阳离子交换剂；如带负电荷则选用阴离子交换剂。n n选择离子交换剂基质：聚苯乙烯等疏水性较强选择离子交换剂基质：聚苯乙烯等疏水性较强选择离子交换剂基质：聚苯乙烯等疏水性较强选择离子交换剂基质：聚苯乙烯等疏水性较强的离子交换剂一般常用于分离小分子物质。纤维的离子交换剂一般常用于分离小

47、分子物质。纤维的离子交换剂一般常用于分离小分子物质。纤维的离子交换剂一般常用于分离小分子物质。纤维素、葡聚糖、琼脂糖等交换剂亲水性较强，适合素、葡聚糖、琼脂糖等交换剂亲水性较强，适合素、葡聚糖、琼脂糖等交换剂亲水性较强，适合素、葡聚糖、琼脂糖等交换剂亲水性较强，适合于分离蛋白质等大分子物质。于分离蛋白质等大分子物质。于分离蛋白质等大分子物质。于分离蛋白质等大分子物质。 （）离子交换剂的预处理、再生和保存1)1)预处理预处理预处理预处理取适量的固体离子交换剂先用水浸泡，待充分膨取适量的固体离子交换剂先用水浸泡，待充分膨取适量的固体离子交换剂先用水浸泡，待充分膨取适量的固体离子交换剂先用水浸泡，待

48、充分膨胀后即可进行处理。胀后即可进行处理。胀后即可进行处理。胀后即可进行处理。常规的处理步骤是，加过量的水悬浮除去细颗粒，常规的处理步骤是，加过量的水悬浮除去细颗粒，常规的处理步骤是，加过量的水悬浮除去细颗粒，常规的处理步骤是，加过量的水悬浮除去细颗粒，而后改用酸碱浸泡，以便除去杂质并使其带上需要而后改用酸碱浸泡，以便除去杂质并使其带上需要而后改用酸碱浸泡，以便除去杂质并使其带上需要而后改用酸碱浸泡，以便除去杂质并使其带上需要的反离子。的反离子。的反离子。的反离子。阳离子交换剂通常为阳离子交换剂通常为阳离子交换剂通常为阳离子交换剂通常为NaNa型（即活性离子是型（即活性离子是型（即活性离子是型

49、（即活性离子是NaNa+ ）阴离子交换剂为）阴离子交换剂为）阴离子交换剂为）阴离子交换剂为ClCl型（即活性离子是型（即活性离子是型（即活性离子是型（即活性离子是ClCl- - ）。）。）。）。 22）再生）再生）再生）再生 使用过的离子交换剂，可采用一定的方法令使用过的离子交换剂，可采用一定的方法令使用过的离子交换剂，可采用一定的方法令使用过的离子交换剂，可采用一定的方法令其恢复原来的性状，这一过程叫再生。再生可以其恢复原来的性状，这一过程叫再生。再生可以其恢复原来的性状，这一过程叫再生。再生可以其恢复原来的性状，这一过程叫再生。再生可以通过上述的酸、碱反复处理完成，但有时也可以通过上述的酸

50、、碱反复处理完成，但有时也可以通过上述的酸、碱反复处理完成，但有时也可以通过上述的酸、碱反复处理完成，但有时也可以借助转型处理完成。借助转型处理完成。借助转型处理完成。借助转型处理完成。所谓转型是指离子交换剂由一种反离子转到另所谓转型是指离子交换剂由一种反离子转到另所谓转型是指离子交换剂由一种反离子转到另所谓转型是指离子交换剂由一种反离子转到另一种反离子的过程，转型后的离子交换剂会按使一种反离子的过程，转型后的离子交换剂会按使一种反离子的过程，转型后的离子交换剂会按使一种反离子的过程，转型后的离子交换剂会按使用要求带上一定种类的离子或基团。用要求带上一定种类的离子或基团。用要求带上一定种类的离

51、子或基团。用要求带上一定种类的离子或基团。3)3)保存保存保存保存一般加入一般加入一般加入一般加入0.02%0.02%的叠氮钠，的叠氮钠，的叠氮钠，的叠氮钠，4 4保存。保存。保存。保存。 （）层析柱（）层析柱（）层析柱（）层析柱 离子交换层析要根据分离的样品量选择合适离子交换层析要根据分离的样品量选择合适离子交换层析要根据分离的样品量选择合适离子交换层析要根据分离的样品量选择合适的层析柱，离子交换用的层析柱一般粗而短，不的层析柱，离子交换用的层析柱一般粗而短，不的层析柱，离子交换用的层析柱一般粗而短，不的层析柱，离子交换用的层析柱一般粗而短，不宜过长。直径和柱长比一般为宜过长。直径和柱长比一

52、般为宜过长。直径和柱长比一般为宜过长。直径和柱长比一般为1 1：10101 1：5050之之之之间，层析柱安装要垂直。装柱时要均匀平整，不间，层析柱安装要垂直。装柱时要均匀平整，不间，层析柱安装要垂直。装柱时要均匀平整，不间，层析柱安装要垂直。装柱时要均匀平整，不能有气泡。能有气泡。能有气泡。能有气泡。 （）平衡缓冲液（）平衡缓冲液（）平衡缓冲液（）平衡缓冲液 平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于平衡离子平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于平衡离子平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于平衡离子平衡缓冲液是指装柱后及上样后用于平衡离子交换柱的缓冲液。平衡缓冲液的离子强度和交换柱的缓冲液。平衡缓冲液的离子强度和

53、交换柱的缓冲液。平衡缓冲液的离子强度和交换柱的缓冲液。平衡缓冲液的离子强度和pHpH值的值的值的值的选择首先要保证各个待分离物质的稳定。其次是要选择首先要保证各个待分离物质的稳定。其次是要选择首先要保证各个待分离物质的稳定。其次是要选择首先要保证各个待分离物质的稳定。其次是要使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合，并使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合，并使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合，并使各个待分离物质与离子交换剂有适当的结合，并尽量使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较尽量使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较尽量使待分离样品和杂质与离子交换剂的结合有较尽量使待分离样品

54、和杂质与离子交换剂的结合有较大的差别。大的差别。大的差别。大的差别。一般是使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结一般是使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结一般是使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结一般是使待分离样品与离子交换剂有较稳定的结合。而尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳合。而尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳合。而尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳合。而尽量使杂质不与离子交换剂结合或结合不稳定。定。定。定。 （）上样（）上样（）上样（）上样 离子交换层析的上样时应注意样品液的离子强离子交换层析的上样时应注意样品液的离子强离子交换层析的上样时应注意样品液的离子强离子交换层析的上

55、样时应注意样品液的离子强度和度和度和度和pHpH值，上样量也不宜过大，一般为柱床体积的值，上样量也不宜过大，一般为柱床体积的值，上样量也不宜过大，一般为柱床体积的值，上样量也不宜过大，一般为柱床体积的1%-5%(1%-5%(体积分数体积分数体积分数体积分数) )为宜，以使样品能吸附在层析为宜，以使样品能吸附在层析为宜，以使样品能吸附在层析为宜，以使样品能吸附在层析柱的上层，得到较好的分离效果。柱的上层，得到较好的分离效果。柱的上层，得到较好的分离效果。柱的上层，得到较好的分离效果。用注射器或细长的玻管沿柱壁绕环加入酶样，用注射器或细长的玻管沿柱壁绕环加入酶样，用注射器或细长的玻管沿柱壁绕环加入

56、酶样，用注射器或细长的玻管沿柱壁绕环加入酶样，待样液达一定高度后再在柱中间小心加样。待样液达一定高度后再在柱中间小心加样。待样液达一定高度后再在柱中间小心加样。待样液达一定高度后再在柱中间小心加样。（）洗脱（）洗脱（）洗脱（）洗脱在离子交换层析中一般常用梯度洗脱，通常有改在离子交换层析中一般常用梯度洗脱，通常有改在离子交换层析中一般常用梯度洗脱，通常有改在离子交换层析中一般常用梯度洗脱，通常有改变离子强度和改变变离子强度和改变变离子强度和改变变离子强度和改变pHpH值两种方式。值两种方式。值两种方式。值两种方式。改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离

57、子改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子改变离子强度通常是在洗脱过程中逐步增大离子强度，从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下强度，从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下强度，从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下强度，从而使与离子交换剂结合的各个组分被洗脱下来；而改变来；而改变来；而改变来；而改变pHpH值的洗脱，对于阳离子交换剂一般是值的洗脱，对于阳离子交换剂一般是值的洗脱，对于阳离子交换剂一般是值的洗脱，对于阳离子交换剂一般是pHpH值从低到高洗脱，阴离子交换剂一般是值从低到高洗脱，阴离子交换剂一般是值从低到高洗脱，阴离子交换剂一般是值从低到高洗脱，阴离子交换剂一般是pHpH值

58、从高值从高值从高值从高到低。到低。到低。到低。 由于由于由于由于pHpH值可能对蛋白的稳定性有较大的影响，故值可能对蛋白的稳定性有较大的影响，故值可能对蛋白的稳定性有较大的影响，故值可能对蛋白的稳定性有较大的影响，故一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱一般通常采用改变离子强度的梯度洗脱 。 （7 7）样品的浓缩、脱盐）样品的浓缩、脱盐）样品的浓缩、脱盐）样品的浓缩、脱盐离子交换层析得到的样品往往盐的质量分数较离子交换层析得到的样品往往盐的质量分数较离子交换层析得到的样品往往盐的质量分数较离子交换层析得到的样品往往盐的质量分数较高

59、，而且体积较大，样品质量分数较低。所以一般高，而且体积较大，样品质量分数较低。所以一般高，而且体积较大，样品质量分数较低。所以一般高，而且体积较大，样品质量分数较低。所以一般离子交换层析得到的样品要进行浓缩、脱盐处理。离子交换层析得到的样品要进行浓缩、脱盐处理。离子交换层析得到的样品要进行浓缩、脱盐处理。离子交换层析得到的样品要进行浓缩、脱盐处理。2、 凝胶层析凝胶层析 凝胶层析的原理：凝胶层析的原理： 当当不不同同大大小小分分子子的的酶酶蛋蛋白白混混合合物物流流经经凝凝胶胶层层析析柱柱时时，比比凝凝胶胶网网状状孔孔大大的的分分子子不不能能进进入入珠珠内内网网状状结结构构而而被被排排阻阻在在凝

60、凝胶胶珠珠之之外外，随随着着溶溶剂剂在在凝凝胶胶珠珠之之间间的的孔孔隙隙向向下下先先被被洗洗脱脱下下来来，小小分分子子物物质质后后被被洗洗脱脱下来。下来。3、亲和层析、亲和层析n n亲亲和和层层析析：根根据据流流动动相相中中的的生生物物大大分分子子与与固固定定相相表表面面偶偶联联的的特特异异性性配配基基发发生生相相互互作作用用，有有选选择择地地吸吸附附溶溶液液中中的的大大分分子子而而进进行行的层析分离方法。的层析分离方法。n n基于蛋白质的生物学特性基于蛋白质的生物学特性亲和层析亲和层析 原原原原理理理理：利利利利用用用用生生生生物物物物大大大大分分分分子子子子和和和和固固固固定定定定相相相相

61、表表表表面面面面存存存存在在在在的的的的某某某某种种种种特特特特异异异异性性性性亲亲亲亲和和和和力力力力，进进进进行行行行选选选选择择择择性性性性分分分分离离离离。先先先先在在在在载载载载体体体体表表表表面面面面键键键键合合合合上上上上一一一一种种种种具具具具有有有有一一一一般般般般反反反反应应应应性性性性能能能能的的的的所所所所谓谓谓谓间间间间隔隔隔隔臂臂臂臂( (环环环环氧氧氧氧、联联联联胺胺胺胺等等等等) )，再再再再连连连连接接接接上上上上配配配配基基基基( (酶酶酶酶、抗抗抗抗原原原原等等等等) )，这这这这种种种种固固固固载载载载化化化化的的的的配配配配基基基基将将将将只只只只能能

62、能能和和和和具具具具有有有有亲亲亲亲和和和和力力力力特特特特性性性性吸吸吸吸附附附附的的的的生生生生物物物物大大大大分分分分子子子子作作作作用用用用而而而而被被被被保保保保留留留留。改改改改变变变变淋洗液后洗脱。淋洗液后洗脱。淋洗液后洗脱。淋洗液后洗脱。亲和层析的应用1 1） 抗原和抗体抗原和抗体抗原和抗体抗原和抗体 利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行利用抗原、抗体之间高特异的亲和力而进行分离的方法又称为免疫亲和层析。例如将抗原分离的方法又称为免疫亲和层析。例如将抗原分离的方法又称为免疫亲和层析。例如将抗原分离的方

63、法又称为免疫亲和层析。例如将抗原结合于亲和层析基质上，就可以从血清中分离结合于亲和层析基质上，就可以从血清中分离结合于亲和层析基质上，就可以从血清中分离结合于亲和层析基质上，就可以从血清中分离其对应的抗体。其对应的抗体。其对应的抗体。其对应的抗体。抗原、抗体间亲和力一般比较强，所以洗脱时抗原、抗体间亲和力一般比较强，所以洗脱时抗原、抗体间亲和力一般比较强，所以洗脱时抗原、抗体间亲和力一般比较强，所以洗脱时是比较困难的，通常需要较强烈的洗脱条件。是比较困难的，通常需要较强烈的洗脱条件。是比较困难的，通常需要较强烈的洗脱条件。是比较困难的，通常需要较强烈的洗脱条件。2)激素和受体蛋白激素和受体蛋白

64、利用激素和受体蛋白间的高亲和力利用激素和受体蛋白间的高亲和力而进行亲和层析是分离受体蛋白的重要方而进行亲和层析是分离受体蛋白的重要方法。目前已经用亲和层析方法纯化出了大法。目前已经用亲和层析方法纯化出了大量的受体蛋白，如乙酰胆碱、肾上腺素、量的受体蛋白，如乙酰胆碱、肾上腺素、生长激素、吗啡、胰岛素等等多种激素的生长激素、吗啡、胰岛素等等多种激素的受体。受体。3)3)凝集素和糖蛋白凝集素和糖蛋白凝集素和糖蛋白凝集素和糖蛋白 凝集素是一类具有多种特性的糖蛋白，几乎都凝集素是一类具有多种特性的糖蛋白，几乎都凝集素是一类具有多种特性的糖蛋白，几乎都凝集素是一类具有多种特性的糖蛋白，几乎都是从植物中提取

65、。它们能识别特殊的糖，因此可是从植物中提取。它们能识别特殊的糖，因此可是从植物中提取。它们能识别特殊的糖，因此可是从植物中提取。它们能识别特殊的糖，因此可以用于分离多糖、各种糖蛋白、免疫球蛋白、血以用于分离多糖、各种糖蛋白、免疫球蛋白、血以用于分离多糖、各种糖蛋白、免疫球蛋白、血以用于分离多糖、各种糖蛋白、免疫球蛋白、血清蛋白甚至完整的细胞。清蛋白甚至完整的细胞。清蛋白甚至完整的细胞。清蛋白甚至完整的细胞。用凝集素作为配体的亲和层析是分离糖蛋白的主用凝集素作为配体的亲和层析是分离糖蛋白的主用凝集素作为配体的亲和层析是分离糖蛋白的主用凝集素作为配体的亲和层析是分离糖蛋白的主要方法。要方法。要方法

66、。要方法。伴刀豆球蛋白伴刀豆球蛋白A能结合含能结合含-D-吡喃甘露糖苷吡喃甘露糖苷或或-D-吡喃葡萄糖苷的糖蛋白。吡喃葡萄糖苷的糖蛋白。麦胚凝集素可以特异的与麦胚凝集素可以特异的与N-乙酰氨基葡萄乙酰氨基葡萄糖或糖或N-乙酰神经氨酸结合，可以用于血型糖蛋白乙酰神经氨酸结合，可以用于血型糖蛋白A、红细胞膜凝集素受体等的分离。、红细胞膜凝集素受体等的分离。洗脱时只需用相应的单糖或类似物，就可以将洗脱时只需用相应的单糖或类似物，就可以将待分离的糖蛋白洗脱下来。待分离的糖蛋白洗脱下来。4）多核苷酸和核酸）多核苷酸和核酸利用利用poly-U作为配体可以用于分离作为配体可以用于分离mRNA以及各种以及各种

67、poly-U结合蛋白。结合蛋白。poly-A可以用于分离可以用于分离RNA聚合酶以及其它聚合酶以及其它poly-A结合蛋白。结合蛋白。n n以以DNA作为配体可以用于分离各种作为配体可以用于分离各种DNA结结合蛋白、合蛋白、DNA聚合酶、聚合酶、RNA聚合酶、核酸聚合酶、核酸外切酶等多种酶类。外切酶等多种酶类。5）辅酶）辅酶核苷酸及其许多衍生物、各种维生素等是多核苷酸及其许多衍生物、各种维生素等是多种酶的辅酶或辅助因子，利用它们与对应酶的种酶的辅酶或辅助因子，利用它们与对应酶的亲和力可以对多种酶类进行分离纯化。亲和力可以对多种酶类进行分离纯化。例如固定的各种腺嘌呤核苷酸辅酶，包括例如固定的各种

68、腺嘌呤核苷酸辅酶，包括AMP、cAMP、ADP、ATP、CoA、NAD+、NADP+等等应用很广泛，可以用于分离各种激酶和脱等等应用很广泛，可以用于分离各种激酶和脱氢酶。氢酶。6）分离病毒、细胞）分离病毒、细胞利用配体与病毒、细胞表面受体的相互利用配体与病毒、细胞表面受体的相互作用，亲和层析也可以用于病毒和细胞作用，亲和层析也可以用于病毒和细胞的分离。的分离。利用凝集素、抗原、抗体等作为配体利用凝集素、抗原、抗体等作为配体都可以用于细胞的分离。都可以用于细胞的分离。例如各种凝集素可以用于分离红细胞例如各种凝集素可以用于分离红细胞以及各种淋巴细胞，胰岛素可以用于分以及各种淋巴细胞，胰岛素可以用于

69、分离脂肪细胞等。离脂肪细胞等。五、成品加工五、成品加工n n成成品品加加工工还还包包括括浓浓缩缩、无无菌菌过过滤滤、去去热源、加稳定剂、干燥等步骤。热源、加稳定剂、干燥等步骤。n n发酵液特性不同、生产菌种不同、发酵发酵液特性不同、生产菌种不同、发酵产物类型不同、产物的理化性质不同以产物类型不同、产物的理化性质不同以及最终产品的形态和纯度不同均可影响及最终产品的形态和纯度不同均可影响提取和精制方法的选择。提取和精制方法的选择。选择纯化分离方法和设备的原则：选择纯化分离方法和设备的原则：n n产品的价值产品的价值n n产品的质量和指标产品的质量和指标n n目的产物和杂质特殊的理化性质目的产物和杂质特殊的理化性质n n各种可能分离方法的经济对比各种可能分离方法的经济对比