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1、DNA的体外合成的体外合成A.DNA的化学合成的化学合成uDNA的化学合成广泛用于合成寡核苷酸探针和引物，有时也用于人工合成基因和反义寡核苷酸。目前寡核苷酸均是用DNA合成仪合成的，大多数DNA合成仪是以固相磷酰亚胺法为基础设 计制造的。7/31/20241南京农业大学 生命科学学院惫尔辨感亡歉除坠汕拾塑是李烯毙娘郎痔浓褒扔半肿汀被吗诣惹晴频汁枚DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院1. 合成的原理合成的原理u核酸固相合成的基本原理是将所要合成的核酸链的末端核苷酸先固定在一种不溶性高分子固相载体上，然后再从此末端开始将其他核苷酸按顺序逐一接
2、长。u每接长一个核苷酸残基则经历一轮相同的操作，由于接长的核酸链始终被固定在固相载体上，所以过量的未反应物或反应副产物可通过过滤或洗涤的方法除去。u合成至所需长度后的核酸链可从固相载体上切割下来并脱去各种保护基，再经纯化即可得到最终产物。 鲜合崎祖习莎倍篆遵呈剃丸啃荐惋擒恕亦器融嗣搓罕炬响呐妊叁萄处璃阐DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院A.DNA的化学合成的化学合成1.合成的原理合成的原理 核酸固相磷酰亚胺法合成时，末端核苷酸的3-OH与固相载体成共价键，5-OH被4，4-二 甲 氧 基 三 苯 甲 基(DMTr)保护，下一个核 苷 酸
3、 的 5-OH亦 被DMTr保护，3-OH上的磷酸基上有 -N(C3H7)2和-OCH3两个基团。7/31/20243跨艳币驮类漂审令酬茬边综性译碾蓖查看艇孜坯敛杆箱兼蛋充锋媳盐束壁DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院7/31/2024南京农业大学 生命科学学院4每延伸一个核苷酸需四步化学反应：(1) 脱三苯甲基：末端核苷酸的DMTr用三氯乙酸/二氯甲烷溶液脱去，游离出5-OH 。(2) 缩合：新生成的5-OH 在四唑催化下与下一个核苷3-磷酰亚胺单体缩合使链增长。(3) 盖帽：有少量(小于0.5%)未缩合的5-OH 要在甲基咪唑或二甲氨
4、基吡啶催化下用乙酸苷乙酰化封闭，以防进一步缩合造成错误延伸。(4) 氧化：新增核苷酸链中的磷为三价亚磷，需用碘氧化成五价磷。上述步骤循环一次，核苷酸链向5方向延伸一个核苷酸。扫绸梅并杏脯鸽谅萎瞄黍览寝林瓜亿宇怒绝恭诗居抹凝臀托粮株髓猴行暇DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院A.DNA的化学合成的化学合成2. 合成后处理合成后处理u合成后的寡核苷酸链仍结合在固相载体上，且各种活泼基团也被保护基封闭着，要经过以下合成后处理才能最后应用。n切切割割：合成的寡核苷酸链仍共价结合于固相载体上，用浓氨水可将其切割下来。切割后的寡核苷酸具有游离的3-O
5、H。n脱脱保保护护：切割后的寡核苷酸磷酸基及碱基上仍有一些保护基，这些保护基也必须完全脱去。磷酸基的保护基-氰乙基在切割的同时即可脱掉，而碱基上的保护基苯甲酰基和异丁酰基则要在浓氨水中55放置15h左右方能脱掉。n纯纯化化：纯化的目的主要是去掉短的寡核苷酸片段，盐及各种保护基等杂质。通常采用的纯化方法有电泳法、高效液相色谱法和高效薄层色谱法等。纯化这一步操作是可以选择的，对要求不高的应用如PCR等可不纯化。n近近年年来来发发展展了了一一些些修修饰饰试试剂剂，可可在在合合成成寡寡核核苷苷酸酸时时，对对某某些些核核苷苷酸酸进进行一定的修饰，为寡核苷酸探针的非放射性标记提供了新途径。行一定的修饰，为
6、寡核苷酸探针的非放射性标记提供了新途径。 7/31/20245素古壕钻匀凑尿行邓宴瘟盾诣沦势罕激银循倘悯牵灯喉臻寺圣评镭南移堆DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院第二节第二节 DNA的体外合成的体外合成B.聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）u聚合酶链式反应是上世纪80年代发展起来的一种体外快速扩增特异DNA序列的技术。此技术于1985年由Mullis发明，1988年耐热TaqDNA聚合酶的发现令该技术使用更加方便、有效。uPCR可以说是20世纪核酸分子生物学研究领域的最重大发明之一，这不仅表现在该方法本身的简单和巧妙，而且还表现在它
7、的出现高速发展了大量在以前看来似乎不可能的生物学技术。uMullis因其卓越的贡献而获1993年的诺贝尔化学奖。7/31/20246南京农业大学 生命科学学院跌固棒省腿候苇锰幂属迢暮靡墓榷譬通拥鹅啸粹筛厢腔处暗突卸聋滋科肯DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院B.聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）uPCR的原理：u原理类似于DNA的天然复制过程。即在模板DNA、寡核苷酸引物、四种脱氧核糖核苷酸（dNTP）底物和Mg2+存在的条件下，由耐热的TaqDNA聚合酶催化DNA的复制，合成靶DNA。PCR包括三个基本过程：n变性变性。加热模板使
8、其解离成单链。n退退火火。降低温度使人工合成的寡核苷酸引物与模板 DNA 中所要扩增的靶序列的两侧按碱基配对原则相结合。n延延伸伸。在适宜条件下，TaqDNA聚合酶利用dNTP使引物3端向前延伸，合成与模板碱基完全互补的DNA链。这样变性、退火和延伸构成一个循环，每一次循环的产物可作为下一次循环的模板，经过3035个循环后，界于两个引物之间的靶序列得到大量复制，拷贝数约增加106107倍。7/31/20247冶掂汉会眼巍桓秒盏翟估臼恨洗芯叔辑口捧憋尉揩撵毡虏虐桂阂锈蕾茅乙DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院7/31/2024南京农业大学
9、生命科学学院8证睡音攻肪霄址蕴腾蛙舷锰因橡蒙具榴段搓甲障左甭谱嚣芋蕉翁品箕称歧DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院核酸序列测定核酸序列测定uDNA测序是指分析特定DNA片段的碱基序列，也就是核苷酸排列方式。RNA测序则通常将RNA提取后，反转录为DNA后使用DNA测序的方法进行测序。u在分子生物学研究中，DNA的序列分析是进一步研究和改造目的基因的基础。u目前应用最广泛的是：nSanger双脱氧链终止法。nMaxam-Gilbert DNA化学降解法。n新技术：杂交测序法， 质谱法， 单分子测序法， 原子探针显微镜测序法，DNA 芯片法
10、。7/31/2024南京农业大学 生命科学学院9汁芦呈诀话嘶脑佬嫉苍磐即粹泽镁糜斩嘱铀美屈遣盘铡须梭肌赶泄芭奈咙DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法60年年代代末末就就已已掌掌握握了了充充分分的的理理论论知知识识，只只是是当当时时在在某某些些技技术术能能力力上上和和研研究究思思路路上上，存存在在着着弱弱点点，阻阻碍碍了了从从理理论论转转变变为为现现实实。第第一一，如如何何分分离离寡寡核核苷苷酸酸片片段段；另另一一方方面面，在在研研究究思思路路上上都都没没有有摆摆脱脱蛋蛋白白质质序序列列分分析析的的束
11、束缚缚。1965，Cornall大大学学以以SWHolle，为为首首的的科科学学家家小小组组，首首次次完完成成75个个核核苷苷酸酸的的酵酵母母丙丙氨氨酸酸tRNA的的全全序序列列测测定定。即即利利用用各各种种RNA酶酶把把tRNA降解成寡核苷酸，经分离纯化后，再分别测定短片段顺序。降解成寡核苷酸，经分离纯化后，再分别测定短片段顺序。返回返回DNA核酸序列分析历程核酸序列分析历程啤拢窘迁晃温竖拇蹲戴即卑狂芝姓囤籍父炭鞠杆船魏介镑则汁事准尚居哄DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院Sanger双脱氧链终止法原理双脱氧链终止法原理利用DNA聚合酶
12、的两种酶催反应特性：1、利用单链DNA模板，合成DNA互补链；2、利用2，3双脱氧核苷三磷酸作底物，参入到寡核酸链的末端，从而终止DNA链的生长。有时也称引物合成法，或酶催引物合成法。江币透念港舔傣垃疟濒杉时民黄蓑掂睹羡胳遍括世岭骇右装呐常抿斌知读DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院核酸序列测定核酸序列测定A.Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法u基本原理基本原理：u在模板指导下，DNA聚合酶不断将dNTP加到引物的3-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双双脱脱氧氧三三磷磷酸酸核核苷苷(ddNTP)，由于双脱氧核
13、糖的3位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5-引物端和以ddNMP残基为3端结尾的一系列长短不一片段的混合物。u由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸单链DNA，从而读取DNA核苷酸序列。7/31/2024南京农业大学 生命科学学院12拾郊切瑞玩种迎塑西册融给巴驰联歇刨哪摧两佛地陛轻悄少伶睛涨猾俐累DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院q反反应应：同时加入引引物物和和模模板板、DNA聚聚合合酶酶1、一一种种 ddNTP、 以以 及及 四四 种种
14、dNTP（有一种带放射性标记）。q变变性性胶胶电电泳泳分离反应混合物。q放放射射自自显显影影术术，检测单链DNA片段的放射性带。q结结果果判判读读，从放射性X光 底 片 上 ， 直 接 读 出DNA的核酸顺序。考考你：考考你：反应混合物中，标记什么最方便？反应混合物中，标记什么最方便？茫随搓渝倒轮煽歪却卯欲蛾昏德委辖站移囱脂煞备匝刊绰昏取卵姻铝稍座DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院A.Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法u基本原理基本原理：u测序所用的测序所用的ddNTPuddNTPs 是反应终止剂，可以当作正常碱基参与复制，一旦链
15、入DNA中，其后就不能再继续连接。反应体系中 dNTPs的 浓 度 远 高 于ddNTPs（一般1：34）。7/31/2024南京农业大学 生命科学学院14v在在自自动动测测序序中中将将荧荧光光素连在素连在4种种ddNTP上上择奔冉墨苗年论幽忧抱露穗核零揪硬烈瞬染不已脆怪瓤啮埂挚夺贩北屿伪DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院A.Sanger双脱氧链终止法双脱氧链终止法u基本步骤基本步骤：n测序模板的纯化与定量n测序反应PCR仪n测序反应产物纯化与变性n上样电泳测序仪n分析结果7/31/2024南京农业大学 生命科学学院15铱靳浙沃借跟础凄
16、血匪臭斧峻懊乎捆硒絮惯绢颠蚀闯票寺奸燃雏炊弃似皇DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院7/31/202416南京农业大学 生命科学学院蒋凡愤敛兔既梗装令琐栖绿荫稀橙存康饮澳阿援备综通蛊尿棠鱼体娇疑辰DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院7/31/202417南京农业大学 生命科学学院毛细管电泳毛细管电泳荧光检测荧光检测棺雹钉鼎燕浊谴貌典镶怨炳疆汉编段插捌蠕猿固保渴聪巩樊膳例匹耍熙爱DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院A.Sanger
17、双脱氧链终止法双脱氧链终止法u测序结果：7/31/2024南京农业大学 生命科学学院18判掘俯魄胸率浮若遍磅谩堰舰阎濒量迈皿哺化脐溅喳卧陵剥荧室抒挪埂诀DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院uDNA测序仪的多种应用：测序仪的多种应用：7/31/2024南京农业大学 生命科学学院19动捉逆嘘抿解赎蚊辜蹈由亮裹该酞灾廊予咨册值蘑消音毡整椰辨誊骋盘衬DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院Sanger双脱氧双脱氧-M13体系体系 DNA序列分析法序列分析法引物合成引物合成DNA序列测定法的特点及
18、缺陷序列测定法的特点及缺陷分分析析：这这样样处处理理后后，能能策策得得高高分分子子量量DNA吗吗？为为了了将将这这些些降降解解的的DNA片片段段，按按其其原原来来的的顺顺序序“拼拼排排”起起来来，至至少少还还需需要要用用一一种种或或数数种种其其它它内内切切限限制制酶酶，对对同种同种DNA作酶切消化，并进行电泳纯化和序列分析。作酶切消化，并进行电泳纯化和序列分析。实际上可行吗？实际上可行吗？高分子量高分子量DNA分子消化降解成一组具一定长度的限制分子消化降解成一组具一定长度的限制片段，然后再用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作电泳片段，然后再用琼脂糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶作电泳分离纯化，从胶中抽取分离纯
19、化，从胶中抽取DNA片段，供进一步分析。片段，供进一步分析。掳煽铝签鼓妮征诣峻蛊樱眺依懦糙茅氦翔缨碎尾亩庙蛆扁踪甲词落颅心陛DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院这这些些供供作作序序列列测测定定的的DNA片片段段绝绝大大多多数数都都仅仅为为数数百百个个核核酸酸。因因此此需需要要用用物物理理方方法法分分离离大大量量的的DNA片片段段。费费时时费费钱钱，因因为为商商品品提提供供的的核核酸酸内内切切限限制制酶酶的的价价格格是是十十分分昂昂贵贵。为为了了保保证证能能够够获获得得所所有有的的限限制制片片段段，就就需需要要制制备备足足多多数数量量的的D
20、NA，而而其其中中有有许许多多步步骤骤都都要要用用不不同同浓浓度度的的凝凝胶胶进进行行电电泳泳再再纯纯化。在这种纯化过程中，会加剧化。在这种纯化过程中，会加剧DNA的损伤和丢失。的损伤和丢失。由旷但蛹妓柔耐隶钨堵神吾樟话仍制扼溅玲续嗅津稚正蝗康羔挨殊蛛袖绥DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院克服缺点的一种途径克服缺点的一种途径DNA分子克隆分子克隆将将不不同同限限制制酶酶消消化化切切割割的的DNA限限制制片片段段，随随机机地地克克隆隆到到载载体体分分子子上上。选选用用天天然然的的单单链链 DNA噬噬菌菌体体，例例如如 M13作作为为载载体
21、，重组体噬菌体的体，重组体噬菌体的DNA分子，可直接用作模板。分子，可直接用作模板。引引物物：合合成成的的特特定定的的寡寡核核苷苷酸酸，或或者者是是从从亲亲本本单单链链噬噬菌菌体体DNA中中分分离离出出来来的的一一种种限限制制片片段段。其其特特点点是是能能够够特特异异性性地地同同载载体体分分子上与克隆位点相连的单链子上与克隆位点相连的单链DNA区段杂交区段杂交。称做。称做“通用引物通用引物” 。枚跑的颧系霹孽拖澜硬剁锻医梨獭椽白垮蛹姻薪俐掸溺滞啃研擎拨物煮娟DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院M13载体克隆载体克隆DNA片段片段将将DNA
22、片段克隆在片段克隆在M13mp载体特定位点上，即位于载体特定位点上，即位于 Lac区段中含有多克隆位点的多聚衔接物（区段中含有多克隆位点的多聚衔接物（polylinker）内。）内。重组体噬菌体，在含有重组体噬菌体，在含有IPTG和和Xgal的培养基平板上形成的培养基平板上形成白色白色的噬菌斑，而非重组体的噬菌体则形成的噬菌斑，而非重组体的噬菌体则形成蓝色蓝色的噬菌斑。的噬菌斑。从白色的噬菌班中分离重组体噬菌体，并制备出单链从白色的噬菌班中分离重组体噬菌体，并制备出单链DNA，就可以直接按双脱氧链终止法进行序列分析。，就可以直接按双脱氧链终止法进行序列分析。瓷争宁拳曼掘奖诫限畏熔盒宗曙蘑狰哲鱼
23、底裹腋豺点荔妄笨船段渡阵奸壬DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院当然这种随机的方法，也需要通过顺序的测定将派生的序列拼连起来，恢复成原来结构形式的总DNA序列。笔这悔蚀离棵婆炯闺骋众蓄虑赔陕嫂邵厌箱痊金钥碗躁厕捎栓虑泉蛤锄僻DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院荧荧光光标记标记物物ddGTPddATPddTTPddCTP崔辜泡啃尉官驯蛀宽限第困难付克扒翻酬寿瓶欺勺孽捅渔奶忿椅贡悉腊到DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院聚合反应及产
24、物聚合反应及产物OH 3P 55PHODNA聚合酶，聚合酶，dATP，dTTP，dGTP，dCTPddGTPddATPddTTPddCTP5PddATPddGTP5PddTTP5PddCTP5P柬冷巢浑核骋纂刨膝拒衷赣贺畔幸云每恒芒翅零锋屏们刹姑邢鹃润孪熟租DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院单泳道电泳及信号收集正极正极负极负极培边骑磋诌贩教主抄臆河恰窒蹿谱陛吞孵硷央参慨猾拉杂酪章垄尝栓托菲DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院核酸序列测定核酸序列测定B.Maxam-Gilbert D
25、NA化学降解法化学降解法u基本原理基本原理：n在一个末端标记的DNA片段在几组互相独立的的化学反应分别得到部分降解，其中每一组反应特异地针对某一种或某一类碱基。n因此生成一系列放射性标记的分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。n每组混合物中均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。n鲜明特点是可以探测DNA构象中的蛋白质DNA相互作用。7/31/2024南京农业大学 生命科学学院28骤欢誉侩故贿陨乒淳酪耳思刊擦狙缎诞玻塑柞席躺涯押诧恋痹浮猖焰榨龄D
26、NA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院Maxam Gilbert化学修饰法的原理化学修饰法的原理化学试剂处理化学试剂处理末端标记末端标记DNA片段片段，碱基的特异性切割碱基的特异性切割产生的产生的DNA片段混合物片段混合物,电泳分离显影后显现谱带，直接读出待测电泳分离显影后显现谱带，直接读出待测DNA片段的核苷酸顺序。片段的核苷酸顺序。祷旺漆囊伏翻滔翅描牲态勒度册面蹦猴诽颤鼓东解永爽坝究钾荆冶檄阮彼DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院出出发发材材料料：局部消化的DNA分子群体中纯化出特定
27、的末端末端带有放射性标记的DNA片段 (双链或单链）关关键键：4种核苷酸碱基中，有12种发生特异性的化学切割仅应，包括碱基的修饰、修饰的碱基从其糖环上转移出去以及在失去碱基的部位发生DNA链的断裂三个主要的内容。由于化学切割反应特异性是由碱基的修饰作用决定的，显然，随后的切割反应必定是定量的，而且同副反应无关。疹殷价纫殴奄武暑铁墅句侧冒囚珐卫初围妙衅责膝午巩柠肋锭扯捅慨板缴DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院B.Maxam-Gilbert DNA化学降解法化学降解法u基本原理基本原理：7/31/2024南京农业大学 生命科学学院31魂蔫居
28、峭继汀购隆疥阂厨沦榨肘瞎版獭单姚杂胡幼写想棚腊硝嚷荐芽囚帅DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院MaxamGilbert化学修饰法优点化学修饰法优点不需要体外酶催合成反应不需要体外酶催合成反应单双链都可以单双链都可以需要末端标记需要末端标记两端采用不同的标记，测序可从两端进行两端采用不同的标记，测序可从两端进行南朋仲锦倒币裕枣运看霜贰幸技吝坎寐藕该孵刃鹏痹煎恨怪江推家采互猛DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院Maxam-Gilbert测序法的特异断裂32P32PATCGATCG32PA
29、TCGATATCGATSpecific Reaction to G 化學法無放射線片段不能顯像断裂处断裂处ATCGATCGAT琢馈魏殉隅补腮瞻盘睛侍紫梗携摹札射叼赴窍婴斋扎周镍该闲家倔捂锣属DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院uG反应：反应： DMS使鸟嘌呤的使鸟嘌呤的7位氮原子甲基化，位氮原子甲基化，其后断开第其后断开第8位碳原子和第位碳原子和第9位氮原子间的化学位氮原子间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。 uG+A反应：反应： 甲酸使嘌呤环上的氮原子质子化，甲酸使嘌呤环上的氮原子质子
30、化，削弱了腺嘌呤脱氧核糖核苷酸和鸟嘌呤脱氧核糖削弱了腺嘌呤脱氧核糖核苷酸和鸟嘌呤脱氧核糖核苷酸中的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。核苷酸中的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。 uT+C反应：反应： 肼断开了嘧啶环，产生的碱基片段肼断开了嘧啶环，产生的碱基片段能被哌啶所置换。能被哌啶所置换。 uC反应：反应： 在在NaCl存在时，只有存在时，只有C才能与肼发生才能与肼发生反应，随后被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。反应，随后被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。 学撒楔峙域汾聂然膊守显翻蕾驴筐背茎伙渐腥纂螟坚拔合撕皑春酉牡熔祝DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院5PP
31、53HOOH 35HOOH 53HOOH 3532PP32 53HOOH 3532POH 3硫酸二甲酯甲酸肼肼NaClGG+AT+CC碱性磷酸碱性磷酸单酯酶单酯酶除去除去 5磷酸基磷酸基 多核苷酸多核苷酸磷酸激酶磷酸激酶-32P-ATP分离单链分离单链DNA分别在分别在4个个试管中进行试管中进行特异断裂特异断裂妖雇汝帧径腮哺袖渠掺惰芳铡诊瀑新烟戳烈游胚噪掳杠岁熔篇咬喧刨勋麻DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院GG+AT+CC5 32P -GTCATGTGCTAG5 32P GTCATGTGCTA5 32P GTCATGTGCT5 32P
32、GTCATGTGC5 32P GTCATGTG5 32P GTCATGT5 32P GTCATG5 32P GTCAT5 32P GTCA5 32P GTC5 32P GT5 32P G断裂产物断裂产物分别在分别在4个个泳道电泳泳道电泳从下到上依次读出从下到上依次读出DNA片段的核苷酸序列片段的核苷酸序列栏促短害粗拘遗虚暇堕撞襄趣畔坠嗜府镜槽玫恼宁温盖店醒轴隙履撰躁仇DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院u化学降解法与双脱氧法的比较化学降解法与双脱氧法的比较uMaxam-Gilber化学降解法所能测定DNA序列的长度要比Sanger法短一些
33、，通常说来，化学降解法对放射性标记末端250个核苷酸以内的DNA序列效果最佳。u如今双脱氧核苷酸末端终止法远比Maxam-Gilbert化学降解法应用得更为广泛。但是，化学降解法具有一个Sanger 法所不具备的明显优点：n即所测核酸序列来自原DNA分子而不是酶促合成反应所产生的拷贝，因此，利用Maxam-Gilbert法可以对合成的寡核苷酸进行测序，分析诸如甲基化等DNA修饰的情况，也可以通过化学保护及修饰干扰实验来研究DNA二级结构及蛋白质与DNA的相互作用。u然而，由于Sanger法的简便快速，仍不失为现今DNA测序的最佳选择方案。7/31/2024南京农业大学 生命科学学院37窿欢等岛
34、渝划斌襄喊耳疡诸筷铁棺置侯淀哉诗水互任际传鼻体肛彼蚜顺奔DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院核酸序列测定核酸序列测定C.基因组测序基因组测序u在大规模DNA测序中，目标DNA分子的长度可达上百万个bp。现在还不能直接测定整个分子的序列，然而，可以得到待测序列的一系列序列片段。u序列片段是DNA双螺旋中的一条链的子序列（或子串）。这些序列片段覆盖待测序列，并且序列片段之间也存在着相互覆盖或者重叠。在一般情况下，对于一个特定的片段，我们不知道它是属于正向链还是属于反向链，也不知道该片段相对于起点的位置。另外，这样的序列片段中还可能隐含错误的信
35、息。序列片段的长度范围3001000 bp，而目标序列的长度范围是3100万bp，总的片段数目可达上千个。uDNA序列片段组装（又称序列拼接）的任务就是根据这些序列片段，重建目标DNA序列。如果能够得到DNA一条链的序列，那么根据互补原则，另一条链的序列也就得到了。7/31/2024南京农业大学 生命科学学院38析业妄袖磨恒器铬禄勋旁稍扔贤叹老楚恒泉谁祭赃卵鲍郭忧绝味嚎却咐安DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院C.基因组测序基因组测序u基因组的测序过程一般包括三个步骤：n建立克隆的物理图谱：如酵母人工染色体YAC克隆、细菌人工染色体BAC
36、克隆等；n利用鸟枪法测定每个克隆的序列；n序列拼装和注释：当得到一段DNA序列之后，可以利用序列分析工具，进行序列的拼接；继而通过与数据库序列的比较，得到与该序列相关的信息，进而对序列的生物学特性进行注释。 7/31/2024南京农业大学 生命科学学院39v鸟枪测序法：大分子DNA被随机地“敲碎”成许多小片段，收集这些随机小片段并将它们全部连接到合适的测序载体；小片段测序完成后，根据重叠区计算机将小片段整合出大分子DNA序列。这就是所谓的鸟枪测序法。设茸上幻氢谐牲博倪搁立当攻良梦渣戒便运络恃羞凑羌寡嗽炊哇缮劫昌耀DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学
37、学学学院院C.基因组测序基因组测序u鸟枪法测序的缺点n随着所测基因组总量增大，所需测序的片段大量增加，造成重复测定，也易丢失某些序列，且数据处理分析工作量大。n高等真核生物（如人类）基因组中有大量重复序列，导致判断失误。u引物步移策略n将待测DNA片断克隆在质粒载体上，利用引物步移延伸，从DNA片断的一端开始逐步进行序列测定，直至另一端为止。n克服了鸟枪法的盲目性，并省去亚克隆制备步骤，也减轻了数据分析工作量。n但由于测定下一段序列前要预先知道上游序列的碱基顺序，才能合成适当的引物进行测序。7/31/2024南京农业大学 生命科学学院40物吟彰乏吠戴诽侧炉秉夏要秩惩打诉赦踊肃爵杰捷达辣苦钓蒸寂
38、珠昭汇掷DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院序列分析的自序列分析的自动动化化玉闭密脑幌遣苹趾关遍另崖犬肘肩戎唉氨逆管掂获耪绚齐糕般抱斑绽祟挂DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院DNA杂交测序杂交测序原理原理樱堆红臀狡设凝笑槛敌碰啪傍娥削志凌盅烤午卞聚澈牛音拌随作民美甚巳DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院辆借凹省镀马器圭楷遵猿舍牺庇腥疮兵烽贞罢埂腔槐勒社盅雨母受注涵锋DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子
39、大学学生命科生命科学学学学院院杂交的检测杂交的检测唤羡退腺词缩锹蕾俏驭沦焊励淳稀缉旭作快斜致浪篡式蛊灵弓横惨疙轿歇DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院杂交测序的应用杂交测序的应用q检测单碱基的变化检测单碱基的变化q序列比较分析序列比较分析q基因的表达状况基因的表达状况q验证其他测序验证其他测序底虫旧搁叔传冯峨红称朴亦蔷镇取淹啪佳坯侦愤诚隘酶壳庞狼刨糖单牧哆DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院nDNA芯片测序 基本原理基本原理 将各种排列顺序的寡核苷酸点播在芯片上将各种排列顺序的寡核苷
40、酸点播在芯片上, 每个点播的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定每个点播的寡核苷酸在排列的方阵中都有指定的位置的位置.待检测的待检测的DNA分子与芯片温浴分子与芯片温浴,凡是能凡是能杂交的寡核苷酸都会在确定位置发出信号杂交的寡核苷酸都会在确定位置发出信号,然后然后根据获取的信息将寡核苷酸的顺序进行对比组根据获取的信息将寡核苷酸的顺序进行对比组装装,拼接成完全的拼接成完全的DNA顺序顺序.憎讳百贪养喝穗追鞋敬廉卵井吾擅煎棉愁残坑厕摔撩胚垮茧馏块麻倔癣磐DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院利用基因芯片进行杂交测序的原理梢栅坍肪晚惦氯楚醛货残毁航炯笛
41、甩吹丽佬崭琵糙唾激四昏蛙垃估稳硝洞DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院序列的组装序列的组装随机测序与序列组装随机测序与序列组装 随机测序也称随机测序也称”鸟枪法鸟枪法”. 序列组装原理序列组装原理:直接从已测序的小片段中寻找彼此重叠的测直接从已测序的小片段中寻找彼此重叠的测序克隆序克隆,然后依次向两侧邻接的序列延伸然后依次向两侧邻接的序列延伸. 优点优点:不需预先了解任何基因组的情况不需预先了解任何基因组的情况.ABCABCABCABC小片段测序小片段测序计算机拼装计算机拼装胆矢氨篇单晶拎肄捉乳锅较谢狮鸵螺旭眠咋靶胁柔焕嗽毛撂磺殖筒伶南沮
42、DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院 未来的测序技术主要包括：u质谱法质谱法(mass spectrometry) ；u杂交测序法杂交测序法(seguencing by hybridization,SBH)；u单分子测序法单分子测序法(single-molecule seguencing) ；u扫描隧道显微镜扫描隧道显微镜(atomic probe microscopy） ；u超薄水平凝胶电泳技术超薄水平凝胶电泳技术(Horizontal Ultrathin Gel Electropho resis,HUGE) ；u毛细管电泳法毛细管电泳
43、法(capillary gel electrophoresis,CE ) ；u芯片技术等。芯片技术等。 倾贺烦网吉枝驾竿痊融础厩蛹早然敖孝持畅净肯恫瘤营贮蹬隅淖金条稽饥DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院“测序测序”思考回答问题思考回答问题1、Sanger双脱氧链终止法原理是什么双脱氧链终止法原理是什么2、使用、使用M13mp载体系列的优点有哪些载体系列的优点有哪些3、Maxam Gilbert化学修饰法的原理是什么化学修饰法的原理是什么4、DNA杂交测序原理是什么杂交测序原理是什么5、什么是寡核苷酸矩阵芯片、什么是寡核苷酸矩阵芯片6、杂交测序有什么应用、杂交测序有什么应用返回第二章虞企密毫一个撩噬朽贸陆箔香蝎硝火蒙扰芹捂党爽港读武癸尹肛粕抽询汽DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院Your Company Slogan升鸵襄遇比色封爬忱所穷奏粥履租久侄申醋乳嚼汀外宝填辨淘杨注篇貉跃DNA体外合成与序列测定DNA体外合成与序列测定石河子大石河子大学学生命科生命科学学学学院院
