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1、实用实用组织学与细胞化学组织学与细胞化学研究技术研究技术组组织织学学技技术术一一组织学技术的发展与应用组织学技术的发展与应用内内容：容：组组织织学学制制片片技技术术、胚胚胎胎学学制制片片技技术术、组组织织化化学学技技术术、荧荧光光技技术术、免疫组化技术、组织培养技术、组织工程技术等。免疫组化技术、组织培养技术、组织工程技术等。光光学学显显微微镜镜技技术术：特特殊殊显显微微镜镜技技术术（荧荧光光、倒倒置置、相相差差）、显显微微摄影技术等摄影技术等电子显微镜技术：电镜技术、电镜细胞化学技术等电子显微镜技术：电镜技术、电镜细胞化学技术等应应用用：Hooke发发现现细细胞胞，1811年年改改良良了了显
2、显微微镜镜组组织织学学基基础础。但是，不能看到透明的切片标本。但是，不能看到透明的切片标本。1851年，发现卡红可染细胞核，年，发现卡红可染细胞核，1865年，苏木精能染细胞核。年，苏木精能染细胞核。十九世纪十九世纪20年代年代Feulgen创立核酸反应。创立核酸反应。30年代，相继发明了相差显微镜。年代，相继发明了相差显微镜。特特别别是是，50年年代代组组织织化化学学与与电电镜镜技技术术迅迅速速发发展展和和提提高高，组组织织学学技技术进入了新时期。术进入了新时期。二二组织切片方法分类组织切片方法分类1切切片片法法：石石蜡蜡切切片片、明明胶胶切切片片、火火棉棉胶胶切切片片、电电镜镜超超薄薄切片
3、等（微米）切片等（微米）2涂片法：血液等液体涂片法：血液等液体3磨片法：骨等坚硬组织磨片法：骨等坚硬组织4分离制片法：分离单个细胞分离制片法：分离单个细胞平滑肌细胞、肝细胞等平滑肌细胞、肝细胞等5印片法：肝、脾、淋巴结等印片法：肝、脾、淋巴结等6活体制片：注射胎盘兰等，观察巨噬细胞的活动活体制片：注射胎盘兰等，观察巨噬细胞的活动7超活体染色制片：活体观察精子形态与活动等超活体染色制片：活体观察精子形态与活动等8整体切片法：用大型切片机，人胚、肝、肾、脑等整体切片法：用大型切片机，人胚、肝、肾、脑等组织制片技术组织制片技术普通制片技术普通制片技术HE切片术切片术一一基本程序基本程序(一一).动动
4、物物取取材材必必须须根根据据科科研研或或教教学学的的目目的的与与要要求求确确定定，医医学学领领域域以以人人的材料为最好，高级动物猴、猫、狗、豚鼠、大鼠、小鼠等。的材料为最好，高级动物猴、猫、狗、豚鼠、大鼠、小鼠等。动物麻醉法：动物麻醉法：1乙醚吸入麻醉：小鼠、大鼠、豚鼠等。在玻璃缸内进行。乙醚吸入麻醉：小鼠、大鼠、豚鼠等。在玻璃缸内进行。2注注射射麻麻醉醉法法：苯苯巴巴比比妥妥、乌乌拉拉坦坦等等，猴猴、猫猫、狗狗、兔兔等等大大型型动动物物，静静脉脉或腹腔注射。或腹腔注射。3直直接接杀杀死死法法：小小鼠鼠、大大鼠鼠、豚豚鼠鼠等等，用用金金属属器器械械猛猛击击后后脑脑部部第第四四脑脑室室区。区。取
5、材顺序：取材顺序：1腹腔器官：腹腔器官：肝、胆、胃、肾上腺、胰、脾、肝、胆、胃、肾上腺、胰、脾、十二指肠、空肠、回肠、结肠等十二指肠、空肠、回肠、结肠等2胸腔器官：胸腔器官：心脏、肺心脏、肺3盆腔器官：盆腔器官：膀胱、卵巢、输卵管、子宫等膀胱、卵巢、输卵管、子宫等4神经系统：神经系统：大脑、小脑、脊髓等大脑、小脑、脊髓等5眼球、内耳眼球、内耳（二）（二）固定固定目目的的：保保持持组组织织内内细细胞胞的的形形态态、结结构构及及其其化化学学组组成成，使使与与生生活活时时原原有有形形态态、结构及化学组成相似。结构及化学组成相似。1蛋白质、脂肪、类脂体、酶等沉淀或凝固蛋白质、脂肪、类脂体、酶等沉淀或凝
6、固抑制自溶。抑制自溶。2组织内各种不同物质产生不同的折光率，便于显微镜下观察。组织内各种不同物质产生不同的折光率，便于显微镜下观察。3某些固定剂可起到硬化作用，有利于组织切片：甲醛、乙醇、氯仿等。某些固定剂可起到硬化作用，有利于组织切片：甲醛、乙醇、氯仿等。4某些固定剂可起到媒染作用：重铬酸等。某些固定剂可起到媒染作用：重铬酸等。固定具体方法：固定具体方法：1小块固定法小块固定法110.3cm（不超过不超过0.5cm厚）。厚）。2整体固定法整体固定法（小动物（小动物灌流法），效果好。灌流法），效果好。固定液能迅速渗透到各器官、组织。固定液能迅速渗透到各器官、组织。具有一定硬度，有利于薄切。具有
7、一定硬度，有利于薄切。可避免因取材时间过久可避免因取材时间过久保持新鲜状态。保持新鲜状态。3蒸汽固定法蒸汽固定法用于涂片、印片等（骨髓涂片、淋巴印片）。用于涂片、印片等（骨髓涂片、淋巴印片）。固定液：应具有以下性能固定液：应具有以下性能1.对蛋白质、脂肪、类脂体、碳水化合物等具有沉淀、凝固作用。对蛋白质、脂肪、类脂体、碳水化合物等具有沉淀、凝固作用。2.具有一定穿透力具有一定穿透力迅速进入组织。迅速进入组织。3.对组织不引起收缩或膨胀。对组织不引起收缩或膨胀。4.对组织产生一定的硬化作用。对组织产生一定的硬化作用。5.具有一定具有一定pH值。值。6.对染色无副作用。对染色无副作用。常用固定剂：
8、常用固定剂：1.单纯固定剂：单纯固定剂：甲醛、乙醇、丙酮、重铬酸甲、锇酸等。甲醛、乙醇、丙酮、重铬酸甲、锇酸等。甲甲醛醛：常常用用，pH值值为为中中性性。穿穿透透组组织织速速度度快快，固固定定均均匀匀，组组织织收收缩缩小小。它是蛋白质最好的固定剂，在组织化学中广泛应用。它是蛋白质最好的固定剂，在组织化学中广泛应用。乙乙醇醇：常常用用的的固固定定剂剂与与保保存存剂剂，穿穿透透组组织织速速度度快快。具具有有固固定定、凝凝固固蛋蛋白白质质作用，亦具有硬化组织和脱水等作用。作用，亦具有硬化组织和脱水等作用。丙丙酮酮：可可作作固固定定剂剂与与脱脱水水剂剂，对对某某些些酶酶（碱碱性性磷磷酸酸酶酶、酸酸性性
9、磷磷酸酸酶酶等等）固固定效果好。定效果好。锇锇酸酸：强强氧氧化化剂剂，不不能能与与甲甲醛醛、乙乙醇醇等等混混合合。使使蛋蛋白白胶胶状状固固定定而而不不发发生生沉沉淀，为脂肪、类质脂、髓鞘等优良固定剂。目前为电镜标本常用的固定剂。淀，为脂肪、类质脂、髓鞘等优良固定剂。目前为电镜标本常用的固定剂。2.混混合合固固定定剂剂：甲甲醛醛混混合合固固定定剂剂、乙乙醇醇混混合合固固定定剂剂、丙丙酮酮混混合合固固定定剂剂、重铬酸甲混合固定剂、锇酸混合固定剂等。重铬酸甲混合固定剂、锇酸混合固定剂等。（三）（三）冲洗冲洗目目的：的：1停止固定液继续对组织的作用。停止固定液继续对组织的作用。2除去组织中多余的固定剂
10、，以免影响染色。除去组织中多余的固定剂，以免影响染色。方方法：法：1.简易流水冲洗法。简易流水冲洗法。2系列玻璃瓶或水槽冲洗法。系列玻璃瓶或水槽冲洗法。(四）脱水四）脱水目目的：的：1.除去组织中含有的水分除去组织中含有的水分脱水。脱水。2.脱水后便于石蜡包埋等。脱水后便于石蜡包埋等。脱水剂：乙醇、丙酮、正丁醇等。脱水剂：乙醇、丙酮、正丁醇等。方方法：由低浓度逐渐升高浓度，以避免组织收缩。法：由低浓度逐渐升高浓度，以避免组织收缩。23mm5mm50%Alc68h612h70%68h612h（过夜）过夜）80%46h68h95%（）24h36h95%（）24h36h100%（）12h24h100
11、%（）12h24h（五）（五）组织透明组织透明乙醇不能与石蜡混合，需要经过一种乙醇与石蜡之间媒乙醇不能与石蜡混合，需要经过一种乙醇与石蜡之间媒浸物，即透明剂。透明剂可能取代乙醇而使组织呈透明浸物，即透明剂。透明剂可能取代乙醇而使组织呈透明状，而液态石蜡则可取代透明剂乙醇进入组织。当液态状，而液态石蜡则可取代透明剂乙醇进入组织。当液态石蜡形成固态之后，便于薄切。石蜡形成固态之后，便于薄切。常用透明剂：常用透明剂：二甲苯二甲苯易挥发，折光率易挥发，折光率1。497，沸点，沸点144，透明力强。，透明力强。此外，甲苯、苯、氯仿、丁香油等。此外，甲苯、苯、氯仿、丁香油等。步步骤：骤：1先二甲苯：纯乙醇
12、（先二甲苯：纯乙醇（1：1）2二甲苯二甲苯（六）（六）包埋包埋1渗蜡（浸蜡）：渗蜡（浸蜡）：重要步骤。熔化为液态的重要步骤。熔化为液态的石蜡透过组织间隙进入到组织中。石蜡透过组织间隙进入到组织中。步骤：步骤：（1）软蜡：熔点软蜡：熔点54560C透蜡透蜡（2）硬蜡：熔点）硬蜡：熔点56580C渗蜡渗蜡以上均在温箱中进行。以上均在温箱中进行。不能超过不能超过600C，否则变脆、收缩。否则变脆、收缩。2.包埋：包埋：硬蜡硬蜡60620C（七）（七）切片切片切片机：回转切片机、滑动切片机、冷冻切片机等切片机：回转切片机、滑动切片机、冷冻切片机等切片是整个制片过程中关键的步骤（切片厚度：切片是整个制片
13、过程中关键的步骤（切片厚度：46m）（八）八）切片贴展切片贴展将薄切的切片贴附载将薄切的切片贴附载玻玻片上片上要要求：求：1牢固，染色时不能脱落牢固，染色时不能脱落。2展开皱褶，不影响将来的观察。展开皱褶，不影响将来的观察。（九）（九）染染色色染染料：料：根据染料的来源分为天然染与人工染料两种。根据染料的来源分为天然染与人工染料两种。染色化学性质分为弱酸性、强酸性、弱碱性、强碱性及中性。染色化学性质分为弱酸性、强酸性、弱碱性、强碱性及中性。依染色对象分为胞核染料与胞质染料。依染色对象分为胞核染料与胞质染料。1染料的来源染料的来源天然染料：天然染料：为天然产物，从动物或植物体中提取的为天然产物，
14、从动物或植物体中提取的苏木精苏木精从苏木树的树心中提炼出来的从苏木树的树心中提炼出来的为优质的细胞核染料。为优质的细胞核染料。胭脂红（卡红）胭脂红（卡红）雌性介壳虫（胭脂虫）中加工而得雌性介壳虫（胭脂虫）中加工而得染色质染色质着色最佳。着色最佳。地衣红（俄西印）地衣红（俄西印）地衣纲质物（茶荠地衣）中提取地衣纲质物（茶荠地衣）中提取弹弹性纤维染料。性纤维染料。人工合成染料：人工合成染料：由芳香环或具有芳香环性质的杂环化合物所构成。由芳香环或具有芳香环性质的杂环化合物所构成。硝基类（苦味酸）：硝基类（苦味酸）：胞浆染料胞浆染料醌型苯环类：醌型苯环类：甲基绿、甲基紫、酸性复红、水溶性苯胺兰、孔雀绿
15、、甲基绿、甲基紫、酸性复红、水溶性苯胺兰、孔雀绿、亮绿等。亮绿等。丫叮染料：丫叮染料：伊红丫、丫叮黄等。伊红丫、丫叮黄等。醌亚胺类染料：醌亚胺类染料：美兰、甲苯胺兰、硫堇、中性红等。美兰、甲苯胺兰、硫堇、中性红等。偶氮类染料：偶氮类染料：偶氮卡红、桔黄偶氮卡红、桔黄G、苏丹苏丹、刚果红、胎盘兰等。、刚果红、胎盘兰等。（十）封片（十）封片HE染色的步骤与方法染色的步骤与方法染色步骤染色步骤:1.切片脱蜡切片脱蜡二甲苯二甲苯510分钟分钟2.切片从而甲苯中取出切片从而甲苯中取出,无水乙醇中无水乙醇中13分钟分钟,洗去石蜡和二甲苯洗去石蜡和二甲苯3.切片浸入切片浸入95%乙醇中乙醇中13分钟分钟,组
16、织切片呈白色组织切片呈白色4.切片浸入切片浸入80%乙醇中乙醇中12分钟分钟,逐步降低乙醇浓度逐步降低乙醇浓度5.切片经切片经lugol氏碘乙醇氏碘乙醇35分钟分钟,除去组织中的汞盐沉淀除去组织中的汞盐沉淀6.普通水冲洗碘液普通水冲洗碘液7.金如金如5%硫代硫酸钠硫代硫酸钠12分钟分钟,洗去棕色洗去棕色8.普通水普通水-蒸馏水漂洗蒸馏水漂洗,以备染色以备染色9.切片入苏木精染色切片入苏木精染色,1015分钟分钟10.水洗水洗11.切片经盐酸切片经盐酸-酒精分色酒精分色1020秒秒.此为苏木精染色个关键此为苏木精染色个关键-细胞核染成深蓝色细胞核染成深蓝色12.充分水洗充分水洗(注意注意:不要洗
17、掉切片不要洗掉切片!)13.0.51%伊红染胞质伊红染胞质310分钟分钟,淡红色即可淡红色即可14.95%乙醇中分色乙醇中分色13分钟分钟,洗去切片上多余的伊红洗去切片上多余的伊红15.95%乙醇中继续分色乙醇中继续分色13分钟分钟16.100%乙醇中脱水鉴别乙醇中脱水鉴别23分钟分钟17.100%乙醇中完全脱水乙醇中完全脱水23分钟分钟18.立即二甲苯中透明立即二甲苯中透明35分钟分钟19.中性树胶封片中性树胶封片20.镜检染色结果镜检染色结果:细胞核细胞核-深蓝色深蓝色,细胞质细胞质-红色红色,结缔组织为淡红色结缔组织为淡红色,肌纤维为红色肌纤维为红色,胶原纤维为红色胶原纤维为红色,软骨组
18、织为深蓝色软骨组织为深蓝色,红细胞为桔红色红细胞为桔红色涂片涂片:血液等血液等铺片铺片:疏松结缔组织、肠系膜等疏松结缔组织、肠系膜等磨片：骨、牙等磨片：骨、牙等人工假象：凡是标本制作过程中产生的人为现象为人工假象。缩、涨、裂、人工假象：凡是标本制作过程中产生的人为现象为人工假象。缩、涨、裂、褶、色素沉着等。褶、色素沉着等。几种特殊显微镜：几种特殊显微镜：1相差显微镜相差显微镜观察组织活细胞，标本不染色，反差小。观察组织活细胞，标本不染色，反差小。2倒置显微镜倒置显微镜目镜在下，光源在上，观察瓶底培养的活细胞。目镜在下，光源在上，观察瓶底培养的活细胞。人工假象小小结结:1。简述。简述HE切片制备的大体程序？切片制备的大体程序？2。组织切片有几种方法？。组织切片有几种方法？3。简述组织取材的大体顺序？。简述组织取材的大体顺序？ 谢谢 谢！谢！
