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1、重组蛋白药物包涵体表达、复性和分离纯化姓名：何云凤姓名：何云凤时间：时间：2016082720160827 2发酵液发酵液细胞分离细胞分离胞内产物胞内产物胞外产物胞外产物细胞破碎细胞破碎固液分离固液分离包涵体包涵体细胞碎片分离细胞碎片分离变性变性复性复性浓缩浓缩 初步分离初步分离 高度纯化高度纯化 制剂制剂 产品产品 基因工程制品分离纯化的一般流程基因工程制品分离纯化的一般流程 包含体的形成和性质包含体的形成和性质 在在在在大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌中表达的基因工程蛋白常常以中表达的基因工程蛋白常常以中表达的基因工程蛋白常常以中表达的基因工程蛋白常常以包涵体包涵体包涵体包涵体的形式的形式
2、的形式的形式沉积于细胞内，表现为沉积于细胞内，表现为沉积于细胞内，表现为沉积于细胞内，表现为无活性的不溶性聚集物无活性的不溶性聚集物无活性的不溶性聚集物无活性的不溶性聚集物包涵体：包涵体：外源目的基因在宿主系统中高水平表达时，因外源目的基因在宿主系统中高水平表达时，因各种原各种原因因导致基因表达产物的导致基因表达产物的一级结构（即氨基酸序列）虽然正一级结构（即氨基酸序列）虽然正确，而其高级结构是错误的确，而其高级结构是错误的，即：没有生物活性的包涵体。，即：没有生物活性的包涵体。包涵体直径约包涵体直径约0.5-1m0.5-1m，具有，具有很高的密度很高的密度（约（约1.3 mg/ml1.3 m
3、g/ml），），相差显微镜下有相差显微镜下有折光性折光性，呈，呈非水溶性非水溶性，只溶于高浓度变性只溶于高浓度变性剂如尿素、盐酸胍剂如尿素、盐酸胍等。等。 包涵体形成的几种可能性包涵体形成的几种可能性研究发现：研究发现：低表达时很少形成包涵体低表达时很少形成包涵体，表达量越高越易形成，表达量越高越易形成包涵体。包涵体。1）少量蛋白产生时是可溶的，少量蛋白产生时是可溶的，表达量过高表达量过高，积聚量超过其，积聚量超过其在细胞内溶解度时沉淀；在细胞内溶解度时沉淀；2）合成速度太快，以至于合成速度太快，以至于没有足够的时间没有足够的时间进行折叠，二硫进行折叠，二硫键不能正确配对；键不能正确配对；3）
4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。涵体沉淀。4）重组蛋白的氨基酸组成，）重组蛋白的氨基酸组成，一般说来含硫氨基酸越多、一般说来含硫氨基酸越多、Pro含量越高越容易形成包涵体。含量越高越容易形成包涵体。5）重组蛋白所处的环境：）重组蛋白所处的环境：发酵温度高时容易形成包涵体。发酵温度高时容易形成包涵体。包涵体形成：包涵体形成：AdvantagesAdvantages1、细菌的生长快速利于大规模生产。包涵体形式表达的蛋白、细菌的
5、生长快速利于大规模生产。包涵体形式表达的蛋白质浓度比较高，质浓度比较高，有时甚至可以达到细胞总蛋白含量的有时甚至可以达到细胞总蛋白含量的40%2、重组蛋白质以包涵体形式存在重组蛋白质以包涵体形式存在包埋了酶攻击的位点，可包埋了酶攻击的位点，可以最大限度地以最大限度地抵抗蛋白质酶的攻击抵抗蛋白质酶的攻击3、分离、分离比可溶蛋白质的分离方法比可溶蛋白质的分离方法简便简便，造价低，造价低，使用简单的，使用简单的离心或者过滤的手段就能使包涵体与宿主细胞的其他蛋白质成离心或者过滤的手段就能使包涵体与宿主细胞的其他蛋白质成分进行有效的分离分进行有效的分离4、有些表达的外源蛋白质有些表达的外源蛋白质对细胞有
6、毒性或者致死，对细胞有毒性或者致死，大量表达大量表达时会导致细胞的死亡，最终的细胞数量和产物相当低；而时会导致细胞的死亡，最终的细胞数量和产物相当低；而包涵包涵体形式的蛋白质因丧失了生物活性体形式的蛋白质因丧失了生物活性高效地表达高效地表达包涵体加工流程包涵体加工流程离离 心心去除细胞碎片（ 膜蛋白和脂类等）机械破碎法机械破碎法包涵体提取如何对包涵体蛋白进行高效体外复性以获得活性产品是生物工程产业化的一个难题细胞破碎就是细胞破碎就是采用物理、化学、酶或机采用物理、化学、酶或机械的方法，在一定程度上破坏细胞壁和械的方法，在一定程度上破坏细胞壁和细胞膜，设法使胞内产物最大程度地释细胞膜，设法使胞内
7、产物最大程度地释放到液相中。放到液相中。细胞破碎细胞破碎分分 类作用机理作用机理适适应性性物物理理破破碎碎高高压匀匀浆法法液体剪切作用液体剪切作用可达可达较高破碎率，高破碎率，可大可大规模操作模操作，不适，不适合合丝状菌和革状菌和革兰氏阳性菌氏阳性菌珠磨法珠磨法固体剪切作用固体剪切作用可达可达较高破碎率，高破碎率，可可较大大规模操作模操作，大，大分子目的分子目的产物易失活，物易失活，浆液分离困液分离困难超声破碎法超声破碎法液体剪切作用液体剪切作用对酵母菌效果酵母菌效果较差，破碎差，破碎过程升温程升温剧烈，烈，不适合大不适合大规模操作模操作渗透渗透压法法渗透渗透压剧烈改烈改变破碎率破碎率较低，常
8、与其他方法低，常与其他方法结合使用合使用反复反复冻融法融法反复反复冻结-融化融化破碎率破碎率较低，不适合低，不适合对冷冷冻敏感目的敏感目的产物物干燥法干燥法改改变细胞膜的渗透性胞膜的渗透性条件条件变化化剧烈，易引起大分子物烈，易引起大分子物质失活失活X-press法法固体剪切作用固体剪切作用破碎率高，活性保留率高，破碎率高，活性保留率高，对冷冷冻敏感敏感目的目的产物不适合物不适合化化学学破破碎碎酶酶溶法溶法酶酶分解作用分解作用具有高度具有高度专一性，条件温和，一性，条件温和，浆液易分液易分离，溶离，溶酶酶价格高，通用性差价格高，通用性差化学渗透法化学渗透法改改变细胞膜渗透性胞膜渗透性具一定具一
9、定选择性，性，浆液易分离，但液易分离，但释放率放率较低，通用性差低，通用性差常用破碎方法常用破碎方法（按细胞所受作用）（按细胞所受作用）包涵体的洗涤包涵体的洗涤l l细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密。l洗涤的重要性：洗涤的重要性：收集的沉淀中，除包涵体外，收集的沉淀中，除包涵体外，还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖还包括许多杂质，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分等，复性时会与目标蛋白一起复性形成杂交分子而聚集，给后步纯化带来困难。子而聚集，给后步纯化带来困
10、难。l洗涤剂：洗涤剂：温和的表面活性剂（温和的表面活性剂（Triton X-100）、）、低浓度的弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。低浓度的弱变性剂（如尿素）或脱氧胆酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂质类杂质。能溶解除去部分膜蛋白和脂质类杂质。l洗涤剂浓度洗涤剂浓度以以溶解杂质，不溶解包涵体中表达溶解杂质，不溶解包涵体中表达产物产物为原则。为原则。包涵体的溶解包涵体的溶解二硫键二硫键目的次级键次级键变性剂去污剂还原剂盐酸胍、尿素SDS、Triton 100巯基乙醇、DTT蛋白质的复性蛋白质的复性：包含体蛋白质包含体蛋白质溶解于溶解于变性剂溶液中，呈变性状态，变性剂溶液中，呈变性状态，所有的氢键、疏水
11、键全部被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结所有的氢键、疏水键全部被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏，当除去变性剂后，一部分蛋白质可以自动构和共价键不被破坏，当除去变性剂后，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程折叠过程称为称为蛋白质复性蛋白质复性。如何使包涵体的构型复原成正确状态？如何使包涵体的构型复原成正确状态？复性常用方法复性常用方法稀释稀释稀释稀释 透析透析透析透析 超滤超滤复性法复性法复性法复性法折叠促进剂协助复性法：折叠促进剂协助复性法：折叠促进剂协助复性法：折叠促进剂协助复性法：表面活性剂、表面活性剂、表面活性剂、表
12、面活性剂、PEGPEG、分子伴侣分子伴侣分子伴侣分子伴侣等等等等反相胶团复性法、双水相体系复性法反相胶团复性法、双水相体系复性法反相胶团复性法、双水相体系复性法反相胶团复性法、双水相体系复性法层析折叠复性（固相复性）：层析折叠复性（固相复性）：层析折叠复性（固相复性）：层析折叠复性（固相复性）：凝胶过滤层析（凝胶过滤层析（凝胶过滤层析（凝胶过滤层析（GFGF）、亲和）、亲和）、亲和）、亲和层析（层析（层析（层析（AFCAFC） 、离子交换层析（、离子交换层析（、离子交换层析（、离子交换层析（IECIEC） 、疏水层析、疏水层析、疏水层析、疏水层析（HICHIC）等）等）等）等复性复性 复性的成
13、功秘诀在于复性的成功秘诀在于复性的成功秘诀在于复性的成功秘诀在于促进主要途径抑制导致聚集体形成的竞争性途径促进主要途径抑制导致聚集体形成的竞争性途径促进主要途径抑制导致聚集体形成的竞争性途径促进主要途径抑制导致聚集体形成的竞争性途径，通常需要仔细优化大量参数：蛋白浓度、温度、时间、通常需要仔细优化大量参数：蛋白浓度、温度、时间、通常需要仔细优化大量参数：蛋白浓度、温度、时间、通常需要仔细优化大量参数：蛋白浓度、温度、时间、pHpH、缓冲添加、缓冲添加、缓冲添加、缓冲添加剂等等剂等等剂等等剂等等色谱过程及其分类色谱过程及其分类色谱法是利用混合物中各组分色谱法是利用混合物中各组分物理化学物理化学性
14、质的差异（如吸附力、分子性质的差异（如吸附力、分子形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为形状及大小、分子亲和力、分配系数等），使各组分在两相（一相为固定的，称为固定的，称为固定相固定相；另一相流过固定相，称为；另一相流过固定相，称为流动相流动相）中的分布程）中的分布程度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的度不同，从而使各组分以不同的速度移动而达到分离的目的。层析填料的选择层析填料的选择凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱凝胶过滤色谱(Gel Filtration Chromatography GFC)又称为分子排阻色谱(Size Exclusion Chromatogr
15、aphy SEC），凝胶色谱主要用于脱盐、分级分离及分子量的测定。 生物体内许多大分子化合物具有与其结构相对应的专一分子可生物体内许多大分子化合物具有与其结构相对应的专一分子可逆结合的特性逆结合的特性( (亲和力亲和力) )。 把与目的产物具有把与目的产物具有特异亲和力特异亲和力的生物分的生物分子固定化后作为固定相，则当含有目的产物的混合物子固定化后作为固定相，则当含有目的产物的混合物( (流动相流动相) )流经流经此固定相时，即可把目的产物从混合物中分离出来此固定相时，即可把目的产物从混合物中分离出来。亲和色谱亲和色谱( (Affinity ChromatographyAffinity Ch
16、romatography，AFC)AFC)亲和色谱亲和色谱( (Affinity ChromatographyAffinity Chromatography，AFC)AFC) 离子交换色谱是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，由于混合物中不同溶质对交换剂具有不同的结合力而将其分离。 该法适合于离子和在溶剂中发生电离物质的分离。 离子交换色谱广泛用于生物大分子分离纯化，特别是在蛋白质、多肽、核酸等生物物质的分离纯化。 离子交换色谱离子交换色谱(Ion Exchange Chromatography，IEC)离子交换色谱离子交换色谱(Ion Exchange
17、 Chromatography，IEC)疏水色谱（疏水色谱（HIC）疏水相互作用色谱疏水相互作用色谱（Hydrophobic Interaction Chromatography HIC）原理是在高浓）原理是在高浓度的盐溶液中，蛋白度的盐溶液中，蛋白质会被吸附到疏水色质会被吸附到疏水色谱填料的疏水基团上，谱填料的疏水基团上，当逐渐降低盐浓度时，当逐渐降低盐浓度时，它们会它们会按疏水性的强按疏水性的强弱先后被洗脱弱先后被洗脱。疏水色谱（疏水色谱（HIC）推荐书籍、资料推荐书籍、资料1.Insoluble Proteins Methods and Protocols2.GE 重组蛋白纯化手册25 以上有不当之处，请大家给与批评指正，以上有不当之处，请大家给与批评指正，谢谢大家！谢谢大家！
