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1、分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术核酸扩增技术核酸扩增技术温州医学院温州医学院检验医学院、生命科学学院检验医学院、生命科学学院SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术主要内容第一节第一节聚合酶链反应技术聚合酶链反应技术第二节第二节荧光定量荧光定量PCR技术技术第三节第三节其他核酸扩增技术其他核酸扩增技术第四节第四节临床基因扩增实验室的管理与质量控制临床基因扩增实验室的管理与质量控制SchoolofLaboratoryMedicine,
2、WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术第一节第一节聚合酶链反应技术聚合酶链反应技术polymerasechainreaction,PCR一、一、PCR技术发展简史技术发展简史二、二、PCR技术原理技术原理三、三、PCR反应体系、条件及其优化反应体系、条件及其优化四、扩增产物检测及分析四、扩增产物检测及分析五、五、PCR常见问题与原因分析常见问题与原因分析六、六、PCR衍生技术衍生技术SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块
3、8核酸扩增技术核酸扩增技术PCR技术发展简史技术发展简史Korana于于1971年最早提出核酸年最早提出核酸体外扩增的设想。体外扩增的设想。1985年年Mullis等发明了具有划等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应，使时代意义的聚合酶链反应，使用的用的DNA聚合酶是聚合酶是Klenow片段。片段。(1993年诺贝尔化学奖获得者年诺贝尔化学奖获得者)SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术PCR技术发展简史技术发展简史1988年初，年初，Keohanog改用改用T4DNA
4、聚合酶进行聚合酶进行PCR。1988年年Saiki发现发现TaqDNA聚合酶，从此聚合酶，从此PCR技术得以技术得以广泛应用。广泛应用。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术基基本本原原理理N=N0(1+E)cSchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术PCR反应体系、条件及其优化反应体系、条件及其优化PCR反应体系反应体系模板（模板（templa
5、te）引物（引物（primers）DNA聚合酶聚合酶(DNApolymerase)dNTPPCR缓冲液（缓冲液（PCRbuffer）PCR反应条件反应条件变性变性退火退火延伸延伸循环循环SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术DNARNA：总：总RNA、mRNA、tRNA、rRNA、病毒病毒RNA基因组DNA质粒DNA模板（模板（template）SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学
6、检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术引物（引物（primers)引物是人工合成的两段引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的物与感兴趣区域一端的一条一条DNA模板链互补，模板链互补，另一个引物与感兴趣区另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条域另一端的另一条DNA模板链互补。模板链互补。3355SenseprimerAntisenseprimerSchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术引物引物的重要性的重要性在整个在整个PCR体
7、系中体系中,引物占有十分重要的引物占有十分重要的地位。地位。PCR的特异性要求引物与靶的特异性要求引物与靶DNA特异结合，不与其他非目的特异结合，不与其他非目的DNA结合，结合，PCR的灵敏性要求的灵敏性要求DNA聚合酶能对引物聚合酶能对引物进行有效的延伸，可见引物设计好坏与进行有效的延伸，可见引物设计好坏与PCR结果密切相关。结果密切相关。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术引物设计总原则引物设计总原则引物与模板的序列要紧密互补引物与模板的序列要紧密互补引物与引物
8、之间避免形成稳定的二聚体或引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构发夹结构引物不能在模板的非目的位点引发引物不能在模板的非目的位点引发DNA DNA 聚聚合反应合反应( (即错配即错配) )。 SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术引物设计一般原则引物设计一般原则引物长度引物长度碱基分布的均衡性碱基分布的均衡性Tm值值引物二级结构引物二级结构引物引物3端端引物引物5端端引物的内部稳定性引物的内部稳定性引物的保守性与特异性引物的保守性与特异性扩增区域的二级结构扩增区
9、域的二级结构SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术引物长度引物长度一般为一般为15-30个核苷酸，个核苷酸，常用的是常用的是18-24 18-24 bpbp。在做长片段PCR或做某些特殊的PCR时应使用较长的引物，但最多不超过50个核苷酸。引物过短会引起错配现象，一般来说引物长度大于16bp是必要的（不容易引起错配）。例如：一个长度为12bp的引物在人类基因组上存在200个潜在的退火位点(3x109/412=200).而一个长度为20bp的引物在人基因组上存在的退火位
10、点只有1/400个.较长的引物（28-35bp)一般是用来区分同源性较高的模板序列或者使用于产生一些突变位点SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术碱基分布的均衡性碱基分布的均衡性GC含量一般含量一般40-60%，推荐推荐45-55%45-55%或或50-60%50-60%。上下游引物的上下游引物的GCGC含量不能相差太大。含量不能相差太大。GC含量太低导致引物含量太低导致引物Tm值较低，使用较低的退火值较低，使用较低的退火温度不利于提高温度不利于提高PCR的特异性的特
11、异性GC含量太高也易于引发非特异扩增。含量太高也易于引发非特异扩增。同一碱基连续出现不应超过同一碱基连续出现不应超过5个个SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术引物引物Tm值值一般要求：一般要求：55-65。计算：计算：对于低于对于低于20个碱基的引物，个碱基的引物，Tm值可根据值可根据Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略估算来粗略估算对于较长引物，对于较长引物，Tm值则需要考虑热动力学值则需要考虑热动力学参数，从参数，从“最近邻位最近邻位”的计算方式得到，这的计算
12、方式得到，这也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。也是现有的引物设计软件最常用的计算方式。Tm=H/(S+R*ln(C/4)+16.6log(K+/(1+0.7K+)-273.15SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术引物二级结构引物二级结构引物二聚体引物二聚体尽可能避免两个引物分子之间尽可能避免两个引物分子之间3端有有较多端有有较多碱基互补碱基互补发夹结构发夹结构尤其是要避免引物尤其是要避免引物3端形成发夹结构，否则端形成发夹结构，否则将严重影响将严重影响DNA聚
13、合酶的延伸。聚合酶的延伸。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术引物引物3端端引物的延伸从3端开始，因此3端的几个碱基与模板DNA均需严格配对严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸，甚至导致PCR扩增完全失败。考虑到密码子的简并性，引物引物3端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对端最后一个碱基最好不与密码子第三个碱基配对。引物3端不不要出现要出现3个以上的连续碱基个以上的连续碱基，如GGG或CCC，否则会使错误引发机率增加。引物3端的末位碱基对Taq酶
14、的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基末位碱基为为A的错配效率明显高于其他的错配效率明显高于其他3个碱基个碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱基A。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术引物引物5端端引物5端可以有与模板DNA不配对碱基，在5端引入一段非模板依赖性序列。5端加上限制性核酸内切酶位点序列限制性核酸内切酶位点序列（酶切位点5端加上适当数量的保护碱基）。5端的某一位点修改某个碱基，人为地在产物中引入该位点的点突变点
15、突变以作研究。5端标记标记放射性元素或非放射性物质（如生物素、地高辛等）。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术引物的保守性与特异性引物的保守性与特异性保守性：通用引物保守性：通用引物检测同一类病原微生检测同一类病原微生物尽可能多的型别物尽可能多的型别特异性：避免非特异性扩增特异性：避免非特异性扩增SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术扩增区
16、域的二级结构扩增区域的二级结构模板模板DNA的某些区域具有高度复杂的二级结构，在的某些区域具有高度复杂的二级结构，在选择引物时，应使扩增区域尽可能避开这些区域。选择引物时，应使扩增区域尽可能避开这些区域。扩增区域的自由能（扩增区域的自由能（G。）小于小于58.61kJ/mol引物引物Tm值与值与PCR产物产物Tm值相差一般不超过值相差一般不超过30Tmproduct=81.5+16.6log(K+/(1+0.7K+)+0.41(%G+%C)-500/length(primerpremier5.0)lTmproduct=81.5+16.6(log10(Na+)+0.41(%G+%C)-600/l
17、ength(primer3)SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术引物与引物与PCR引物浓度：一般为引物浓度：一般为0.1-0.5umol/L引物浓度引物浓度(uM)=nOD33/（A312C288G328T303-61）/VH2OVH2O(单位：单位：L)退火温度退火温度最适退火温度（最适退火温度（TaOpt）=0.3(Tmofprimer)+0.7(Tmofproduct)25一般采用较引物一般采用较引物Tm值低值低5作为作为PCR退火温度。退火温度。School
18、ofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术引物设计软件PrimerPremier5.0OligoPrimerexpressprimer3MethPrimerSchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术DNA聚合酶聚合酶(DNApolymerase)特性：特性：热热稳稳定定性性:92.5、95、97.5时时，半半衰衰期期分分别别为为130min、40min、5-6m
19、in延伸效率延伸效率:75-80时，时，150个核苷酸个核苷酸/s校校正正功功能能:TaqDNA聚聚合合酶酶没没有有3-5外外切切酶酶活活性性，Vent、pfu等具有等具有3-5外切酶活性外切酶活性SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术dNTPdNTP：包括包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP。量：量：20-200umol/LdNTP会络合会络合Mg2+，当，当PCR需要较高浓度的需要较高浓度的dNTP时，时，应在反应体系中适当增加应在反应体系中适当增加Mg2+
20、浓度。浓度。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术PCR缓冲液（缓冲液（PCRbuffer）一般组成：一般组成：50mMKCl,10-50mMTris-Cl(室温室温PH8.3)，1.5mMMgCl2Mg2+浓度：浓度：附加成分：牛血清白蛋白、明胶、非离子去污附加成分：牛血清白蛋白、明胶、非离子去污剂（如剂（如Tween20，浓度浓度0.05%）二甲亚砜）二甲亚砜（DMSO）SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalColleg
21、e分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术PCR一般方案一般方案反应组成反应组成50ulPCR反应体系的组成：反应体系的组成：样品样品DNA0.11ug；正、负链引物（正、负链引物（25umol/L）各）各1.0ul；脱氧核苷三磷酸（脱氧核苷三磷酸（dNTP各各2.5mmol/L）4.0ul10PCR缓冲液缓冲液5.0ul；MgCl2（25mmol/L）3.0ul；TaqDNA聚合酶聚合酶12.5u；蒸馏的去离子水补至蒸馏的去离子水补至50ul，短暂离心混匀。，短暂离心混匀。阳性对照、空白对阳性对照、空白对照分别以阳性模板照分别以阳性模板DNA、蒸馏的去离子水取代
22、样品、蒸馏的去离子水取代样品DNA。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术PCR94,300S94,60S3055,60S72,60S72,5-10min（举例）（举例）（举例）（举例）PCRPCR一般方案一般方案热循环热循环SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术PCR反应体系、条件的优化反应体系、条件的优化三磷酸脱氧核苷酸三磷酸脱氧核苷酸耐
23、热耐热DNA聚合酶聚合酶缓冲液缓冲液模板核酸模板核酸引物引物Mg2+变性温度与时间变性温度与时间复性温度与时间复性温度与时间延伸温度与时间延伸温度与时间循环数和扩增效率循环数和扩增效率降落降落PCR(TouchdownPCR)热启动热启动PCR（hotstartPCR）SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术降落降落PCR(TouchdownPCR)根根据据引引物物Tm值值，选选定定一一个个退退火火温温度度范范围围（跨跨越越10-20的的温温度度范范围围，引引物物Tm值
24、值在在这这个个范范围围之之内内）。在在设设置置循循环环参参数数时时，让让退退火火温温度度从从选选定定范范围围的的最最高高温温度度开开始始，逐逐步步降降低低退退火火温温度度（每每次次降降低低1-5），最最后后结结束束在在选选定定范范围围的的最最低低温温度度。在在每每一一个个退退火火温温度度上循环上循环2-5次。次。举举例例：如如果果一一对对引引物物的的Tm值值为为60，可可设设置置退退火火温温度度从从63降降低低到到48，每每次次降降低低1，每每个个退退火火温温度度循循环环两两个个周周期期，最最后后在在48退火温度下做退火温度下做15个循环。个循环。SchoolofLaboratoryMedic
25、ine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术热启动热启动PCR（hotstartPCR）PCR反应体系中先反应体系中先不加不加TaqDNA聚合酶，等聚合酶，等PCR扩增仪的温度上扩增仪的温度上升到升到80以后再加以后再加TaqDNA聚合酶。聚合酶。将石蜡珠在将石蜡珠在Ependorf管中管中PCR反应液上面融化并凝固，在石蜡层反应液上面融化并凝固，在石蜡层上面加上上面加上TaqDNA聚合酶。在温度上升到变性温度时，石蜡融化，聚合酶。在温度上升到变性温度时，石蜡融化，TaqDNA聚合酶进入反应体系，通过对流作用而混匀。聚
26、合酶进入反应体系，通过对流作用而混匀。在在PCR反应液中加入反应液中加入TaqDNA聚合酶的单克隆抗体，再加入聚合酶的单克隆抗体，再加入TaqDNA聚合酶，在温度上升到将此抗体变性灭活前，抗体中和聚合酶，在温度上升到将此抗体变性灭活前，抗体中和TaqDNA聚合酶活性，聚合酶活性，TaqDNA聚合酶对引物无法进行延伸。待温度聚合酶对引物无法进行延伸。待温度上升到足够高时，抗体失活，扩增反应开始。上升到足够高时，抗体失活，扩增反应开始。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技
27、术扩增产物的检测及分析扩增产物的检测及分析凝胶电泳：凝胶电泳：琼脂糖凝胶电泳法琼脂糖凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法聚丙烯酰胺凝胶电泳法PCR-限制性片段长度多态性分析法（限制性片段长度多态性分析法（PCR-RFLP）单链构型多态性分析法（单链构型多态性分析法（PCR-SSCP）核酸探针杂交法核酸探针杂交法PCR产物测序产物测序SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳制胶制胶加样加样电泳电泳紫外光检测紫外光检测SchoolofLaborator
28、yMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术特点：特点：分分辨辨力力高高，长长度度仅仅相相差差1bp的的DNA分分子子即即可可分开；分开；上样量远大于琼脂糖凝胶；上样量远大于琼脂糖凝胶；回收的回收的DNA纯度高；纯度高；采采用用银银染染色色DNA或或RNA，灵灵敏敏度度高高，比比琼琼脂脂糖糖凝凝胶胶电电泳泳中中EB染染色色法法高高2-5倍倍，而而且且避避免免EB易退色的弱点。易退色的弱点。用途：用途：PCR扩增指纹图、多重扩增指纹图、多重PCR。聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳SchoolofLabor
29、atoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术PCR-RFLP(restrictionfragmentlengthpolymorphism)据据目目的的基基因因序序列列可可查查出出所所包包含含的的酶酶切切位位点点，用用相相应应的的限限制制性性核核酸酸内内切切酶酶消消化化PCR扩扩增增产产物物，然然后后进进行行电电泳泳，观观察察消消化化片片段段的的大大小小是是否否与与序序列资料相符。列资料相符。用途：用途：传染病病原体基因分型传染病病原体基因分型人类基因的变异性研究。人类基因的变异性研究。Schoolo
30、fLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术单链构型多态性分析法单链构型多态性分析法（PCR-SingleStrandConformationPolymorphism,PCR-SSCP）将将PCR产物双链产物双链DNA（dsDNA）变性为单链）变性为单链DNA（ssDNA），加样于变性聚丙烯酰胺凝胶进），加样于变性聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，由于行电泳，由于DNA分子在凝胶中的电泳迁移率与分子在凝胶中的电泳迁移率与其分子量和空间结构有关，而空间结构又与其分子量和空间结构有关，而空间结构又与s
31、sDNA序列有关。因此，电泳结束后，序列有关。因此，电泳结束后，ssDNA带带位置的差异即可反映出位置的差异即可反映出PCR产物序列的差异。产物序列的差异。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术核酸探针杂交法核酸探针杂交法点杂交点杂交反向点杂交反向点杂交微孔板杂交微孔板杂交荧光探针杂交法荧光探针杂交法SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术点杂
32、交（点杂交（dotblot）原原理理：将将扩扩增增产产物物变变性性后后直直接接点点在在尼尼龙龙膜膜或或硝硝酸酸纤纤维维素素膜膜上上，再再用用放放射射性性或或非非放放射射性性标标记记物物标标记记的的寡寡核核苷苷酸酸探探针与之杂交。针与之杂交。探针：探针：放放射射性性同同位位素素标标记记探探针针检检测测的的敏敏感感、特特异异，具具有有不不稳稳定定性性和和放射性危害。放射性危害。非非放放射射性性物物质质（如如生生物物素素、地地高高辛辛、荧荧光光素素等等）标标记记的的探探针针稳定性高、使用安全、检测速度快稳定性高、使用安全、检测速度快用途：主要用于用途：主要用于PCR产物特异性鉴定及变异分析。产物特异
33、性鉴定及变异分析。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术反向点杂交反向点杂交(reversedotblot)原原理理：使使用用带带有有标标记记物物的的引引物物进进行行PCR扩扩增增，然然后后将将扩扩增增产产物物变变性性。将将不不同同的的寡寡核核酸酸探探针针固固定定在在尼尼龙龙膜膜上上，用用变性的变性的PCR产物与之杂交。产物与之杂交。探针：严格设计，具有相同的杂交反应条件。探针：严格设计，具有相同的杂交反应条件。用用途途：反反向向点点杂杂交交特特别别适适用用于于遗遗传
34、传性性疾疾病病多多个个位位点点的的点点突变分析。突变分析。结果分析：结果分析：正常纯合子正常纯合子突变纯合子突变纯合子杂合子杂合子SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术微孔板杂交微孔板杂交(microplatehybridization)夹夹心心杂杂交交SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术荧光探针杂交法荧光探针杂交法目前临床上常用荧光探针法
35、来检测目前临床上常用荧光探针法来检测PCR产产物，主要的方法有物，主要的方法有TaqMan技术、分子信标技术、分子信标技术、复合探针法等。技术、复合探针法等。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术PCR产物测序产物测序对对PCR产产物物进进行行测测序序是是检检测测PCR产产物物特特异异性性最最可可靠靠的的方方法法，可可将将PCR产产物物克克隆隆到到载载体体上上进进行行测测序序，也也可可对对直直接接PCR产产物进行测序。物进行测序。SchoolofLaboratoryM
36、edicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术常见问题原因分析及处理常见问题原因分析及处理假阳性假阳性非特异性非特异性PCR产物产物假阴性假阴性引物二聚体引物二聚体SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术假阳性假阳性PCR产物是最主要的污染源。产物是最主要的污染源。含有靶含有靶DNA序列的质粒的污染。序列的质粒的污染。阳性对照的污染。阳性对照的污染。标本之间的交叉污染。标本之间的交叉污染。
37、Taq聚合酶中带有细菌聚合酶中带有细菌DNA，当，当PCR扩增片段为保守的扩增片段为保守的rRNA序列时，易造成假阳性。序列时，易造成假阳性。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术怎么可能全家人都得了性病怎么可能全家人都得了性病?何某，女，何某，女，46岁，某部队卫生所护士，离婚岁，某部队卫生所护士，离婚10年，与一男友交往年，与一男友交往5年。她近来忽然感到阴部瘙痒，白带有异味，想到自己有非婚年。她近来忽然感到阴部瘙痒，白带有异味，想到自己有非婚性行为，怕万一得性病
38、被人知道，便悄悄到郊区一个小诊所去看性行为，怕万一得性病被人知道，便悄悄到郊区一个小诊所去看病。结果被告知是病。结果被告知是淋病淋病，用了许多药，未见明显好转。她通过，用了许多药，未见明显好转。她通过查书感到查书感到问题严重问题严重”，担心全家都会传染，尤其是正读初中的，担心全家都会传染，尤其是正读初中的女儿被传染上怎么办？为了孩子，顾不上面子了。她不仅带自己女儿被传染上怎么办？为了孩子，顾不上面子了。她不仅带自己的女儿、的女儿、70岁老母到医院检查，还动员最近与其同居一处的妹妹、岁老母到医院检查，还动员最近与其同居一处的妹妹、妹夫及妹夫及14岁的外甥女都到医院检查。医师给他们用最先进的岁的外
39、甥女都到医院检查。医师给他们用最先进的PCR”检测，结果检测，结果6个人都是个人都是淋球菌感染淋球菌感染”！SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术非特异性非特异性PCR产物产物引引物物特特异异性性不不高高，引引物物用用量量过过多多，应应调调换换引引物物或或降降低低引引物物用量。用量。TaqDNA聚聚合合酶酶质质量量不不好好或或用用量量偏偏高高，应应降降低低酶酶量量或或使使用用质量较好的酶。质量较好的酶。Mg2+浓度过高，可适当调节浓度过高，可适当调节Mg2+浓度。浓度
40、。退退火火温温度度过过低低，退退火火及及延延伸伸时时间间偏偏长长，可可提提高高退退火火温温度度，减少退火及延伸时间，或者采用二温循环减少退火及延伸时间，或者采用二温循环PCR进行扩增。进行扩增。热循环次数过多，适当增加模板用量，减少循环次数热循环次数过多，适当增加模板用量，减少循环次数。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术假阴性假阴性引物设计是否合理引物设计是否合理标本中是否有标本中是否有Taq酶抑制剂，酶抑制剂，Taq酶是否失活。酶是否失活。反反应应体体系系中中有
41、有无无蛋蛋白白酶酶或或核核酸酸酶酶降降解解DNA聚聚合合酶酶或或模模板板DNA，可在可在95以上加热以上加热10分钟使其灭活。分钟使其灭活。反反应应体体系系中中是是否否有有较较难难去去除除的的蛋蛋白白质质抑抑制制PCR系系统统，用用蛋蛋白白酶酶K重新处理常可获预期结果。重新处理常可获预期结果。循循环环温温度度，特特别别是是解解链链温温度度是是否否准准确确，退退火火温温度度是是否否过过高高。有有些些PCR仪仪指指示示温温度度与与实实际际温温度度不不符符，过过高高则则酶酶在在前前几几个个循循环环中中迅迅速速失活，过低则模板变性不彻底失活，过低则模板变性不彻底检测检测PCR产物方法灵敏度不够，如琼脂
42、糖凝胶电泳法敏感性较低。产物方法灵敏度不够，如琼脂糖凝胶电泳法敏感性较低。靶序列发生突变、缺失等靶序列发生突变、缺失等SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术引物二聚体引物二聚体v两两个个相相同同的的或或不不同同的的引引物物分分子子之之间间有有较较多多的的碱碱基基配配对对，特别是引物特别是引物3端有互补区。端有互补区。v引物模板比例太高，可增加模板用量。引物模板比例太高，可增加模板用量。v退火温度过低。退火温度过低。v热循环次数过多。热循环次数过多。SchoolofLa
43、boratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术PCR污染及预防措施污染及预防措施分开操作区域。分开操作区域。耐高压的试剂及器材应高温高压灭菌。耐高压的试剂及器材应高温高压灭菌。使用一次性使用一次性Tip头、头、Eppendorf管等。管等。小量分装试剂。小量分装试剂。样品制备应按无菌操作原则进行，避免样品间相互污染。样品制备应按无菌操作原则进行，避免样品间相互污染。操作者带手套操作，且应勤换手套。操作者带手套操作，且应勤换手套。使用尿嘧啶使用尿嘧啶-DNA-糖基化酶控制糖基化酶控制PCR产物交叉
44、污染。产物交叉污染。每次每次PCR操作都应设阳性及阴性对照操作都应设阳性及阴性对照。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术RNA酶的污染与预防酶的污染与预防去除外源去除外源RNase污染污染玻璃器皿常规洗净后，应用玻璃器皿常规洗净后，应用0.1%DEPC处理。处理。所有溶液应加所有溶液应加DEPC至至0.05%0.1%，室温处理过夜，室温处理过夜，然后高压处理。然后高压处理。操作者戴口罩和手套。操作者戴口罩和手套。材料器材使用灭菌一次性用品。材料器材使用灭菌一次性用品
45、。抑制内源性抑制内源性RNase的活性的活性使用低特异性使用低特异性RNase抑制物：如皂土、复抑制物：如皂土、复合硅酸盐、肝素、合硅酸盐、肝素、DEPC等。等。去除蛋白质物质：蛋白质变性剂、蛋白去除蛋白质物质：蛋白质变性剂、蛋白酶酶K、阴离子去污剂等，常与、阴离子去污剂等，常与RNA酶抑酶抑制物联合使用，以加强对制物联合使用，以加强对RNase活力的抑活力的抑制。制。RNase的特异性抑制剂：如的特异性抑制剂：如RNase阻抑蛋阻抑蛋白（白（RNasin）、氧钒核糖核苷复合物。）、氧钒核糖核苷复合物。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalColle
46、ge分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术PCR衍生技术衍生技术巢式巢式PCR（nestedPCR）逆转录逆转录PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR）多重多重PCR(multiplexPCR)重组重组PCR(recombinantPCR)锚定锚定PCR（anchoredPCR,A-PCR）不对称不对称PCR（asymmetricPCR）反向反向PCR（inversePCR）扩增长片段扩增长片段PCR（longPCR，long-distancePCR）免疫免疫PCR(immuno-PCR)定量定量PCRSchoolofLabora
47、toryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术巢式巢式PCR（nestedPCR）SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术逆转录逆转录PCR（reversetranscription-PCR，RT-PCR）逆转录酶逆转录酶AMV逆转录酶（最适温度为逆转录酶（最适温度为42）MoMLV逆转录酶（最适温度为逆转录酶（最适温度为37）逆转录引物逆转录引物随机引物；随机引物；Oligo(
48、dT)；特异性引物。特异性引物。one-stepRT-PCR：在同一体系中加入逆转录酶、逆转录：在同一体系中加入逆转录酶、逆转录引物、引物、TaqDNA聚合酶、聚合酶、PCR引物、引物、dNTP和缓冲液，直和缓冲液，直接以接以mRNA为模板进行逆转录和为模板进行逆转录和PCR扩增，称为一步法扩增，称为一步法RT-PCR。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术多重多重PCR(multiplexPCR)SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouM
49、edicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术重组重组PCR(recombinantPCR)SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术锚定锚定PCR（anchoredPCR,A-PCR）基本原理：抽提细胞总基本原理：抽提细胞总RNA或或mRNA，在逆转录酶，在逆转录酶作用下合成作用下合成cDNA，通过，通过DNA末端转移酶在末端转移酶在cDNA3端加上端加上poly(dG)尾。据此设计锚定引物尾。据此设计锚定引物poly(
50、dC)，为，为提高扩增特异性，提高扩增特异性，poly(dC)在十二聚以上，锚定引物在十二聚以上，锚定引物5端可加上某些限制性内切酶识别序列或其它序列信端可加上某些限制性内切酶识别序列或其它序列信息。根据已知的息。根据已知的3端序列设计基因特异性引物，与锚端序列设计基因特异性引物，与锚定引物一起进行定引物一起进行PCR扩增。扩增。用途：检测用途：检测T细胞受体和免疫球蛋白基因的多态性。细胞受体和免疫球蛋白基因的多态性。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术不对称不对称
51、PCR（asymmetricPCR）基基本本原原理理：采采用用两两条条不不同同浓浓度度的的引引物物，即即非非限限制制引引物物(高高浓浓度度引引物物)与与限限制制性性引引物物(低低浓浓度度引引物物)，二二者者之之比比为为50-100：1。在在PCR最最初初10-15个个循循环环中中，扩扩增增产产物物主主要要是是双双链链DNA(dsDNA)；第第15个个循循环环以以后后，限限制制性性引引物物已已被被耗耗尽尽，非非限限制制性性引引物物介介导导的的PCR就就会产生大量的单链会产生大量的单链DNA(ssDNA)。关键：控制限制性引物的绝对量，需多次摸索优化两条引物的比关键：控制限制性引物的绝对量，需多次
52、摸索优化两条引物的比例。也有人先用等浓度的引物例。也有人先用等浓度的引物PCR扩增，制备双链扩增，制备双链DNA；然后以；然后以双链双链DNA为模板，再以其中的一条引物进行第二次为模板，再以其中的一条引物进行第二次PCR，制备单，制备单链链DNA。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术反向反向PCR（reversePCR）反向反向PCR用于快速扩增已知序列以外的未知用于快速扩增已知序列以外的未知DNA片段，从而对未知序进行分析研究。该法首先用片段，从而对未知序进行分析
53、研究。该法首先用已知序列和待扩增序列都没有切点的限制性核酸已知序列和待扩增序列都没有切点的限制性核酸内切酶将模板内切酶将模板DNA消化，再用连接酶使酶切产物消化，再用连接酶使酶切产物环化，使已知的和待扩增的未知序列都包含在环环化，使已知的和待扩增的未知序列都包含在环中。在已知序列内设计一对反向的引物，即可扩中。在已知序列内设计一对反向的引物，即可扩增已知序列以外的区域。增已知序列以外的区域。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术反向反向PCR已知序列PCR用途用途：未
54、知序列的研究未知序列的研究限制酶切点（限制酶切点（X）限制酶切点（限制酶切点（X）限制酶限制酶X酶切酶切连接连接未知序列未知序列SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术扩增长片段扩增长片段PCR（longPCR）模板完整性：应用琼脂糖包埋细胞抽提法模板模板完整性：应用琼脂糖包埋细胞抽提法模板DNA。引物：一般较长（引物：一般较长（22-35nt），），Tm值较大。值较大。DNA聚聚合合酶酶：长长片片段段PCR应应采采用用错错配配率率低低的的耐耐热热DNA聚聚合合酶酶：如
55、如AmpliTaq、rTth、HotTube、Vent、DeenVent、Pfu、rTma等。等。Vent、DeenVent、Pfu、rTma等聚合酶有等聚合酶有3-5外切酶活性。外切酶活性。PCR缓缓冲冲液液：增增加加Tris的的浓浓度度或或改改用用Tricine缓缓冲冲液液以以增增强强缓缓冲冲能能力力，并并使使缓缓冲冲液液pH适适度度升升高高。此此外外，加加入入适适量量的的甘甘油油、DMSO（二二甲甲亚亚砜砜）、明明胶胶、聚聚乙乙二二醇醇、Tween20等等物物质质，有有助助于模板变性和维持于模板变性和维持DNA聚合酶的稳定。聚合酶的稳定。热热循循环环：增增加加延延伸伸时时间间（一一般般1
56、kb/min），提提高高退退火火温温度度，同同时时采采用用热热启启动动。热热循循环环后后期期，适适当当增增加加延延伸伸时时间间，以以保保证证产产物物充充分分延伸。延伸。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术免疫免疫PCR(immuno-PCR)SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术原位原位PCR（insituPCR）直直接接法法：使使用用标标
57、记记（放放射射性性同同位位素素、生生物物素素、地地高高辛辛、荧荧光光素素等等）的的引引物物或或脱脱氧氧三三磷磷酸酸核核苷苷酸酸（如如dUTP）进进行行PCR扩扩增增，则则标标记记物物掺掺入入到到PCR产产物物中中。最最后后用用放放射射自自显显影影、免免疫疫组组化化或或荧荧光光法法检测检测PCR产物及其在细胞内位置。产物及其在细胞内位置。间间接接法法：先先进进行行细细胞胞内内DNA的的原原位位扩扩增增，然然后后用用标标记记的的核核酸酸探探针针进行原位杂交。进行原位杂交。原位逆转录原位逆转录PCR（insitureversetransciptionPCR）SchoolofLaboratoryMed
58、icine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术定量定量PCR概念：概念：通过对通过对PCR终产物的分析或终产物的分析或PCR过程的监测，对过程的监测，对PCR起始模板进行定量起始模板进行定量的技术的技术。N=N0(1+E)cSchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术定量定量PCR中扩增产物的检测方法中扩增产物的检测方法凝胶电泳：凝胶电泳：PCR-ELISA荧光荧光PCR法法由由于于荧荧光光PCR
59、可可使使用用现现代代化化仪仪器器对对PCR产产物物实实行行实实时时检检测测，很很容容易易保保证证扩扩增增在在指指数数增增长长期期内内进进行行，是是定定量量PCR扩增产物检测的一个发展方向。扩增产物检测的一个发展方向。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术第二节第二节荧光定量聚合酶链反应荧光定量聚合酶链反应（FluorescenceQuantitivePolymeraseChainReaction，FQ-PCR）一、荧光定量一、荧光定量PCR技术基本原理技术基本原理二、
60、荧光定量二、荧光定量PCR技术技术三、荧光定量三、荧光定量PCR测定的数据处理测定的数据处理四、实时荧光定量四、实时荧光定量PCR技术的应用技术的应用SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术荧光定量荧光定量PCR技术基本原理技术基本原理荧光扩增曲线图荧光扩增曲线图Ct值值标准定量曲线标准定量曲线SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术荧光扩增荧光
61、扩增曲线图曲线图荧光定量荧光定量PCR：通过对通过对PCR扩增反应中每一个循环产物扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。随荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。随着着PCR反应的进行反应的进行,PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每个循环收集一个荧光强度信号，通过荧光强度变化比例增加。每个循环收集一个荧光强度信号，通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线.SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedic
62、alCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术Ct值值N=N0(1+E)clogN=logN0+clog(1+e)SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术Ct值的重现性值的重现性PCR循环在到达循环在到达Ct值所在的循环数时，刚值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时极好
63、，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。值是恒定的。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术初始模板量的对数与初始模板量的对数与C(T)C(T)循环数之间循环数之间 呈线性关系呈线性关系标准定量曲线标准定量曲线荧光强度荧光强度-循环数曲线循环数曲线初始模板
64、量对数初始模板量对数-C(T)循环数标准曲线循环数标准曲线SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术荧光定量荧光定量PCR技术技术荧光染料法荧光染料法荧光标记探针荧光标记探针TaqMan荧光标记探针荧光标记探针molecularBeacon荧光标记探针荧光标记探针荧光标记杂交双探针荧光标记杂交双探针SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术荧光染料法
65、荧光染料法SYBR染料染料在在PCR反应体系中，加入过量反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，荧光染料，SYBR荧光染料特异性地掺入荧光染料特异性地掺入DNA双链后，发射双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。产物的增加完全同步。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术SYBR-GreenI5353SGExci
66、tationSGSGSGSGEmission双链荧光染料双链荧光染料SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术SYBR-GreenI5353SGSGSGSGSGExcitationEmissionSchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术溶解曲线分析溶解曲线分析（TmTm）特异性问题SchoolofLaboratoryMedicine,Wenzhou
67、MedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术TaqMan探针法探针法SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术遵循一般引物设计原则；遵循一般引物设计原则；引物之间的引物之间的Tm相差避免超过相差避免超过2；为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨为避免基因组的扩增，引物设计最好能跨两个外显子；两个外显子；TaqMan技术引物设计原则技术引物设计原则SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedi
68、calCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术TaqMan探针设计原则探针设计原则先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针；先选择好探针，然后设计引物使其尽可能的靠近探针；探针长度应在探针长度应在15-45bp（最好是（最好是20-30bp)，以保证结合特异性；，以保证结合特异性；探针的探针的DNA折叠和二级结构；尽量避开二级结构；折叠和二级结构；尽量避开二级结构；Tm值在值在65-70，通常比引物，通常比引物Tm值高值高5-10，GC含量在含量在40%70%；探针的探针的5端应避免使用端应避免使用G鸟嘌呤鸟嘌呤因为因为5G会有淬灭作用，而且即
69、使是被切会有淬灭作用，而且即使是被切割下来还会存在淬灭作用；割下来还会存在淬灭作用；整条探针中，碱基整条探针中，碱基C的含量要明显高于的含量要明显高于G的含量的含量G含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针；含量高会降低反应效率，这时就应选择配对的另一条链作为探针；为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在为确保引物探针的特异性，最好将设计好的序列在blast中核实一次，如果发中核实一次，如果发现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。现有非特异性互补区，建议重新设计引物探针。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子
70、生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术TaqManMGB探针设计探针设计尽量缩短尽量缩短TaqmanMGB探针，但探针长度不少于探针，但探针长度不少于13bp。尽量避免出现重复的碱基，尤其是尽量避免出现重复的碱基，尤其是G碱基，应避免碱基，应避免出现出现4个或个或4个以上的个以上的G重复出现。重复出现。原则上原则上MGB探针只要有一个碱基突变，探针只要有一个碱基突变，MGB探针探针就会检测到就会检测到(MGB探针将不会与目的片段杂交，不产探针将不会与目的片段杂交，不产生荧光信号生荧光信号)。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedi
71、calCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术分子信标技术分子信标技术工作原理工作原理发夹形的寡聚核苷酸探针发夹形的寡聚核苷酸探针内部淬灭的荧光团内部淬灭的荧光团Loop能和靶序列互补Stem是由互补序列组成SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术RQExcitationRQQRExcitationEmission分子信标技术分子信标技术SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalColl
72、ege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术Oligo 1: FluoresceinOligo 2: LC Red 640FRETProbesExcitationEmissionTransfer荧光能量传递荧光能量传递SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术复合探针法复合探针法SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技
73、术其他核酸扩增技术其他核酸扩增技术核酸序列依赖性扩增核酸序列依赖性扩增(Nucleicacidsequence-basedamplification，NASBA)连接酶链反应连接酶链反应(ligasechainreaction，LCR)分枝分枝DNA信号放大系统信号放大系统SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术核酸序列依赖性扩增核酸序列依赖性扩增SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学
74、检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术连接酶链反应连接酶链反应SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术分枝分枝DNA信号放大系统信号放大系统SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术第四节第四节临床基因扩增实验室的管理与质量控制临床基因扩增实验室的管理与质量控制一、临床基因扩增检验实验室的规范化设置一、临床基因扩增检验实验室的规范化设置二、操作
75、人员培训二、操作人员培训三、临床基因扩增检验实验室质量保证三、临床基因扩增检验实验室质量保证SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术临床基因扩增检验实验室的规范化设置临床基因扩增检验实验室的规范化设置SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术操作人员培训操作人员培训临床基因扩增检验实验室技术人员必须进临床基因扩增检验实验室技术人员必须进行上岗培训。
76、经过培训合格者，由培训单行上岗培训。经过培训合格者，由培训单位颁发合格证书，并将培训合格人员名单位颁发合格证书，并将培训合格人员名单报卫生部临检中心备案。获得培训合格证报卫生部临检中心备案。获得培训合格证书者方可从事临床基因扩增检验工作。书者方可从事临床基因扩增检验工作。SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术临床基因扩增检验实验室质量保证临床基因扩增检验实验室质量保证标本的采集标本的采集标本的预处理标本的预处理标本的运送标本的运送临床标本的接收临床标本的接收核酸的提取核酸的提取靶核酸的逆转录和扩增靶核酸的逆转录和扩增污染与预防污染与预防扩增产物的分析扩增产物的分析质量控制质量控制室内质量控制（室内质量控制（IQC）标本制备标本制备逆转录和扩增逆转录和扩增板上杂交和膜上斑点印迹杂交的质控板上杂交和膜上斑点印迹杂交的质控测定结果的评价与报告测定结果的评价与报告室间质量评价（室间质量评价（EQA）SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege分子生物学检验技术分子生物学检验技术模块模块8核酸扩增技术核酸扩增技术SchoolofLaboratoryMedicine,WenzhouMedicalCollege
