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1、细胞培养中的细节问题细胞培养中的细节问题基础篇基础篇- -无菌操作基本技术无菌操作基本技术 1. 1. 实验进行前，无菌室及无菌操作台实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) (laminar flow) 以紫外灯照射以紫外灯照射30-60 30-60 分钟灭菌，以分钟灭菌，以70 %ethanol 70 %ethanol 擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 10 分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基分钟后，才开始实验操作。每次操作只处理一株细胞株，且即使培养基相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或
2、细胞间污染。实验完毕后，将实验相同亦不共享培养基，以避免失误混淆或细胞间污染。实验完毕后，将实验物品带出工作台，以物品带出工作台，以70 % ethanol 70 % ethanol 擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌擦拭无菌操作抬面。操作间隔应让无菌操作台运转操作台运转10 10 分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。分钟以上后，再进行下一个细胞株之操作。 2. 2. 无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验
3、用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以流通。实验用品以70 % ethanol 70 % ethanol 擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。在抬面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。 3. 3. 小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器小心取用无菌之实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约握住瓶身，倾斜约45 45 角取
4、用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。 4. 4. 工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实工作人员应注意自身之安全，须穿戴实验衣及手套后才进行实验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选验。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台择适当等级之无菌操作台( (至少至少Class II)Class II)。操作过程中，应避免。操作过程中，应避免引起引起aerosol aerosol 之产生，小心毒性药品，例如之产生，小心毒性药品，例如DMSO DMSO 及及TPA TPA 等，并避等，并避免尖锐针头之
5、伤害等。免尖锐针头之伤害等。 5. 5. 定期检测下列项目：定期检测下列项目： 5.1. CO2 5.1. CO2 钢瓶之钢瓶之CO2 CO2 压力压力 5.2. CO2 5.2. CO2 培养箱之培养箱之CO2 CO2 浓度、温度、及水盘是否有污染浓度、温度、及水盘是否有污染( (水盘的水盘的水用无菌水，每周更换水用无菌水，每周更换) )。 5.3. 5.3. 无菌操作台内之无菌操作台内之airflow airflow 压力，定期更换紫外线灯管及压力，定期更换紫外线灯管及HEPA HEPA 过滤膜，预滤网过滤膜，预滤网(300(300小时小时/ /预滤网，预滤网，3000 3000 小时小时
6、/HEPA)/HEPA)。 6. 6. 水槽可添加消毒剂水槽可添加消毒剂(Zephrin 1:750)(Zephrin 1:750)，定期更换水槽的水。，定期更换水槽的水。基础篇基础篇- -实验用品实验用品 1.种类种类1.1.细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器细胞培养实验用品均为无菌，除了玻璃容器与与pasteurpipet外，其它均为塑料无菌制品。外，其它均为塑料无菌制品。1.2.TC级培养盘表面均有级培养盘表面均有coating高分子物质以高分子物质以让细胞吸附，培养容器种类有让细胞吸附，培养容器种类有Tflask，plates,dishes,rollerbottle等，依实验需要使
7、用。等，依实验需要使用。1.3.plasticsterilepipet:1ml,2ml,5ml,10ml,25ml1.4.塑料离心管塑料离心管:15ml,50ml，均有，均有2种不同材种不同材质，其中质，其中polypropylene(PP)为不透明材质，为不透明材质，polystyrene(PS)为透明材质，可依实验需要而为透明材质，可依实验需要而选择适合材质之离心管。选择适合材质之离心管。1.5.glasspastuerpipet:9inch，用以抽掉废弃，用以抽掉废弃培养液等。培养液等。1.6.玻璃血清瓶玻璃血清瓶(PyrexorDuranglassware)：100ml,250ml,5
8、00ml,1000ml2.清洗清洗2.1.新购玻璃血清瓶先以新购玻璃血清瓶先以0.10.05NHCl浸泡数小时，浸泡数小时，洗净后才开始使用。洗净后才开始使用。2.2.用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。3.灭菌灭菌3.1.实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌灭菌121,15lb,20分钟，置于分钟，置于oven中烘干。中烘干。3.2.实验用玻璃实验用玻璃pasteurpipet以干热灭菌以干热灭菌1
9、70,4小小时。时。3.3.液体或是固体废弃物可用液体或是固体废弃物可用10%hypochloride溶溶液液(次氯酸，即漂白水次氯酸，即漂白水)或是蒸汽高压灭菌或是蒸汽高压灭菌121,15lb,20分钟处理。分钟处理。基础篇基础篇- -培养基培养基 1.液体培养基贮存于液体培养基贮存于4冰箱，避免光照，实验进行前冰箱，避免光照，实验进行前放在放在37水槽中温热。水槽中温热。2.液体培养基液体培养基(加血清加血清)存放期为六个月，期间存放期为六个月，期间glutamine可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量适量glutamine。3.粉末培养基配制粉
10、末培养基配制(以以1升为例升为例)：3.1.细胞培养基通常须添加细胞培养基通常须添加10%血清，因此粉末培养血清，因此粉末培养基之配制体积为基之配制体积为900ml，pH为为7.2-7.4。NaHCO3为为另外添加，若将另外添加，若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中粉末直接加入液体培养基中会造成会造成pH之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3粉末应分别溶解后才混合，然后用粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2气体气体调整调整pH，而非用强酸，而非用强酸(HCl)或强碱或强碱(NaOH)，因为氯离子，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的
11、对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH易发生易发生改变。改变。3.2.材料：材料：纯水纯水(milli-Q水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要水或二次至三次蒸馏水，水品质非常重要)，粉末，粉末培养基培养基，NaHCO3，电磁搅拌器，电磁搅拌器无菌血清瓶无菌血清瓶，0.1或或0.2mm无无菌过滤膜菌过滤膜，pH计，真空泵，计，真空泵，CO2气体气体3.3.步骤：步骤：3.3.1.取粉末培养基溶于取粉末培养基溶于700mlmilli-Q水中，搅拌使其溶解。水中，搅拌使其溶解。3.3.2.称取适量之称取适量之NaHCO3粉末溶于粉末溶于200mlmilli-Q水中，搅拌水中，搅拌使其溶解，然后通
12、入使其溶解，然后通入CO2气体至饱和，约气体至饱和，约3-5分钟。分钟。3.3.3.将溶解且含饱和将溶解且含饱和CO2之之NaHCO3溶液加入溶解之液体培养溶液加入溶解之液体培养基中混合。混后溶液之基中混合。混后溶液之pH应为，除非应为，除非pH值偏差太大，否则不需值偏差太大，否则不需用酸碱再调整之。若为太碱，可再通入用酸碱再调整之。若为太碱，可再通入CO2气体调整气体调整pH。培养。培养基以真空帮浦通过过滤膜时，基以真空帮浦通过过滤膜时，pH会升高。会升高。3.3.4.以以0.1或或0.2mm无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容无菌过滤膜过滤灭菌，同时分装至无菌容器中，标示培养基种类、日期、
13、瓶号等，贮存于器中，标示培养基种类、日期、瓶号等，贮存于4。(血清亦可血清亦可加入培养基中一起过滤加入培养基中一起过滤)3.3.5.配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。配制之培养基配制须作生长试验与污染测试。附附- -配制培养基之生长测试配制培养基之生长测试 材料：材料：MDCKcell(ATCCCCL-34或或CCRC60004)6-wellTCplate(or35mmTCdish)methanolglacialaceticacid10%Giemsasolution(GibcoBRL10092-013)步骤：步骤：1.以待测试培养基培养以待测试培养基培养MDCKcell，接种，接种MDC
14、K细胞于细胞于6-wellplate(或或35mmTCdish)中，每个中，每个well接种接种1102活细胞，同时作对照活细胞，同时作对照组实验。组实验。2.接种接种57天后，在天后，在100倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长，待倍倒立显微镜作观察细胞群落之生长，待细胞群落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触时即可。细胞群落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触时即可。3.去除培养基，加入去除培养基，加入1mlCarnoys固定液固定液(甲醇：冰醋酸甲醇：冰醋酸3:1)，室温下静置室温下静置10min。4.去除固定液，水洗二次。去除固定液，水洗二次。5.加入加入1ml10%Giemsasolut
15、ion，室温下静置染色，室温下静置染色2-3min。6.去除染液，水洗二次。去除染液，水洗二次。7.以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批号的培养基对细胞以肉眼计数群落数，并比较之，若新配制或新批号的培养基对细胞生长不佳，则丢弃之。生长不佳，则丢弃之。基础篇基础篇- -抗生素抗生素 1.细胞库之细胞培养基不加抗生素细胞库之细胞培养基不加抗生素1.1.培养自培养自ATCC引进之细胞株，培养基中不加抗生素。引进之细胞株，培养基中不加抗生素。1.2.培养自其它实验室引进之细胞株，制作培养自其它实验室引进之细胞株，制作tokenfreeze前培养基须添加抗生素，待前培养基须添加抗生素，待token
16、freeze通过通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。污染测试后，大量培养时则不加抗生素。2.寄送活细胞时，须将培养液充满整个寄送活细胞时，须将培养液充满整个flask时，则须时，则须添加抗生素添加抗生素(penicillin100units/ml+streptomycin100ug/ml)。3.若要检测若要检测mycoplasma，则培养基内不可添加，则培养基内不可添加gentamicin，因，因gentamicin会抑制会抑制mycoplasma生长。生长。4.去除细菌污染之抗生素混合配方去除细菌污染之抗生素混合配方:penicillin250units/ml,streptomycin2
17、50ug/ml,neomycin250ug/ml,bacitracin2.5units/ml，注意混合使用后药物毒性会增强。，注意混合使用后药物毒性会增强。5.抗生素使用种类与浓度：抗生素使用种类与浓度：工作浓度工作浓度.储存温度储存温度.杀灭细菌杀灭细菌penicillin100units/ml-20G(+)bacteriastreptomycin100ug/ml-20G(+)andG(-)bacteriachlotetracycline50ug/ml-20G(+)andG(-)bacteriagentamicin50ug/ml-20G(+)andG(-)bacteria,mycoplasm
18、aamphotericinB2.5ug/ml-20yeastandmoldsnystatin50ug/ml-20yeastandmoldsfungizone2.5ug/ml-20yeastandmolds基础篇基础篇- -血清血清 1.血清必须贮存于血清必须贮存于20-70，若存放于，若存放于4，请勿，请勿超过一个月。如果一次无法用完一超过一个月。如果一次无法用完一瓶，可将瓶，可将4045ml分装于无菌分装于无菌50ml离心管中，由于血清结冻时体积会增离心管中，由于血清结冻时体积会增加约加约10%，必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。污
19、染或容器冻裂之情形。2.一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起过现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。滤，勿直接过滤血清。3.瓶装瓶装(500ml)血清解冻步骤血清解冻步骤(逐步解冻法逐步解冻法):-20或或70至至4冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以般以50ml无菌离心管可分装无菌离心管可分装4045ml。在溶解过程。在溶解过程中须规则摇晃均匀中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡小心勿造成气泡)，使温度与成分均，使温度与成
20、分均一，减少沈淀的发生。勿直接由一，减少沈淀的发生。勿直接由20直接至直接至37解冻，解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沈淀。4.heat-inactivation是指是指56,30分钟加热已完全解分钟加热已完全解冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处理之目冻之血清。加热过程中须规则摇晃均匀。此热处理之目的是使血清中之补体成份的是使血清中之补体成份(complement)去活化。除非去活化。除非必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沈淀物之显必须，一般不建议作此热处理，因为会造成沈淀物之显著增多，且会影响血清之品质。补体参与之反应有
21、：著增多，且会影响血清之品质。补体参与之反应有：cytolyticactivities,contractionofsmoothmuscle,releaseofhistaminefrommastcellsandplatelets,enhancedphagocytosis,chemotaxisandactivationoflymphocyticandmacrophagecelltype。5.勿将血清置于勿将血清置于37太久，若在太久，若在37放置太久，血清会放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受变得混浊，同时血清中许多较不稳定之成份亦会因此受到破坏，而影响血清之品质。到破
22、坏，而影响血清之品质。6.血清之沈淀物血清之沈淀物6.1.凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是凝絮物：发生之原因有许多种，但普遍之原因是血清中之脂蛋白血清中之脂蛋白(lipoprotein)变性及解冻后血清中存变性及解冻后血清中存在之血纤维蛋白在之血纤维蛋白(fibrin)造成，这些凝絮沈淀物不会造成，这些凝絮沈淀物不会影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沈淀物，可影响血清本身之品质。若欲减少这些凝絮沈淀物，可用离心用离心3000rpm,5min去除，或离心后上清液可以去除，或离心后上清液可以加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些加入培养基中一起过滤。不建议用过滤步骤去除这些凝絮
23、沈淀物，因为会阻塞过滤膜。凝絮沈淀物，因为会阻塞过滤膜。6.2.显微镜下观察之显微镜下观察之“小黑点小黑点”：通常经过热处理之：通常经过热处理之血清，沈淀物的形成会显著的增多。有些沈淀物在显血清，沈淀物的形成会显著的增多。有些沈淀物在显微镜下观察像是微镜下观察像是“小黑点小黑点”，常会误认为血清遭受污，常会误认为血清遭受污染，而将血清放在染，而将血清放在37中欲培养此中欲培养此“微生物微生物“，但在，但在37环境下，又会使此沈淀物增多，更会误认为微生环境下，又会使此沈淀物增多，更会误认为微生物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。物之增殖，但以培养细菌之培养基检测，又没有污染。一般而言
24、，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀一般而言，此小黑点应不会影响细胞之生长，但若怀疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。疑此血清之品质，应立即停用，更换另一批号的血清。附附- -血清之生长测试血清之生长测试 材料：材料：MDCKcell(ATCCCCL-34或或CCRC60004)a-MEM(alphamodifiedminimalessentialmedium,GibcoBRL12000-022)6-wellTCplate(or35mmTCdish)methanolglacialaceticacid10%Giemsasolution(GibcoBRL10092-013)步骤：步骤
25、：1.以以a-MEMwith10%FBS(已测试过已测试过)培养培养MDCK细胞于细胞于T75flask至至80%confluency。2.以以trypsin-EDTA处理细胞，离心后，加入适量不加血清之处理细胞，离心后，加入适量不加血清之a-MEM制成细胞悬浮液，并测细胞浓度。以不加血清之制成细胞悬浮液，并测细胞浓度。以不加血清之a-MEM稀稀释细胞浓度为释细胞浓度为1102活细胞数活细胞数/ml。3.将将1ml细胞悬浮液接种入细胞悬浮液接种入6-wellplate中，并另加入中，并另加入1ml含含不同浓度的血清不同浓度的血清(20%,10%,4%,2%,1%,0.4%)之之a-MEM，使血
26、清最终浓度为，使血清最终浓度为10%,5%,2%,1%,0.5%,0.2%。用已测试过之血清同时进行对照组试验。用已测试过之血清同时进行对照组试验。4.37oC，5%CO2培养箱培养培养箱培养5-7天，期间不需更换培养基，天，期间不需更换培养基，待细胞群落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触即可。待细胞群落大到可以肉眼观察，而群落间不互相接触即可。5.去除培养基，加入去除培养基，加入1mlCarnoys固定液固定液(甲醇甲醇:冰醋酸冰醋酸3:1)，室温下静置，室温下静置10min。6.去除固定液，水洗二次。去除固定液，水洗二次。7.加入加入1ml10%Giemsasolution，室温下静置染
27、色，室温下静置染色2-3min。8.去除染液，水洗二次。去除染液，水洗二次。9.以肉眼计数群落数以肉眼计数群落数10.计算计算SPE(SerumPlatingEfficiency)：SPE=(no.ofcolonies/well)/100x100%11.计算计算RPE(RelativePlatingEfficiency)：SPE=totalcoloniesofsixwell(test)/Totalcoloniesofsixwell(control)x100%比较各浓度血清培养基之比较各浓度血清培养基之RPE，即可得知待测血清对细胞生长，即可得知待测血清对细胞生长的影响。订购多量同一批号的优良血
28、清，置于的影响。订购多量同一批号的优良血清，置于70保存之保存之基础篇基础篇- -细胞传代培养细胞传代培养 1.细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一般稀释比例为细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一般稀释比例为1:3至至1:6，依细胞种类而异。，依细胞种类而异。2.材料：材料：2.1.无菌磷酸生理缓冲液无菌磷酸生理缓冲液(Dulbeccosphosphate-bufferedsaline,Ca+/Mg+free,D-PBS,GibcoBRL21600-010)2.2.trypsin-EDTAsolution(0.05%trypsin-0.53mMEDTA-4Na,GibcoB
29、RL25300-062)：以以10ml分装于分装于15ml无菌离心管中，保存于无菌离心管中，保存于20，使用前放在，使用前放在37水槽水槽回温。回温。2.3.新鲜培养基新鲜培养基2.4.无菌吸管无菌吸管/离心管离心管/培养瓶培养瓶3.步骤：步骤：3.1.附着型胞附着型胞(adherentcell)3.1.1.吸掉旧培养液。吸掉旧培养液。3.1.2.用用D-PBS洗涤细胞一至二次。洗涤细胞一至二次。3.1.3.加入加入trypsin-EDTA溶液溶液(1ml/25cm2,2ml/75cm2)，37作用数分钟，于倒立显微作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，镜下观察，当细胞
30、将要分离而呈现圆粒状时，吸掉吸掉trypsin-EDTA溶液。溶液。(若不移去若不移去trypsin-EDTA，则在，则在trypsin-EDTA作用后，加入适量作用后，加入适量含血清之新鲜培养基终止含血清之新鲜培养基终止trypsin作用，离心作用，离心后再吸掉上清液。后再吸掉上清液。)3.1.4.轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量之新鲜培养基，以吸管上下吸放数次以打散量之新鲜培养基，以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。的培养瓶中，以正常培养条件培养。3.2
31、.悬浮型细胞悬浮型细胞(suspensioncell)3.2.1.吸出细胞培养液，放入离心管中，离吸出细胞培养液，放入离心管中，离心心1000rpm5分钟。分钟。3.2.2.吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。中，以正常培养条件培养。3.3.融合瘤融合瘤(hybridoma)3.3.1.有些有些hybridomacell需培养三天以上需培养三天以上才会产生抗体，若是更换培养基，则可能会才会产生抗体，若是更换培养基，则可能会失去抗体。因此继代培养不需离心后更换培失去
32、抗体。因此继代培养不需离心后更换培养基，直接添加新鲜培养基稀释细胞浓度即养基，直接添加新鲜培养基稀释细胞浓度即可。若体积太大，可倾斜放置，或分殖至新可。若体积太大，可倾斜放置，或分殖至新培养瓶中。培养瓶中。基础篇基础篇- -细胞冷冻保存细胞冷冻保存 （一）（一）1.注意事项：注意事项：1.1.欲冷冻保存之细胞应在生长良好欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之且存活率高之状态，约为状态，约为8090致密度。致密度。1.2.冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。应在冷冻保存
33、前一至二日测试是否有抗体之产生。1.3.注意冷冻保护剂之品质。注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无应为试剂级等级，无菌且无色色(以以0.22micronFGLPTelflon过滤或是直接购买无菌产品，过滤或是直接购买无菌产品，如如SigmaD-2650)，以，以510ml小体积分装，小体积分装，4避光保存，勿避光保存，勿作多次解冻。作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。1.4.冷冻保存之细胞浓度：冷冻保存
34、之细胞浓度：1.4.1.normalhumanfibroblast:13x106cells/ml1.4.2.hybridoma:13x106cells/ml，细胞浓度不要太高，细胞浓度不要太高，某些某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。小时后死去。1.4.3.adherenttumorlines:57x106，依细胞种类而异。，依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而解冻后须较高之浓度，而HeLa只需只需1-3x106cells/ml。1.4.4.othersuspensions:510x106cells/ml,huma
35、nlymphocyte须至少须至少5x106cells/ml。1.5.冷冻保护剂浓度为冷冻保护剂浓度为5或或10DMSO，若是不确定细胞，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backupculture，以防止冷冻失败。，以防止冷冻失败。1.6.冷冻方法：冷冻方法：1.6.1.传统方法传统方法:410分钟分钟-2030分钟分钟-8016-18小时小时(或隔夜或隔夜)-液氮槽液氮槽vaporphase长期储存。长期储存。1.6.2.程序降温：利用等速降温机以程序降温：利用等速降温机以1-3/分钟之速分钟之速度由室温降至度由室温降至120
36、，放在液氮槽，放在液氮槽vaporphase长期储存。长期储存。适用于悬浮型细胞与适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。之保存。基础篇基础篇- -细胞冷冻保存细胞冷冻保存 （二）（二）2.材料：材料：2.1.生长良好之培养细胞生长良好之培养细胞2.2.新鲜培养基新鲜培养基2.3.DMSO(SigmaD-2650)2.4.无菌塑料冷冻保存管无菌塑料冷冻保存管(Nalgene5000-0020)2.5.0.4w/vtrypanblue(GibcoBRL15250-061)2.6.血球计数盘与盖玻片血球计数盘与盖玻片2.7.等速降温机等速降温机(KRYO10SeriesII)3.步骤：步骤：3
37、.1.冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。形。3.2.配制冷冻保存溶液配制冷冻保存溶液(使用前配制使用前配制)：将：将DMSO加入新鲜加入新鲜培养基中，最后浓度为培养基中，最后浓度为5-10，混合均匀，置于室温下待用。，混合均匀，置于室温下待用。3.3.依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液悬浮液(约约0.1ml)计数细胞浓度及冻前存活率。计数细胞浓度及冻前存活率。3.4.离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度
38、为浓度为1-5x106cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，之冷冻保存管中，1ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检，并取少量细胞悬浮液作污染检测。测。3.5.冷冻保存方法冷冻保存方法1:冷冻管置于冷冻管置于410分钟分钟-2030分分钟钟-801618小时小时(或隔夜或隔夜)液氮槽液氮槽vaporphase长长期储存。期储存。3.6.冷冻保存方法冷冻保存方法2:冷冻管置于已设定程序之等速降温机中，冷冻管置于已设定程序之等速降温机中，再放入液氮槽中。程序为再放入液氮槽中。程序为:program7:HBCELL基础篇基础篇- -冷冻细胞活化冷
39、冻细胞活化 1.冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。重新结晶而对细胞造成伤害，导致细胞之死亡。2.细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞活化后，约需数日，或继代一至二代，其细胞生长或特性表现才会恢复正常细胞生长或特性表现才会恢复正常(例如产生单例如产生单株抗体或是其它蛋白质株抗体或是其它蛋白质)。3.材料材料37恒温水，新鲜培养基，无菌吸管恒温水，新鲜培养基，无菌吸管/离心管离心管/培养瓶，液氮或干冰容器培养瓶，液氮或干冰容器4.步骤：步骤：4.1操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之操作人员
40、应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。伤害。4.2自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。4.3将新鲜培养基置于将新鲜培养基置于37C水槽中回温，回温后喷以水槽中回温，回温后喷以70%酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。4.4取出冷冻管，立即放入取出冷冻管，立即放入37C水槽中快速解冻，轻摇冷水槽中快速解冻，轻摇冷冻管使其在冻管使其在1分钟内全部融化，以分钟内全部融化，以70%ethanol擦拭保存擦拭保存管外部，移入无菌操作台内。管外
41、部，移入无菌操作台内。4.5取出取出0.9ml解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培解冻之细胞悬浮液，缓缓加入有培养基之培养容器内养容器内(稀释比例稀释比例1:101:15)，混合均匀，放入，混合均匀，放入CO2培培养箱培养。另取养箱培养。另取0.1ml解冻细胞悬浮液作存活测试。解冻细胞悬浮液作存活测试。4.6解冻后是否立即去除冷冻保护剂解冻后是否立即去除冷冻保护剂(例如例如DMSO或或glycerol)，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即，依细胞种类而异，一般而言，大都不需要立即去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液去除冷冻保护剂。惟若要立即去除，则将解冻之细胞悬浮液加入
42、含有加入含有5-10ml培养基之离心管内，离心培养基之离心管内，离心1,000rpm,5分分钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入钟，移去上清液，加入新鲜培养基，混合均匀，放入CO2培养箱培养。培养箱培养。4.7若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换若不需立即去除冷冻保存剂，则在解冻培养后隔日更换培养基。培养基。基础篇基础篇- -收到细胞的处理方式收到细胞的处理方式 ( (一一) )1.收到细胞株包裹时，收到细胞株包裹时，请检查细胞株冷冻管是否有解请检查细胞株冷冻管是否有解冻情形，冻情形，若有请立即通知。细胞株请尽速开始培养，若有请立即通知。细胞株请尽速开始培养，或立即冷冻保
43、存或立即冷冻保存(置于置于70C，隔夜后，隔夜后，移到液氮移到液氮)。2.冷冻细胞解冻程序冷冻细胞解冻程序:2.1.依据细胞株数据单指定之基础培养基种类、血清种依据细胞株数据单指定之基础培养基种类、血清种类和其它指定之成份和比例，制备培养基。绝大多数之类和其它指定之成份和比例，制备培养基。绝大多数之细胞均无法立即适应不同之基础培养基或不同之血清种细胞均无法立即适应不同之基础培养基或不同之血清种类，类，若因实验需要，若因实验需要，必须有所不同时，必须有所不同时，务必以缓慢比务必以缓慢比例渐次改变培养基组成，例渐次改变培养基组成，确定细胞适应后，确定细胞适应后，方进行所方进行所需之实验。需之实验。
44、2.2.FBS(fetalbovineserum,胚牛血清胚牛血清),CS(calfserum,小牛血清小牛血清)和和HS(horseserum,马血清马血清)，对细，对细胞而言差异极大，请务必依据细胞株资料单指定之血清胞而言差异极大，请务必依据细胞株资料单指定之血清种类培养之。种类培养之。2.3.将培养基置于将培养基置于37C水槽中回温，水槽中回温，回温后喷以回温后喷以70%酒酒精并擦拭之，精并擦拭之，移入无菌操作台内。取出冷冻管，移入无菌操作台内。取出冷冻管，立即放入立即放入37C水槽中快速解冻，水槽中快速解冻，水面高度不可接近或高过冷冻管水面高度不可接近或高过冷冻管之盖沿，之盖沿，否则易
45、发生污染。轻摇冷冻管使其在否则易发生污染。轻摇冷冻管使其在1分钟内全分钟内全部融化后，部融化后，以以70%ethanol擦拭冷冻管外部，擦拭冷冻管外部，移入无菌移入无菌操作台内。操作台内。2.4.依据细胞种类和浓度，于无菌操作台内取依据细胞种类和浓度，于无菌操作台内取10ml培养培养基加至基加至T25或或T75flask中。取出已解冻之细胞悬浮液，缓中。取出已解冻之细胞悬浮液，缓缓加入缓加入T25或或T75flask内之培养基，内之培养基，混合均匀，放入混合均匀，放入37C，5%CO2培养箱培养。培养箱培养。2.5.对绝大多数细胞而言，对绝大多数细胞而言，1%以下之冷冻保护剂以下之冷冻保护剂D
46、MSO，不会对细胞之贴附或活化有不良影响，不需立刻由解冻，不会对细胞之贴附或活化有不良影响，不需立刻由解冻细胞中去除，细胞中去除，待第二天确定细胞生长或贴附良好后再去除待第二天确定细胞生长或贴附良好后再去除即可。惟对极少数因对即可。惟对极少数因对DMSO敏感或会造成细胞分化之细敏感或会造成细胞分化之细胞，需立即去除胞，需立即去除DMSO者，者，则可将解冻后之细胞悬浮液放则可将解冻后之细胞悬浮液放入入5-10ml培养基中，离心培养基中，离心300xg(约约1000rpm)，5分钟，分钟，小心移去上清液，加入适量新鲜培养基，将细胞均匀混合小心移去上清液，加入适量新鲜培养基，将细胞均匀混合后，后，转
47、移至培养瓶中，转移至培养瓶中，再放入再放入37C，5%CO2培养箱培培养箱培养。养。基础篇基础篇- -收到细胞的处理方式收到细胞的处理方式 ( (二二) )收到收到T25 flask T25 flask 细胞时，细胞时， 处理方式为处理方式为 1. 1. 于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，于寄送过程中，为避免起泡造成细胞脱落死亡，T25 flask T25 flask 均加满培养基。请检查均加满培养基。请检查flask flask 外观，并于外观，并于显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象，若有任显微镜下观察细胞生长状况和有无污染现象，若有任何问题，何问题， 不要打开盖子，请立即通知细
48、胞实验室。不要打开盖子，请立即通知细胞实验室。 2. 2. 将原封之将原封之T25 flask T25 flask 静置于静置于37 C37 C， 5 % CO2 5 % CO2 培培养箱中，使细胞回温至养箱中，使细胞回温至37 C37 C， 并让运送过程中少数并让运送过程中少数脱落的细胞可再附着生长。隔天后，于无菌操作箱内脱落的细胞可再附着生长。隔天后，于无菌操作箱内取出取出flaskflask内之培养基，内之培养基，( (取出之培养基可以再使用取出之培养基可以再使用) )，仅留约仅留约5-10ml 5-10ml 培养基于培养基于flask flask 内，依一般培养方式再内，依一般培养方式
49、再将细胞置入培养箱中，或细胞已长满盘，将细胞置入培养箱中，或细胞已长满盘， 则将细胞做则将细胞做传代培养。传代培养。 附附- -细胞计数与存活测试（一）细胞计数与存活测试（一） 1. 1. 原理：原理： 1.1. 1.1. 计算细胞数目可用血球计数盘或是计算细胞数目可用血球计数盘或是Coulter counter Coulter counter 粒子计数粒子计数器自动计数。器自动计数。 1.2. 1.2. 血球计数盘一般有二个血球计数盘一般有二个chamberschambers，每个，每个chamber chamber 中细刻中细刻9 9 个个1 1 mm2 mm2 大正方形，其中大正方形，其
50、中4 4 个角落之正方形再细刻个角落之正方形再细刻16 16 个小格，深度均为个小格，深度均为0.1 mm0.1 mm。当。当chamber chamber 上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为上方盖上盖玻片后，每个大正方形之体积为1 1 mm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 mlmm2 x 0.1 mm=1.0 x 10-4 ml。使用时，计数每个大正方形内之细胞。使用时，计数每个大正方形内之细胞数目，乘以稀释倍数，再乘以数目，乘以稀释倍数，再乘以104104，即为每，即为每ml ml 中之细胞数目。中之细胞数目。 1.3. 1.3. 存活测试之步骤为存活测试之步骤为dye ex
51、clusiondye exclusion，利用染料会渗入死细胞中而，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之蓝色之trypan blue trypan blue 染料，如果细胞不易吸收染料，如果细胞不易吸收trypan bluetrypan blue，则用红，则用红色之色之Erythrosin bluishErythrosin bluish。 附附- -细胞计数与存活测试（二）细胞计数与存活测试（二）2. 2. 材料：材料： 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBR
52、L 15250-061) 0.4 % w/v trypan blue (GibcoBRL 15250-061) Erythosin bluish stain Erythosin bluish stain 取取0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 0.1 gram Erythrosin bluish (Sigma E-9259) 及及0.05 gram 0.05 gram preservative methyl preservative methyl paraben (Sigma H-3647) paraben (Sigma H-3647) 溶于溶于
53、100 ml Ca+/Mg+ free saline 100 ml Ca+/Mg+ free saline 血球计数盘及盖玻片血球计数盘及盖玻片(Hemocytometer and coverslip) (Hemocytometer and coverslip) ，计数器，计数器(counter) (counter) ，低倍倒立显微镜，低倍倒立显微镜 粒子计数器粒子计数器(Coulter counter, Coulter Electronics) (Coulter counter, Coulter Electronics) 3. 3. 步骤：步骤： 3.1. 3.1. 取取50ml 50ml
54、细胞悬浮液与细胞悬浮液与50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 50ml trypan blue (or Erythrosin bluish) 等等体积混合均匀于体积混合均匀于1.5ml 1.5ml 小离心管中。小离心管中。3.2. 3.2. 取少许混合液取少许混合液( (约约15ml) 15ml) 自血球计数盘自血球计数盘chamber chamber 上方凹槽加入，盖上盖上方凹槽加入，盖上盖玻片，于玻片，于100 100 倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色倍倒立显微镜下观察，活细胞不染色，死细胞则为蓝色( (或红色或红色- Erythr
55、osinbluish)- Erythrosinbluish)。 3.3. 3.3. 计数四个大方格之细胞总数，再除计数四个大方格之细胞总数，再除4 4，乘以稀释倍数，乘以稀释倍数( (至少乘以至少乘以2 2，因与，因与trypan bluetrypan blue等体积混合等体积混合) )，最后乘以，最后乘以104104，即为每，即为每ml ml 中细胞悬浮液之细胞数。中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞( (或计下线与左线之细胞或计下线与左线之细胞) )。 4 4 大格大格* *细胞总数细胞总数x 2 x 104 / 4= x 2 x
56、104 / 4= 细胞数细胞数/ml /ml * *每一大格的体积每一大格的体积= 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10-4 ml = 0.1cm x 0.1cm x 0.01cm = 10-4 ml 3.4. 3.4. 若不用血球计数盘，可用若不用血球计数盘，可用Coulter counter Coulter counter 作自作自动计数，惟无法辨别死细胞或活细胞。动计数，惟无法辨别死细胞或活细胞。 3.5. 3.5. 范例：范例： T75 monolayer culture T75 monolayer culture 制成制成10ml 10ml 细胞悬浮液，取细胞悬浮液
57、，取0.1 ml 0.1 ml 溶液与溶液与0.1ml trypan blue 0.1ml trypan blue 混合均匀于试管混合均匀于试管中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内中，取少许混合液加入血球计数盘，计数四大方格内之细胞数目。之细胞数目。 活细胞数活细胞数/ /方格：方格：55 ,62, 49, 59 55 ,62, 49, 59 死细胞数死细胞数/ /方格：方格：5, 3, 4, 6 5, 3, 4, 6 细胞总数细胞总数= 243 = 243 平均细胞数平均细胞数/ /方格方格= 60.75 = 60.75 稀释倍数稀释倍数= 2 = 2 细胞数细胞数/ml/ml：6
58、0.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106 60.75 x 104 x 2 = 1.22 x 106 细胞数细胞数/flask/flask： 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106 1.22 x 106 x 10ml = 12.2 x 106 存活率：存活率：225/24392.6 %225/24392.6 %升级篇升级篇- -细胞培养细胞培养1 11冷冻管应如何解冻？冷冻管应如何解冻？取出冷冻管后，取出冷冻管后，须立即放入须立即放入37C水槽中快速解水槽中快速解冻，冻，轻摇冷冻管使其在轻摇冷冻管使其在1分钟内全部融化，分钟内全部融化，并注并注意水面不可超过冷
59、冻管盖沿，意水面不可超过冷冻管盖沿，否则易发生污染情否则易发生污染情形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，形。另冷冻管由液氮桶中取出解冻时，必须注意必须注意安全，安全，预防冷冻管之爆裂。预防冷冻管之爆裂。2细胞冷冻管解冻培养时，细胞冷冻管解冻培养时，是否应马上去除是否应马上去除DMSO？除少数特别注明对除少数特别注明对DMSO敏感之细胞外，敏感之细胞外，绝大部绝大部分细胞株（包括悬浮性细胞），分细胞株（包括悬浮性细胞），在解冻之后，在解冻之后，应应直接放入含有直接放入含有10-15ml新鲜培养基之培养角瓶中，新鲜培养基之培养角瓶中，待隔天再置换新鲜培养基以去除待隔天再置换新鲜培养基以去除DMSO即
60、可，即可，如如此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问此可避免大部分解冻后细胞无法生长或贴附之问题。题。3可否使用与原先培养条件不同之培养基？可否使用与原先培养条件不同之培养基？不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之不能。每一细胞株均有其特定使用且已适应之细胞培养基，细胞培养基，若骤然使用和原先提供之培养条若骤然使用和原先提供之培养条件不同之培养基，件不同之培养基，细胞大都无法立即适应，细胞大都无法立即适应，造成细胞无法存活。造成细胞无法存活。4可否使用与原先培养条件不同之血清种类？可否使用与原先培养条件不同之血清种类？不能。血清是细胞培养上一个极为重要的营养不能。血清是细胞培养上一个极为
61、重要的营养来源，来源，所以血清的种类和品质对于细胞的生长所以血清的种类和品质对于细胞的生长会产生极大的影响。来自不同物种的血清，会产生极大的影响。来自不同物种的血清，在在一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，一些物质或分子的量或内容物上都有所不同，血清使用错误常会造成细胞无法存活。血清使用错误常会造成细胞无法存活。升级篇升级篇- -细胞培养细胞培养2 25何谓何谓FBS,FCS,CS,HS?FBS(fetalbovineserum)和和FCS(fetalcalfserum)是相同的意思，是相同的意思，两者都是指胎牛血清，两者都是指胎牛血清，FCS乃错误的使用字眼，乃错误的使用字眼，请不要再使
62、用。请不要再使用。CS(calfserum)则是指小牛血清。则是指小牛血清。HS(horseserum)则是指马血清。则是指马血清。6培养细胞时应使用培养细胞时应使用5%或或10%CO2？或根本没？或根本没有影响？有影响？一般培养基中大都使用一般培养基中大都使用HCO3-/CO32-/H+作为作为pH的缓冲系统，的缓冲系统，而培养基中而培养基中NaHCO3的含量将决定的含量将决定细胞培养时应使用的细胞培养时应使用的CO2浓度。当培养基中浓度。当培养基中NaHCO3含量为每公升含量为每公升3.7g时，细胞培养时应时，细胞培养时应使用使用10%CO2；当培养基中；当培养基中NaHCO3为每公升为每
63、公升1.5g时，时，则应使用则应使用5%CO2培养细胞。培养细胞。7何时须更换培养基？何时须更换培养基？视细胞生长密度而定，视细胞生长密度而定，或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按或遵照细胞株基本数据上之更换时间，按时更换培养基即可。时更换培养基即可。8培养基中是否须添加抗生素？培养基中是否须添加抗生素？除于特殊筛选系统中外，除于特殊筛选系统中外，一般正常培养状态下，一般正常培养状态下，培养基中不应培养基中不应添加任何抗生素。添加任何抗生素。9附着性细胞继代时所使用之附着性细胞继代时所使用之trypsin-EDTA浓度？应如何处理？浓度？应如何处理？一般使用之一般使用之trypsin-EDTA
64、浓度为浓度为0.05%trypsin-0.53mMEDTA.4Na。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，。第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，保存于保存于20C，避免反复冷冻解冻造成，避免反复冷冻解冻造成trypsin之活性降低，之活性降低，并可减少污染并可减少污染之机会。之机会。10悬浮性细胞应如何继代处理？悬浮性细胞应如何继代处理？一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，一般仅需持续加入新鲜培养基于原培养角瓶中，稀释细胞浓度即稀释细胞浓度即可，可，若培养液太多时，若培养液太多时，可将培养角瓶口端稍微抬高，可将培养角瓶口端稍微抬高，直到无法直到无法容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之
65、培养液至另一新的培养角容纳为止。分瓶时取出一部份含细胞之培养液至另一新的培养角瓶，瓶，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，加入新鲜培养基稀释至适当浓度，重复前述步骤即可。重复前述步骤即可。升级篇升级篇- -细胞培养细胞培养3 311欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转欲将一般动物细胞离心下来，其离心速率应为多少转速？速？欲回收动物细胞，欲回收动物细胞，其离心速率一般为其离心速率一般为300xg(约约1,000rpm)，5-10分钟，分钟，过高之转速，过高之转速，将造成细胞死亡。将造成细胞死亡。12细胞之接种密度为何？细胞之接种密度为何？依照细胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接依照细
66、胞株基本数据上之接种密度或稀释分盘之比例接种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长种即可。细胞数太少或稀释的太多亦是造成细胞无法生长之一重要原因。之一重要原因。13细胞冷冻培养基之成份为何？细胞冷冻培养基之成份为何？动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含动物细胞冷冻保存时最常使用的冷冻培养基是含5-10%DMSO(dimethylsulfoxide)和和90-95%原来细胞生原来细胞生长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于长用之新鲜培养基均匀混合之。注意：由于DMSO稀释时稀释时会放出大量热能，会放出大量热能，故不可将故不可将DMSO直接加入细胞液中，直接加入细胞液中，必须使用前
67、先行配制完成。必须使用前先行配制完成。14DMSO之等级和无菌过滤之方式为何？之等级和无菌过滤之方式为何？冷冻保存使用之冷冻保存使用之DMSO等级，等级，必须为必须为Tissueculturegrade之之DMSO(如如SigmaD2650)，其本身即为无菌状况，其本身即为无菌状况，第一次开瓶第一次开瓶后应立即少量分装于无菌试管中，后应立即少量分装于无菌试管中，保存于保存于4C，避免反复冷冻解避免反复冷冻解冻造成冻造成DMSO之裂解而释出有害物质，之裂解而释出有害物质，并可减少污染之机会。若并可减少污染之机会。若要过滤要过滤DMSO，则须使用耐则须使用耐DMSO之之Nylon材质滤膜。材质滤膜
68、。15冷冻保存细胞之方法？冷冻保存细胞之方法？冷冻保存方法一冷冻保存方法一:冷冻管置于冷冻管置于4C3060分钟分钟(-20C30分钟分钟*)-80C1618小时小时(或隔夜或隔夜)液氮槽液氮槽vaporphase长期储长期储存。存。冷冻保存方法二冷冻保存方法二:冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分冷冻管置于已设定程序之可程序降温机中每分钟降钟降1-3C至至80C以下，以下，再放入液氮槽再放入液氮槽vaporphase长期储长期储存。存。*-20C不可超过不可超过1小时，小时，以防止冰晶过大，造成细胞大量以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入死亡，亦可跳过此步骤直接放入-
69、80C冰箱中，惟存活率稍微降冰箱中，惟存活率稍微降低一些。低一些。升级篇升级篇- -细胞培养细胞培养4 416细胞欲冷冻保存时，细胞欲冷冻保存时，细胞冷冻管内应有多少细胞浓度细胞冷冻管内应有多少细胞浓度？冷冻管内细胞数目一般为冷冻管内细胞数目一般为1x106cells/mlvial，融合瘤细融合瘤细胞则以胞则以5x106cells/mlvial为宜。为宜。17应如何避免细胞污染？应如何避免细胞污染？细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉细胞污染的种类可分成细菌、酵母菌、霉菌、病毒和霉浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境浆菌。主要的污染原因为无菌操作技术不当、操作室环境不
70、佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、不佳、污染之血清和污染之细胞等。严格之无菌操作技术、清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低清洁的环境、与品质良好之细胞来源和培养基配制是减低污染之最好方法。污染之最好方法。18如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？如果细胞发生微生物污染时，应如何处理？加入相应抗生素。直接灭菌后丢弃之。加入相应抗生素。直接灭菌后丢弃之。19支原体支原体(mycoplasma)污染的细胞，污染的细胞，是否能以肉眼观察是否能以肉眼观察出异状？出异状？不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染不能。除极有经验之专家外，大多数遭受支原体污染的细胞株，无法
71、以其外观分辨之。的细胞株，无法以其外观分辨之。20支原体污染会对细胞培养有何影响？支原体污染会对细胞培养有何影响？支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，支原体污染几乎可影响所有细胞之生长参数，代谢及代谢及研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为研究之任一数据。故进行实验前，必须确认细胞为mycoplasma-free，实验结果之数据方有意义。，实验结果之数据方有意义。21侦测出细胞株有支原体污染时，侦测出细胞株有支原体污染时，该如何处理？该如何处理？直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。直接灭菌后丢弃，以避免污染其它细胞株。22CO2培养箱之水盘如何保持清洁？培养箱之水盘如何保持清洁？定
72、期定期(至少每两周一次至少每两周一次)以无菌蒸馏水或无菌去离子水以无菌蒸馏水或无菌去离子水更换之。更换之。升级篇升级篇- -细胞培养细胞培养5 523为何培养基保存于为何培养基保存于4C冰箱中，冰箱中，颜色会偏暗颜色会偏暗红色，红色，且且pH值会越来越偏碱性？值会越来越偏碱性？培养基保存于培养基保存于4C冰箱中，冰箱中，培养基内之培养基内之CO2会会逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基逐渐溢出，造成培养基越来越偏碱性。而培养基中之酸碱指示剂中之酸碱指示剂(通常为通常为phenolred)的颜色也会的颜色也会随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果，随碱性增加而更偏暗红。培养基偏碱之结果，将
73、将造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，造成细胞生长停滞或死亡。若培养基偏碱时，可可以通入无菌过滤之以通入无菌过滤之CO2，以调整以调整pH值。值。24各种细胞培养用的各种细胞培养用的dish，flask是否均相同？是否均相同？不同厂牌的不同厂牌的dish或或flask，其所其所coating的的polymer不同，不同，制造程序亦不同，制造程序亦不同，虽对大部分细虽对大部分细胞没有太大之影响，胞没有太大之影响，惟少数细胞则可能因使用厂惟少数细胞则可能因使用厂牌不同之牌不同之dish或或flask而有显著之生长差异。而有显著之生长差异。25购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情
74、形购买之细胞冷冻管经解冻后，为何会发生细胞数目太少之情形？研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少，研究人员在冷冻细胞之培养时出现细胞数目太少，大都是因为离大都是因为离心过程操作上的失误，心过程操作上的失误，造成细胞的物理性损伤，造成细胞的物理性损伤，以及细胞流失。以及细胞流失。建议细胞解冻后不要立刻离心，建议细胞解冻后不要立刻离心，应待细胞生长隔夜后再更换培养应待细胞生长隔夜后再更换培养基即可。基即可。26购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？购买之细胞死亡或细胞存活率不佳可能原因？研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，研究人员在细胞培养时出现存活率不佳，常见原因可归纳为：培常见原因可归纳
75、为：培养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不养基使用错误或培养基品质不佳。血清使用错误或血清的品质不佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后，佳。解冻过程错误。冷冻细胞解冻后，加以洗涤细胞和离心。悬加以洗涤细胞和离心。悬浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于浮细胞误认为死细胞。培养温度使用错误。细胞置于80C太太久。久。27收到之冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落之原因？收到之冷冻管瓶身破裂，瓶盖有裂纹，或瓶盖脱落之原因？冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时冷冻管瓶盖裂纹，或瓶身破裂，可能是因为操作者夹取冷冻管时用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳
76、小心夹取。另冷冻用力不当，造成冷冻管裂损，建议使用止血钳小心夹取。另冷冻管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象，冷冻管有可能因管瓶盖松动或松脱，乃因热胀冷缩之物理现象，冷冻管有可能因此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻此而造成细胞污染，故冷冻管于放入和取出液氮桶时，均应立刻将冷冻管再一次扭紧将冷冻管再一次扭紧升级篇升级篇- -细胞培养细胞培养6 628如何选用特殊细胞系培养基？如何选用特殊细胞系培养基？培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在培养某一类型细胞没有固定的培养条件。在MEM中培养的细胞，很可能在中培养的细胞，很可能在DMEM或或M199中同样很中同样很容易生长。
77、总之，首选容易生长。总之，首选MEM做粘附细胞培养、做粘附细胞培养、RPMI-1640做悬浮细胞培养是一个好的开始，各做悬浮细胞培养是一个好的开始，各种目的无血清培养最好首选种目的无血清培养最好首选AIMV（12005）培养）培养基（基（SFM）。）。29L-谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中谷氨酰胺在细胞培养中重要吗？它在溶液中不稳定吗？不稳定吗？L-谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，谷氨酰胺在细胞培养时是重要的。脱掉氨基后，L-谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋谷氨酰胺可作为培养细胞的能量来源、参与蛋白质的合成和核酸代谢。白质的合成和核酸代谢。L-谷氨酰胺在溶液中经谷氨酰
78、胺在溶液中经过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没过一段时间后会降解，但是确切的降解率一直没有最终定论。有最终定论。L-谷氨酰胺的降解导致氨的形成，谷氨酰胺的降解导致氨的形成，而氨对于一些细胞具有毒性。而氨对于一些细胞具有毒性。30GlutaMAX-I是什么？培养细胞如何利用是什么？培养细胞如何利用GlutaMAX-I？这个二肽有多稳定？这个二肽有多稳定？GlutaMAX-I二肽是一个二肽是一个L-谷氨酰胺的衍生物，其不稳谷氨酰胺的衍生物，其不稳定的定的alpha-氨基用氨基用L-丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂丙氨酸来保护。一种肽酶逐渐裂解二肽，释放解二肽，释放L-谷氨酰胺供利用。谷氨酰胺供
79、利用。GlutaMAX-I二肽非二肽非常稳定，即使在常稳定，即使在121磅灭菌磅灭菌20分钟，分钟，GlutaMAX-I二肽二肽溶液有最小的降解，如果在相同条件下，溶液有最小的降解，如果在相同条件下，L-谷氨酰胺谷氨酰胺几乎完全降解。几乎完全降解。31什么培养基中可以省去加酚红？什么培养基中可以省去加酚红？酚红在培养基中被用来作为酚红在培养基中被用来作为PH值的指示剂：中性时为值的指示剂：中性时为红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红色，酸性时为黄色，碱性时为紫色。研究表明，酚红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。红可以模拟固醇类激素的作用，（特别是雌激素）。为避免固醇类反应
80、，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，为避免固醇类反应，培养细胞，尤其是哺乳类细胞时，用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究用不加酚红的培养基。由于酚红干扰检测，一些研究人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。人员在做流式细胞检测时，不使用加有酚红的培养基。升级篇升级篇- -细胞培养细胞培养7 732培养基中丙酮酸钠的作用是什么？培养基中丙酮酸钠的作用是什么？丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾丙酮酸钠可以作为细胞培养中的替代碳源，尽管细胞更倾向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细向于以葡萄糖作为碳源，但是，如果没有葡萄糖的话，细胞也可以代谢丙酮酸钠。胞也可
81、以代谢丙酮酸钠。34二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入二价离子抑制胰蛋白酶活性吗？使用胰蛋白酶时加入EDTA的目的是什么？的目的是什么？二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。二价离子的确抑制胰蛋白酶活性。EDTA用来螯合游离的用来螯合游离的镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰镁离子和钙离子，以便保持抑制胰蛋白酶的活性。建议胰蛋白酶处理细胞前，用蛋白酶处理细胞前，用EDTA清洗细胞，以消除来自培养清洗细胞，以消除来自培养基中所有的二价离子。基中所有的二价离子。33 33 目录上说，目录上说，Hanks Hanks 平衡盐溶液平衡盐溶液(HBS)(HBS)要在空气中要在空气中使用
82、，不需要使用，不需要CO2CO2培养箱。原因是什么？培养箱。原因是什么？Hanks Hanks 平衡平衡盐溶液盐溶液(HBS)(HBS)和和EarlesEarles平衡盐溶液平衡盐溶液(EBS)(EBS)有什么本质有什么本质的功能差别？的功能差别？HBS和和EBS的主要差别在于碳酸氢钠的水平的主要差别在于碳酸氢钠的水平,在在Eagles(2.2g/L)中比在中比在Hanks(0.35g/L)中高。碳酸氢中高。碳酸氢钠需用高水平的钠需用高水平的CO2平衡，以维持溶液的平衡，以维持溶液的PH值。值。Eagles液在空气水平的液在空气水平的CO2中，溶液会变碱，中，溶液会变碱，Hanks液在液在CO
83、2培养箱中会变酸。如果希望在培养箱中会变酸。如果希望在CO2培养箱中培养箱中保存组织，需要用保存组织，需要用Eagles液，。如果仅仅是清洗将要液，。如果仅仅是清洗将要在细胞培养基中储存的组织，用在细胞培养基中储存的组织，用Hanks液就可以了。液就可以了。升级篇升级篇- -细胞培养细胞培养8 835当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血当在无血清培养基中添加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度的清培养基中所使用浓度的50%。血清蛋白会结合和灭活一。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能些抗生素。在无血清培养条件下，抗生素不被灭活，可能对于细胞
84、达到毒性水平。对于细胞达到毒性水平。36一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时，您应该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本该在两到三周内使用它。因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。成分在解冻后就开始降解。37大部分添加物和试剂最多可以冻融大部分添加物和试剂最多可以冻融3次，如果次数更次，如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，将多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀，将会影响它的性能。会影响它的性能。38在溶解的一周内使用贮存在在溶解的一周内使用贮存在4冰箱中的液体胰蛋白冰箱中的液体胰蛋白酶溶
85、液。胰蛋白酶在酶溶液。胰蛋白酶在4就可能开始降解，如果在室温下就可能开始降解，如果在室温下放置超过放置超过30分钟，就会变得不稳定。分钟，就会变得不稳定。细胞分离试剂（细胞分离试剂（1 1） 大部分连续细胞系，强贴壁细胞系，许多早代细胞大部分连续细胞系，强贴壁细胞系，许多早代细胞HBSSHBSS或无钙镁或无钙镁PBSPBS0.250.25胰蛋白酶溶解在无钙镁平衡盐溶液中胰蛋白酶溶解在无钙镁平衡盐溶液中细胞表面蛋白完整性重要的连续细胞系细胞表面蛋白完整性重要的连续细胞系HBSSHBSS或无钙镁或无钙镁PBSPBS0.050.05胰蛋白酶溶解在胰蛋白酶溶解在0.53mM EDTA0.53mM ED
86、TA弱贴壁表皮细胞转化成纤维细胞（要求细胞表面完整性），原代细胞弱贴壁表皮细胞转化成纤维细胞（要求细胞表面完整性），原代细胞HBSSHBSS或无钙镁或无钙镁PBSPBSEDTA,EDTA,甘油甘油 溶解在柠檬酸钠中溶解在柠檬酸钠中强贴壁早代细胞系强贴壁早代细胞系HBSS或无钙镁或无钙镁PBS0.25胰蛋白酶溶解在胰蛋白酶溶解在1mMEDTA，Dispase单位单位/ml溶解在溶解在PBS细胞分离试剂（细胞分离试剂（2 2）上皮细胞上皮细胞0.5mM-1mMEDTA0.5mM-1mMEDTA，Dispase单位单位/ml溶解在溶解在PBS强贴壁细胞，上皮细胞，一些肿瘤细胞强贴壁细胞，上皮细胞，一
87、些肿瘤细胞0.5mM-1mMEDTA0.25胰蛋白酶胰蛋白酶1mMEDTA，Dispase单位单位/ml溶解在无钙镁溶解在无钙镁PBS厚培养物，多层富含胶原的密集培养厚培养物，多层富含胶原的密集培养1mMEDTA0.25胰蛋白酶，胰蛋白酶，200单位单位/ml胶原酶，胶原酶，1mMEDTA溶解在无钙镁平衡溶解在无钙镁平衡盐溶液中盐溶液中培养液培养液pH pH 值变化太快值变化太快CO2 CO2 张力不对。培养瓶盖拧得太紧。张力不对。培养瓶盖拧得太紧。NaHCO3 NaHCO3 缓冲系统缓缓冲系统缓冲力不足。培养液中盐浓度不正确。细菌、酵母或真菌污冲力不足。培养液中盐浓度不正确。细菌、酵母或真菌
88、污染。染。（1 1）按培养液中）按培养液中NaHCO3 NaHCO3 浓度增加或减少培养箱内浓度增加或减少培养箱内CO2 CO2 浓浓度，度，2.0g/L 2.0g/L 到到3.7g/L 3.7g/L 浓度浓度NaHCO3 NaHCO3 对应对应CO2 CO2 浓度为浓度为5 5到到1010。（。（2 2）改用不依赖）改用不依赖CO2 CO2 培养液。培养液。松开瓶盖松开瓶盖1/4 1/4 圈。圈。加加HEPES HEPES 缓冲液至缓冲液至10 10 到到25mM 25mM 终浓度。终浓度。在在CO2 CO2 培养环境中改用基于培养环境中改用基于EarleEarles盐配制的培养液，在盐配制
89、的培养液，在大气培养环境中培养改用大气培养环境中培养改用Hanks盐配制的培养液。盐配制的培养液。丢弃培养物或用抗生素除菌。丢弃培养物或用抗生素除菌。培养液出现沉淀，但培养液出现沉淀，但pHpH值不变值不变用洗涤剂清洗后残留磷酸盐将培养基成分沉淀下来。冰冻用洗涤剂清洗后残留磷酸盐将培养基成分沉淀下来。冰冻保存培养液。保存培养液。用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后除菌。用去离子水反复冲洗玻璃器皿，然后除菌。将培养液加热到将培养液加热到3737，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢，摇动使其溶解如沉淀仍然存在，丢弃培养液。弃培养液。培养液出现沉淀，培养液出现沉淀，同时同时pH pH 发生变化发生变化细菌或
90、真菌污染细菌或真菌污染丢弃培养物。丢弃培养物。或用抗生素除菌。或用抗生素除菌。培养细胞不贴壁培养细胞不贴壁胰蛋白酶消化过度。支原体污染。培养液中无贴壁因子。胰蛋白酶消化过度。支原体污染。培养液中无贴壁因子。缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。原体污染，丢弃培养物。悬浮细胞成簇悬浮细胞成簇培养液中含钙、镁离子。支原体污染。蛋白酶过度消化使培养液中含钙、镁离子。支原体污染。蛋白酶过度消化使得细胞裂解释放得细胞裂解释放DNADNA。用无
91、钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻轻吹吸细胞获得单细胞用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞，轻轻吹吸细胞获得单细胞悬液。悬液。分离培养物，检测支原体。如发现支原体污染，丢弃培养分离培养物，检测支原体。如发现支原体污染，丢弃培养物。物。用用DNase I DNase I 处理细胞。处理细胞。原代细胞培养物污染原代细胞培养物污染原代培养组织在进入培养前已污染原代培养组织在进入培养前已污染培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液反复冲洗组织。培养前用含高浓度抗生素的平衡盐溶液反复冲洗组织。培养细胞死亡培养细胞死亡培养箱内无培养箱内无CO2。培养箱内温度波动太大。细胞冻存或复苏过程中损。培养箱内温度波动太大。细胞冻存或复苏过
92、程中损伤。培养液渗透压不正确。培养液种有毒代谢产物堆积。伤。培养液渗透压不正确。培养液种有毒代谢产物堆积。检测培养箱内检测培养箱内CO2检查培养箱内温度检查培养箱内温度取新的保存细胞种取新的保存细胞种检测培养液渗透压。注意：大多数哺乳动物细胞能耐受渗透压为检测培养液渗透压。注意：大多数哺乳动物细胞能耐受渗透压为260350mOsm/kg。加入额外试剂如。加入额外试剂如HEPES或药物都有可能影响培养液渗或药物都有可能影响培养液渗透压。透压。换入新鲜培养液换入新鲜培养液培养细胞生长减慢培养细胞生长减慢由于更换不同培养液或血清。培养液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或由于更换不同培养液或血清。培养
93、液中一些细胞生长必需成分如谷氨酰胺或生长因子耗尽或缺乏或已被破坏。培养物中有少量细菌或真菌污染。试剂保生长因子耗尽或缺乏或已被破坏。培养物中有少量细菌或真菌污染。试剂保存不当。存不当。比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细胞生长实验。比较新培养液与原培养液成分，比较新血清与旧血清支持细胞生长实验。增加起始培养细胞浓度。增加起始培养细胞浓度。让细胞逐渐适应新培养液。让细胞逐渐适应新培养液。换入新鲜配制培养液。换入新鲜配制培养液。补加谷氨酰胺或生长因子。补加谷氨酰胺或生长因子。用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物。或用抗生素除菌。用无抗生素培养液培养，如发现污染，丢弃培养物。
94、或用抗生素除菌。血清需保存在血清需保存在-5到到-20。培养液需在。培养液需在28避光保存。含血清完全培养避光保存。含血清完全培养液在液在2-8保存，并在保存，并在2周内用完。周内用完。接种细胞起始浓度太低接种细胞起始浓度太低细胞已老化细胞已老化支原体污染支原体污染增加接种细胞起始浓度。增加接种细胞起始浓度。换用新的保种细胞。换用新的保种细胞。分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培分离培养物，检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染，丢弃培养物。养物。血清血清（1）1.保存血清最好的方法保存血清最好的方法?建议血清应保存在建议血清应保存在-5至至-2O。然而，
95、若存放于。然而，若存放于4时，请勿超过一个月。时，请勿超过一个月。若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回若您一次无法用完一瓶，建议您无菌分装血清至恰当的灭菌容器内，再放回冷冻。冷冻。2.如何解冻血清才不会使产品质量受损如何解冻血清才不会使产品质量受损?建议您将血清从冷冻箱取出后，先置于建议您将血清从冷冻箱取出后，先置于28冰箱使之融解，然后在室温下冰箱使之融解，然后在室温下使之全融。但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。使之全融。但必须注意的是，融解过程中必须规则地摇晃均匀。3.血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何处理血清解冻后发现有絮状沉淀物出现，该如何
96、处理?血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的血清中沉淀物的出现有许多种原因，但最普遍的原因是由于血清中脂蛋白的变性所造成，而血纤维蛋白变性所造成，而血纤维蛋白(形成凝血的蛋白之一形成凝血的蛋白之一)在血清解冻后，也会存在在血清解冻后，也会存在于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响于血清中，亦是造成沉淀物的主要原因之一。但这些絮状沉淀物，并不影响血清本身的质量。若欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管血清本身的质量。若欲去除这些絮状沉淀物，可以将血清分装至无菌离心管内，以内，以400g稍微离心稍微离心,上清液即可接着加入培养基内一
97、起过滤。我们不建议您上清液即可接着加入培养基内一起过滤。我们不建议您以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜。以过滤的方法去除这些絮状沉淀物，因为它可能会阻塞您的过滤膜。4.为什么要热灭活血清为什么要热灭活血清?加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，加热可以灭活补体系统。激活的补体参与溶解细胞事件，刺激平滑肌收缩，细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究，培养细胞和血小板释放组胺，激活淋巴细胞和巨噬细胞。在免疫学研究，培养ES细胞，昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。细胞，昆虫细胞和平滑肌细胞时，推荐使用热灭活血清。血血清
98、（清（2）5.有必要做热灭活吗有必要做热灭活吗?实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。实验显示，经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。而经过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下过热处理的血清，沉淀物的形成会显著的增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是观察，像是“小
99、黑点小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在放在37环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。扩增。6.为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀为什么储存在冰箱中的胎牛血清会出现沉淀?GIBICO的胎牛血清的胎牛血清没有预老化，储存在没有预老化，储存在28时，血清中的各种蛋白和脂时，血清中的各种蛋白和脂蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可蛋白（如冷凝集素、纤维蛋白原、玻粘连蛋白等）可能聚集而形成沉淀或可见的混浊。这应该不会影
100、响血清的质量。推荐在见的混浊。这应该不会影响血清的质量。推荐在20储存胎牛血清，避免储存胎牛血清，避免反复冻融。反复冻融。7.如何避免沉淀物的产生如何避免沉淀物的产生?解解冻冻血血清清时时，请请按按照照所所建建议议的的逐逐步步解解冻冻法法(-20至至4至至室室温温)，若若血血清清解解冻冻时改变的温度太大时改变的温度太大(如如-20至至37)，实验显示非常容易产生沉淀物。，实验显示非常容易产生沉淀物。解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。解冻血清时，请随时将之摇晃均匀，使温度及成分均一，减少沉淀的发生。请勿将血清置于请勿将血清置于37太久。若在太久。若在37放置太久，血清会变得混浊，同时血清放置太久，血清会变得混浊，同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。中许多较不稳定的成分也会因此受到损害，而影响血清的质量。血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以无须做此步骤。若必须做血清的热灭活，请遵守若必须做血清的热灭活，请遵守56，30分钟的原则，并且随时摇晃均匀。分钟的原则，并且随时摇晃均匀。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。温度过高，时间过久或摇晃不均匀，都会造成沉淀物的增多。
