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1、1第第6 6章章 酶工程制药酶工程制药2第一节第一节 概述概述一、一、酶工程酶工程简介（简介（Enzyme EngineeringEnzyme Engineering） 酶工程是酶工程是酶学酶学和和工程学工程学相互渗透结合、相互渗透结合、发展而形成的一门新的技术学科。它是从发展而形成的一门新的技术学科。它是从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异催应用的目的出发研究酶、应用酶的特异催化性能，并通过工程化将相应原料转化成化性能，并通过工程化将相应原料转化成有用物质的技术。有用物质的技术。3二、现代酶工程的主要内容：二、现代酶工程的主要内容：1.1.酶的分离纯化、大批量生产及新酶和酶的应酶的分离纯化、
2、大批量生产及新酶和酶的应用开发；用开发；2.2.酶和细胞的酶和细胞的固定化固定化及及酶反应器酶反应器的研究，包括的研究，包括酶传感器、反应检测；酶传感器、反应检测；3.3.酶生产中酶生产中基因工程技术基因工程技术的应用及的应用及遗传修饰酶遗传修饰酶的研究；的研究；4.4.酶的分子酶的分子改造改造和化学和化学修饰修饰，结构与功能的研，结构与功能的研究；究；45.5.有机相中酶反应有机相中酶反应的研究；的研究；6.6.酶的酶的抑制剂、激活剂抑制剂、激活剂的开发与应用研究；的开发与应用研究；7.7.抗体酶抗体酶、核酸酶核酸酶的研究；的研究；8.8.模拟酶、合成酶模拟酶、合成酶及酶分子的人工设计、合成
3、研及酶分子的人工设计、合成研究。究。5三、酶的来源三、酶的来源 酶的来源酶的来源：酶的生产目前多数直接从生物体中提：酶的生产目前多数直接从生物体中提取分离。非常少的是合成取分离。非常少的是合成, ,基因工程基因工程. .早期酶的生产多以动植物为主要原料，如激肽释早期酶的生产多以动植物为主要原料，如激肽释放酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶。近放酶、菠萝蛋白酶、木瓜蛋白酶。近1010年来，研年来，研究发展了动植物组织培养技术，但周期长、成本究发展了动植物组织培养技术，但周期长、成本高。工业生产一般都以微生物为主要来源。目前高。工业生产一般都以微生物为主要来源。目前使用的千余种商品酶，大多数是微生物生产的
4、。使用的千余种商品酶，大多数是微生物生产的。6第三节第三节 酶和细胞的固定化酶和细胞的固定化（一）固定化酶的制备（一）固定化酶的制备1 1、固定化酶固定化酶（immobilized enzymeimmobilized enzyme）的定义）的定义: :指指限制或固定于特定空间位置的酶。具体讲是指经限制或固定于特定空间位置的酶。具体讲是指经物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即物理或化学方法处理，使酶变成不易随水流失即运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。制备固定化酶的过程称为制备固定化酶的过程称为酶的固定化酶的固定化。固定化所。固定化所采用的酶
5、，可以是纯化的酶，也可以是结合在菌采用的酶，可以是纯化的酶，也可以是结合在菌体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系。体（死细胞）或细胞碎片上的酶或酶系。7什么是固定化酶？什么是固定化酶？水溶性酶水溶性酶水不溶性载体水不溶性载体水不溶性酶水不溶性酶（固定化酶）（固定化酶）固定化技术固定化技术8 2 2、固定化酶的特点、固定化酶的特点（1 1）可以多次使用，酶的稳定性提高；）可以多次使用，酶的稳定性提高；（2 2）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中）反应后，酶与底物和产物易于分开，产物中无残留酶，易于纯化。无残留酶，易于纯化。（3 3）反应条件易于控制，可实现转化反应的连续）反应条件易于控制，可实
6、现转化反应的连续化和自动控制；化和自动控制；（4 4）酶的利用率高，单位酶催化的底物量增加，）酶的利用率高，单位酶催化的底物量增加，用酶量少；用酶量少；（5 5）比水溶性酶更适合于多酶反应。）比水溶性酶更适合于多酶反应。9化学偶联酶酶固定化固定化间歇间歇可溶可溶交联包埋吸附间歇间歇连续连续（一）传统的酶固定化方法（一）传统的酶固定化方法1011（1 1）载体结合法）载体结合法：将酶结合于不溶性载体上的固：将酶结合于不溶性载体上的固定化方法。定化方法。A.A.物理吸附法物理吸附法：用物理方法将酶吸附于不溶性载：用物理方法将酶吸附于不溶性载体上的固定化方法。活性碳体上的固定化方法。活性碳, ,多孔
7、玻璃多孔玻璃, ,树脂等树脂等优点：操作简单，可选用不同电荷和不同形状的优点：操作简单，可选用不同电荷和不同形状的载体，有可能固定化和纯化过程同时实现，酶失载体，有可能固定化和纯化过程同时实现，酶失活后载体仍可再生。活后载体仍可再生。缺点：最适吸附酶量无规律可循，吸附量与酶活缺点：最适吸附酶量无规律可循，吸附量与酶活力不一定呈平行关系，酶与载体结合力不强，酶力不一定呈平行关系，酶与载体结合力不强，酶易于脱落，导致酶活下降并污染产物。易于脱落，导致酶活下降并污染产物。12 B B、离子结合法、离子结合法：酶通过离子键：酶通过离子键结合于具有离子交换基的水不溶结合于具有离子交换基的水不溶性载体上。
8、性载体上。DEAE-DEAE-纤维素等纤维素等优点：操作简单，处理条件温和，优点：操作简单，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏。酸残基不易被破坏。缺点：载体和酶的结合力弱，易缺点：载体和酶的结合力弱，易受缓冲液种类或受缓冲液种类或pHpH的影响，离子的影响，离子强度高时，酶易脱落。强度高时，酶易脱落。13C C、共价结合法、共价结合法：酶以共价键结：酶以共价键结合于载体上。即将酶分子上非活合于载体上。即将酶分子上非活性部位功能团与载体表面反应基性部位功能团与载体表面反应基团进行共价结合的方法。团进行共价结合的方法。优点：酶与载体结合牢固，稳定
9、优点：酶与载体结合牢固，稳定性好，不易脱落。性好，不易脱落。缺点：载体要活化，反应条件苛缺点：载体要活化，反应条件苛刻，操作复杂，反应条件剧烈，刻，操作复杂，反应条件剧烈，酶易失活和产生空间位阻效应酶易失活和产生空间位阻效应。14（2 2）交联法）交联法：用双功能或多：用双功能或多功能试剂使酶与酶或细胞功能试剂使酶与酶或细胞与细胞之间交联的方法。与细胞之间交联的方法。交联法又分：交联酶法、交联法又分：交联酶法、酶与辅助蛋白交联法、吸酶与辅助蛋白交联法、吸附交联法和载体交联法。附交联法和载体交联法。常用的交联剂：戊二醛、常用的交联剂：戊二醛、双重氮联苯胺双重氮联苯胺-2-2、2-2-二磺二磺酸、
10、酸、1,5-1,5-二氟二氟-2,4-2,4-二硝基二硝基苯。苯。15酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联酶分子之间共价交联和与水不溶性载体共价偶联 酶分子；（酶分子；（a a）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相）酶分子之间用双功能基团的化学交联试剂相互交联成水不溶性的固定化酶；（互交联成水不溶性的固定化酶；（b b）酶分子被偶联到水不溶）酶分子被偶联到水不溶性载体上形成水不溶性的固定化酶性载体上形成水不溶性的固定化酶16（3 3）包埋法：）包埋法：A A、网格型：、网格型：将酶或细胞包将酶或细胞包埋在高分子凝胶细微网格埋在高分子凝胶细微网格中。中。常用合成高分子化合物有常用合成高分
11、子化合物有聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、光敏树脂。天然高分子化光敏树脂。天然高分子化合物有淀粉、明胶、胶原、合物有淀粉、明胶、胶原、海藻胶、角叉菜胶。多用海藻胶、角叉菜胶。多用于固定化细胞于固定化细胞17B B、微囊型：、微囊型：将酶或细胞包将酶或细胞包埋在高分子半透膜中。通埋在高分子半透膜中。通常为直径几微米到几百微常为直径几微米到几百微米的球状体。颗粒比网格米的球状体。颗粒比网格型要小得多，比较有利于型要小得多，比较有利于底物与产物的扩散，但反底物与产物的扩散，但反应条件要求高，制备成本应条件要求高，制备成本也高。也高。1819（二）新型的酶固定化方法（二）新型的酶固定化方法
12、温和的条件温和的条件下进行，减少酶活力损失，提高固定下进行，减少酶活力损失，提高固定化效率化效率光偶联法光偶联法：光敏性单体聚合物包埋固定化酶或带：光敏性单体聚合物包埋固定化酶或带光敏性基团的载体共价固定化酶光敏性基团的载体共价固定化酶等离子体法等离子体法：高度激发的原子、分子，自由基的：高度激发的原子、分子，自由基的聚集体，载体表面用等离子体修饰，引入活性基聚集体，载体表面用等离子体修饰，引入活性基团团偶合固定法：偶合固定法：几种固定化方法或载体的联合应用几种固定化方法或载体的联合应用20无载体固定化酶无载体固定化酶直接用交联剂交联直接用交联剂交联 用交联剂交联溶解酶、晶体酶、物理聚集酶、和
13、用交联剂交联溶解酶、晶体酶、物理聚集酶、和喷雾干燥酶等四种无载体酶体系，优点如下：喷雾干燥酶等四种无载体酶体系，优点如下： 1.催化活性高，成本低催化活性高，成本低 2.具备较高的催化剂比表面具备较高的催化剂比表面 3.可加入多种酶可加入多种酶 4. 底物扩散受限制少底物扩散受限制少 5.极端条件下稳定性高极端条件下稳定性高21（三）固定化细胞的方法（三）固定化细胞的方法1.1.固定化细胞的定义固定化细胞的定义 将细胞限制或定位于特定空间位置的方法将细胞限制或定位于特定空间位置的方法. .第二代固定化酶第二代固定化酶. . 不用载体，通过化学或物理的手段使细胞彼此不用载体，通过化学或物理的手段
14、使细胞彼此附着相连附着相连 另外还有载体粘合，金属螯合等多种方法另外还有载体粘合，金属螯合等多种方法222 2、固定化细胞的制备技术、固定化细胞的制备技术（1 1）载体结合法制备技术）载体结合法制备技术：将细胞悬浮液直接与：将细胞悬浮液直接与水不溶性载体相结合。载体主要为阴离子交换树脂、水不溶性载体相结合。载体主要为阴离子交换树脂、阴离子交换纤维素、聚氯乙烯。阴离子交换纤维素、聚氯乙烯。 优点：操作简单，符合细胞的生理条件，不影响优点：操作简单，符合细胞的生理条件，不影响细胞的生长及酶活性。细胞的生长及酶活性。 缺点：吸附容量小结合强度低。缺点：吸附容量小结合强度低。（2 2）包埋法制备技术：
15、）包埋法制备技术：与包埋酶法相同。与包埋酶法相同。23（3 3）交联法制备技术：）交联法制备技术：由于所用交联剂戊二醛等由于所用交联剂戊二醛等对细胞有毒性，一般很少用。对细胞有毒性，一般很少用。（4 4）无载体法制备技术：）无载体法制备技术：靠细胞自身的絮凝作用靠细胞自身的絮凝作用制备固定化细胞的技术。通过助凝剂或选择性热制备固定化细胞的技术。通过助凝剂或选择性热变性的方法实现细胞的固定化。变性的方法实现细胞的固定化。此外还有粘合法，截留法等此外还有粘合法，截留法等24（四）常用的固定化酶载体材料（四）常用的固定化酶载体材料1.1.固定化酶载体材料的性质要求固定化酶载体材料的性质要求(1)(1
16、)功能基团功能基团(2)(2)渗透性和比表面：大的比表面和多孔结构渗透性和比表面：大的比表面和多孔结构(3)(3)溶解性：要求不溶于水溶解性：要求不溶于水(4)(4)机械刚性和稳定性：机械刚性和稳定性：(5)(5)组成和粒径：孔径小组成和粒径：孔径小(6)(6)对微生物的抵抗性对微生物的抵抗性(7)(7)经济环保经济环保252.2.固定化酶载体材料固定化酶载体材料(1)(1)高分子载体高分子载体1)1)天然高分子材料：天然高分子材料：优点：无毒，传质性好优点：无毒，传质性好缺点：易被微生物降解缺点：易被微生物降解一般用壳聚糖，海藻酸钠一般用壳聚糖，海藻酸钠 261)1)合成有机高分子材料：合成
17、有机高分子材料：强度大，抗微生物降解强度大，抗微生物降解聚苯乙烯聚苯乙烯27(2)(2)无机载体无机载体稳定性好，机械强度高，不易降解，耐酸，成本稳定性好，机械强度高，不易降解，耐酸，成本低，寿命长低，寿命长玻璃，硅凝胶，铝等玻璃，硅凝胶，铝等28（3 3）复合载体：）复合载体：无机有机材料复合组成的新型载体无机有机材料复合组成的新型载体磁性高分子微球磁性高分子微球: :内部含有磁性金属或金属氧化物内部含有磁性金属或金属氧化物的超细粉末。的超细粉末。回收简单回收简单（4 4）新型载体：如光敏）新型载体：如光敏293 3、固定化方法的选择、固定化方法的选择（1 1）固定化酶应用的安全性固定化酶应
18、用的安全性：要按照药物和食品：要按照药物和食品领域的检验标准作必要的检查。所用试剂是否有领域的检验标准作必要的检查。所用试剂是否有毒性和残留。尽可能选择无毒性试剂。毒性和残留。尽可能选择无毒性试剂。（2 2）固定化酶在操作中的稳定性固定化酶在操作中的稳定性：在选择固定化：在选择固定化方法时要求固定化酶在操作过程中十分稳定，能方法时要求固定化酶在操作过程中十分稳定，能长期反复使用，在经济上有极强的竞争力。长期反复使用，在经济上有极强的竞争力。（3 3）固定化的成本固定化的成本：包括酶、载体、试剂的费用，：包括酶、载体、试剂的费用，也包括水、电、气、设也包括水、电、气、设 备和劳务投资等备和劳务投
19、资等。304 4、载体的选择、载体的选择为了工业化应用，最好选择工业化生产中已大量为了工业化应用，最好选择工业化生产中已大量应用的廉价材料为载体，如聚乙烯醇、卡拉胶、应用的廉价材料为载体，如聚乙烯醇、卡拉胶、海藻胶等。离子交换树脂、金属氧化物及不锈钢海藻胶等。离子交换树脂、金属氧化物及不锈钢碎屑等都是有应用前途的载体。碎屑等都是有应用前途的载体。此外，载体的选择要考虑底物的性质，如当底物此外，载体的选择要考虑底物的性质，如当底物为大分子时，只能用可溶性固定化酶，不能用包为大分子时，只能用可溶性固定化酶，不能用包埋型；埋型；若底物不完全溶解或黏度大，宜采用密度高的不若底物不完全溶解或黏度大，宜采
20、用密度高的不锈钢屑或陶瓷材料制备固定化酶，以便实现转化锈钢屑或陶瓷材料制备固定化酶，以便实现转化反应和回收固定化酶。反应和回收固定化酶。31二、固定化酶（细胞）的性质与指标二、固定化酶（细胞）的性质与指标1 1、固定化酶的形状、固定化酶的形状（1 1）颗粒状颗粒状：包括酶珠、酶块、酶片、酶粉。每种：包括酶珠、酶块、酶片、酶粉。每种固定化方法均可制备颗粒状，方法简单，比表面积固定化方法均可制备颗粒状，方法简单，比表面积大，转化效率高，适用各种反应器。如酵母酶珠。大，转化效率高，适用各种反应器。如酵母酶珠。（2 2）纤维状纤维状：三醋酸纤维素用适当的溶剂溶解后与：三醋酸纤维素用适当的溶剂溶解后与酶
21、混合，再用喷丝的方法就可制成酶纤维。比表面酶混合，再用喷丝的方法就可制成酶纤维。比表面积大，转化效率高，但只适用于填充床反应器。此积大，转化效率高，但只适用于填充床反应器。此外，纤维酶可以织成酶布用于填充床反应器。外，纤维酶可以织成酶布用于填充床反应器。32（3 3）膜状固定化酶膜状固定化酶：可通过共价结合的方法将酶：可通过共价结合的方法将酶偶联在滤膜上。也可用其他方法制膜酶。酶膜比偶联在滤膜上。也可用其他方法制膜酶。酶膜比表面积大，渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后表面积大，渗透阻力小，可用于酶电极，破碎后也可用于填充床。目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化也可用于填充床。目前已有木瓜酶、葡萄糖氧化酶、
22、过氧化物酶、脲酶等酶膜。酶、过氧化物酶、脲酶等酶膜。（4 4）管状固定化酶管状固定化酶：又称酶管，利用管状载体如：又称酶管，利用管状载体如尼龙、聚氯苯乙烯和聚丙烯酰胺，经活化后与酶尼龙、聚氯苯乙烯和聚丙烯酰胺，经活化后与酶偶联得酶管。酶管的机械强度大，切短后可用于偶联得酶管。酶管的机械强度大，切短后可用于填充床反应器，也可组装成列管式反应器。目前填充床反应器，也可组装成列管式反应器。目前已制备出糖化酶、转化酶、脲酶已制备出糖化酶、转化酶、脲酶 等酶管。等酶管。332 2、固定化酶的性质、固定化酶的性质 （1 1）酶活力的变化：酶活力的变化：酶经过固定化之后酶经过固定化之后活力大都活力大都下降下
23、降。其原因主要是酶活性中心的重要氨基酸与载。其原因主要是酶活性中心的重要氨基酸与载体发生结合，酶的空间结构发生变化或酶与底物结体发生结合，酶的空间结构发生变化或酶与底物结合时存在空间位阻效应。包埋法中还有底物与产物合时存在空间位阻效应。包埋法中还有底物与产物扩散阻力增大。扩散阻力增大。 （2 2）酶稳定性的变化酶稳定性的变化：包括对温度、包括对温度、pHpH、蛋白酶、蛋白酶变性剂和抑制剂的耐受程度。固定化后，变性剂和抑制剂的耐受程度。固定化后，稳定性提稳定性提高，有效寿命延长高，有效寿命延长。其原因是限制了酶分子之间的。其原因是限制了酶分子之间的相互作用，阻止了其自溶，增加了酶构型的牢固程相互
24、作用，阻止了其自溶，增加了酶构型的牢固程度。度。341.1.热稳定性提高热稳定性提高：热稳定性越高热稳定性越高，工业化意义越，工业化意义越大。热稳定性高可以提高反应温度和反应速度，大。热稳定性高可以提高反应温度和反应速度，提高效率。提高效率。2.2.对有对有机试剂及酶抑制剂的稳定性提高机试剂及酶抑制剂的稳定性提高3.PH3.PH，蛋白酶等稳定性提高，蛋白酶等稳定性提高35A A、操作稳定性操作稳定性：通常半衰期达到：通常半衰期达到1 1个月以上个月以上时，即时，即具有工业应用价值。具有工业应用价值。B B、贮藏稳定性贮藏稳定性：一般不能长期贮存一般不能长期贮存，现做现用，现做现用，否则活力逐渐
25、下降。若需长期保存，可在贮存液中否则活力逐渐下降。若需长期保存，可在贮存液中添加底物、产物、抑制剂和防腐剂，并于低温保存。添加底物、产物、抑制剂和防腐剂，并于低温保存。C C、对蛋白酶的稳定性对蛋白酶的稳定性：大多数天然酶经固定化后：大多数天然酶经固定化后对蛋白酶的耐受力有所提高对蛋白酶的耐受力有所提高。可能的原因是由于空。可能的原因是由于空间位阻效应使蛋白酶不能进入固定化酶内部。间位阻效应使蛋白酶不能进入固定化酶内部。36（3 3）酶学特性的变化）酶学特性的变化 A A、底物专一性：、底物专一性：对底物的专一性下降下降。 B B、最适、最适pHpH：最适pH可能变大，也可能变小；pH-酶活曲
26、线可能发生变化，其变化与酶蛋白和载体的带电性质有关。 C C、最适温度、最适温度：一般升高一般升高。原因是固定化后空间结构更为稳定。 D D、米氏常数、米氏常数( (Km) Km) ：Km值均发生变化，有的增加很小，有的增加很大，但不会变小。 E E、最大反应速度（、最大反应速度（VmVm）：）：变化很小或不变。37(4)(4)评价固定化酶（细胞）的指标评价固定化酶（细胞）的指标l1.1.固定化酶活力测定固定化酶活力测定单位单位; ;每毫克干重每分钟转化底物的量每毫克干重每分钟转化底物的量活力回收率活力回收率= =固定化酶总活力固定化酶总活力/ /加入酶的总活力加入酶的总活力相对活力固定化酶总
27、活力相对活力固定化酶总活力/ /（加入酶的总活力（加入酶的总活力上清液中未偶联的酶活力）上清液中未偶联的酶活力）l2.2.偶联率及相对活力的测定偶联率及相对活力的测定偶联率（加入酶活力上清液酶活力）偶联率（加入酶活力上清液酶活力）/ /加入蛋加入蛋白活力白活力38l3.3.半衰期半衰期，即酶的活力降为初活力一半时所经历，即酶的活力降为初活力一半时所经历的连续操作时间。的连续操作时间。T1/2T1/2表示表示l4.4.热稳定性：将固定化酶在不同温度下温育热稳定性：将固定化酶在不同温度下温育1h1h，在最适温度下测酶活力，一般保持在在最适温度下测酶活力，一般保持在60%60%以上以上39第四节第四
28、节 固定化酶和固定化细胞的反应器固定化酶和固定化细胞的反应器用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。用于酶进行催化反应的容器及其附属设备称为酶反应器。酶催化反应过程示意图酶催化反应过程示意图过程调控过程调控生物反应器生物反应器 消消毒毒原料原料预处理预处理 产物分产物分离提纯离提纯 产产品品生物催化生物催化剂制备剂制备空气空气除菌除菌能量能量热量热量40常见的酶反应器类型常见的酶反应器类型l按按结构结构区分区分搅拌罐式反应器（搅拌罐式反应器（Stirred Tank Reactor, STRStirred Tank Reactor, STR）鼓泡式反应器鼓泡式反应器(bubble c
29、olumn reactor, BCR )(bubble column reactor, BCR )填充床式反应器填充床式反应器(packed column reactor, PCR )(packed column reactor, PCR )流化床式反应器流化床式反应器( Fluidized Bed Reactor, FBR)( Fluidized Bed Reactor, FBR)膜反应器膜反应器(Membrane Reactor, MR) (Membrane Reactor, MR) l按按操作方式操作方式区分区分分批式反应分批式反应(batch )(batch )连续式反应连续式反应(c
30、ontinuous )(continuous )流加分批式反应流加分批式反应(feeding batch ) (feeding batch ) l混合形式混合形式连续搅拌罐反应器（连续搅拌罐反应器（Continuous Stirred Tank Reactor, Continuous Stirred Tank Reactor, CSTRCSTR）分批搅拌罐反应器（分批搅拌罐反应器（Batch Stirred Tank Reactor, Batch Stirred Tank Reactor, BSTRBSTR） 41一、反应器的类型和特点一、反应器的类型和特点间歇式搅拌罐反应器间歇式搅拌罐反应器
31、用于游离酶反应后随即放料。用于游离酶反应后随即放料。又称为批量反应器（又称为批量反应器（Batch Batch Reactor Reactor BSTRBSTR）。）。特点特点：底物与酶一次性投入反应：底物与酶一次性投入反应器内，产物一次性取出；反应完器内，产物一次性取出；反应完成之后，固定化酶（细胞）用过成之后，固定化酶（细胞）用过滤法或超滤法回收，再转入下一滤法或超滤法回收，再转入下一批反应。批反应。 42优点优点：装置较简单，造价较低：装置较简单，造价较低缺点缺点：固定化酶经反复回收使用时，易失去活性，：固定化酶经反复回收使用时，易失去活性，故在工业生产中，间歇式酶反应器很少用于固定故在
32、工业生产中，间歇式酶反应器很少用于固定化酶，但常用于游离酶。化酶，但常用于游离酶。43连续流动搅拌罐反应器连续流动搅拌罐反应器连续进料、连续出料连续进料、连续出料连续搅拌釜式反应器连续搅拌釜式反应器（CSTRCSTR）。）。向反应器投入固定化酶和底物溶向反应器投入固定化酶和底物溶液，不断搅拌，反应达到平衡之液，不断搅拌，反应达到平衡之后，再以恒定的流速连续流入底后，再以恒定的流速连续流入底物溶液，同时，以相同流速输出物溶液，同时，以相同流速输出反应液（含产物）。反应液（含产物）。底物溶液进口底物溶液进口 反应液出口反应液出口 44优点优点：混合良好，各部分组成相同，并与输出成：混合良好，各部分
33、组成相同，并与输出成分一致。分一致。缺点缺点：搅拌浆剪切力大，易打碎磨损固定化酶颗：搅拌浆剪切力大，易打碎磨损固定化酶颗粒。粒。453. 3. 鼓泡式反应器鼓泡式反应器鼓泡式反应器鼓泡式反应器(bubble column reactor, BCR)(bubble column reactor, BCR)用于游离酶和固定化酶的催化反应。在使用鼓泡式用于游离酶和固定化酶的催化反应。在使用鼓泡式反应器进行固定化酶的催化反应时，反应系统中存反应器进行固定化酶的催化反应时，反应系统中存在固、液、气三相，又称为三相流化床式反应器。在固、液、气三相，又称为三相流化床式反应器。鼓泡式反应器的结构简单，操作容易
34、鼓泡式反应器的结构简单，操作容易, , 剪切力小，剪切力小，物质与热量的传递效率高，是有气体参与的酶催化物质与热量的传递效率高，是有气体参与的酶催化反应中常用的一种反应器。例如氧化酶催化反应需反应中常用的一种反应器。例如氧化酶催化反应需要供给氧气，羧化酶的催化反应需要供给二氧化碳要供给氧气，羧化酶的催化反应需要供给二氧化碳等。等。 464. 4. 喷射式反应器喷射式反应器利用高压蒸汽的喷射作用，实现酶与底物的混合，利用高压蒸汽的喷射作用，实现酶与底物的混合，进行高温短时催化的反应器进行高温短时催化的反应器喷射罐和维持罐组成喷射罐和维持罐组成一般用于耐高温酶的催化一般用于耐高温酶的催化475.
35、5. 膜反应器膜反应器膜反应器膜反应器（membrane reactor, membrane reactor, MRMR）是将酶催化反）是将酶催化反应与半透膜的分离作用组合在一起而成的反应器。应与半透膜的分离作用组合在一起而成的反应器。可以用于游离酶的催化反应，也可以用于固定化酶可以用于游离酶的催化反应，也可以用于固定化酶的催化反应。的催化反应。用于固定化酶催化反应的膜反应器是将酶固定在具用于固定化酶催化反应的膜反应器是将酶固定在具有一定孔径的多孔薄膜中，而制成的一种生物反应有一定孔径的多孔薄膜中，而制成的一种生物反应器。器。膜反应器可以制成平板型、螺旋型、管型、中空纤膜反应器可以制成平板型、
36、螺旋型、管型、中空纤维型、转盘型等多种形状。常用的是中空纤维反应维型、转盘型等多种形状。常用的是中空纤维反应器。器。4849连续搅拌罐连续搅拌罐超滤膜反应器超滤膜反应器 简称CSTR-UFR。在CSTR（连续式搅拌罐）出口处设置一个超滤器。可以将小分子产物与大分子酶和底物分开，有利于产物回收。该反应器适用于颗粒较细的固定化酶、游离酶和细胞以及小分子产物与大分子底物。游离酶在膜反应器中进行催化反应时，底物溶液连续地进入反应器，酶在反应容器的溶液中与底物反应，反应后，酶与反应产物一起，进入膜分离器进行分离，小分子的产物透过超滤膜而排出，大分子的酶分子被截留，可以再循环使用。506.6.填充填充床反
37、应器床反应器（Packed Reactor,PBRPacked Reactor,PBR） 填充床反应器填充床反应器。固定化酶添充于床层固定化酶添充于床层内。反应器内的流体内。反应器内的流体的流动形态为平推流的流动形态为平推流形。底物以恒定流速形。底物以恒定流速通过反应床通过反应床. .51优点是：高效率、易操作、结构简单等，是优点是：高效率、易操作、结构简单等，是目前目前工业生产及研究中应用最为普遍的反应器工业生产及研究中应用最为普遍的反应器。它适。它适用于各种形状的固定化酶和不含固体颗粒、黏度用于各种形状的固定化酶和不含固体颗粒、黏度不大的底物溶液，以及有产物抑制的转化反应。不大的底物溶液，
38、以及有产物抑制的转化反应。缺点是：传质系数和传热系数相对较低。当底物缺点是：传质系数和传热系数相对较低。当底物溶度含固体颗粒或黏度很大时，不宜采用溶度含固体颗粒或黏度很大时，不宜采用PBRPBR52特点：底物溶液以足特点：底物溶液以足够大的流速，从反应够大的流速，从反应器底部向上通过固定器底部向上通过固定化酶柱床时，便能使化酶柱床时，便能使固定化酶颗粒始终处固定化酶颗粒始终处于流化状态于流化状态, ,达到混合达到混合的目的。的目的。7.7.流化床反应器流化床反应器（Fluidized Bed Reactor,Fluidized Bed Reactor, FBRFBR）53其流动方式使反应液的混
39、合程度介于其流动方式使反应液的混合程度介于CSTRCSTR的全混的全混型和型和PBRPBR的平推流型之间。的平推流型之间。FBRFBR可用于处理黏度较可用于处理黏度较大和含有固体颗粒的底物溶度，同时，亦可用于大和含有固体颗粒的底物溶度，同时，亦可用于需要供气体或排放气体的酶反应（即固、液、气需要供气体或排放气体的酶反应（即固、液、气三相反应）。三相反应）。但因但因FBRFBR混合均匀，故不适用于有产物抑制的酶反混合均匀，故不适用于有产物抑制的酶反应。应。54各种反应器的示意图各种反应器的示意图55各种酶反应器的特点各种酶反应器的特点反反应器器类型型适用的操作方式适用的操作方式适用的适用的酶酶特
40、点特点搅拌罐式反拌罐式反应器器分批式分批式, ,流加分批式流加分批式连续式式, ,游离游离酶酶固定化固定化酶酶反反应比比较完全，反完全，反应条件容易条件容易调节控制。控制。填充床式反填充床式反应器器连续式式固定化固定化酶酶密度大，可以提高密度大，可以提高酶酶催化反催化反应的速度。在的速度。在工工业生生产中普遍使用。中普遍使用。流化床反流化床反应器器分批式分批式流加分批式流加分批式连续式式固定化固定化酶酶流化床反流化床反应器具有混器具有混合均匀，合均匀，传质和和传热效果好，温度和效果好，温度和pHpH值的的调节控制比控制比较容易，容易，不易堵塞，不易堵塞，对粘度粘度较大反大反应液也可液也可进行催
41、行催化反化反应。56反反应器器类型型适用的操作方适用的操作方式式适用的适用的酶酶 特点特点鼓泡式反鼓泡式反应器器分批式分批式流加分批式流加分批式连续式式游离游离酶酶固定化固定化酶酶鼓泡式反鼓泡式反应器的器的结构构简单，操作容易，剪切力小，混操作容易，剪切力小，混合效果好，合效果好，传质、传热效效率高率高, ,适合于有气体参与的适合于有气体参与的反反应。膜反膜反应器器连续式式游离游离酶酶固定化固定化酶酶清洗比清洗比较困困难 喷射式反射式反应器器连续式式游离游离酶酶通入高通入高压喷射蒸汽，射蒸汽，实现酶酶与底物的混合，与底物的混合，进行高行高温短温短时催化反催化反应，适用于，适用于某些耐高温某些耐
42、高温酶酶的反的反应57二、反应器性能评价二、反应器性能评价固定化酶的形状固定化酶的形状 溶液酶溶液酶, ,回收困难回收困难, ,只适用于只适用于BSTRBSTR 颗粒及片状的固定化酶对颗粒及片状的固定化酶对CSTRCSTR和和PBRPBR均适用均适用 膜及纤维片状的酶只适用膜及纤维片状的酶只适用PBRPBR 固定化酶易变形固定化酶易变形, ,易粘及结颗粒时易粘及结颗粒时, ,采用采用FBRFBR58底物的物理性质底物的物理性质 溶解性和浊液性底物溶解性和浊液性底物. .适合任何反应器适合任何反应器 颗粒和胶状底物需要高速搅拌颗粒和胶状底物需要高速搅拌反应的动力学特性反应的动力学特性 CSTR
43、CSTR型随搅拌速度型随搅拌速度,PFR,PFR型随流速增加而加快型随流速增加而加快59酶的稳定性酶的稳定性 高速搅拌会脱落高速搅拌会脱落, ,避免剪切力避免剪切力, ,减少外界环境影减少外界环境影响响. .60三、酶反应器的操作三、酶反应器的操作1.1.酶反应器操作条件的确定及其调节控制酶反应器操作条件的确定及其调节控制l（1 1）底物浓度的确定与调节控制）底物浓度的确定与调节控制底物浓度是酶催化速度的关键因素底物浓度是酶催化速度的关键因素要确定适宜的底物浓度，过低，反应速度慢，过要确定适宜的底物浓度，过低，反应速度慢，过高，粘度大高，粘度大61l（2 2）酶浓度的确定与调节控制）酶浓度的确
44、定与调节控制底物粘度足够高时，酶反应速度与与酶浓度成正底物粘度足够高时，酶反应速度与与酶浓度成正比比考虑成本，保持一定的酶浓度，进行补充和替考虑成本，保持一定的酶浓度，进行补充和替换换62l（3 3）反应温度的确定与调节控制）反应温度的确定与调节控制需最适用温度，控制在范围内需最适用温度，控制在范围内温度变化时，及时调节温度变化时，及时调节63l（4 4）PHPH的确定与调节控制的确定与调节控制最适最适PHPH在操作过程中，有时需要用酸或碱来调节反应液在操作过程中，有时需要用酸或碱来调节反应液PHPH。如果局部的。如果局部的pHpH过高或过低，就会引起酶的失过高或过低，就会引起酶的失活，或者使
45、底物和产物发生水解反应。这时，可活，或者使底物和产物发生水解反应。这时，可用加快搅拌已促使混合均匀。用加快搅拌已促使混合均匀。64l（5 5）搅拌速度的确定与调节控制）搅拌速度的确定与调节控制混合均匀，有效碰撞混合均匀，有效碰撞搅拌过慢，影响混合均匀性，过快，剪切力过大搅拌过慢，影响混合均匀性，过快，剪切力过大65l（6 6）流动速度的确定与调节控制）流动速度的确定与调节控制连续式酶反应器中，控制好流速，保证混合均匀，连续式酶反应器中，控制好流速，保证混合均匀，过慢，酶颗粒沉积，阻塞；过快，流动状态过乱，过慢，酶颗粒沉积，阻塞；过快，流动状态过乱，固定化酶结构破坏，脱落，流失固定化酶结构破坏，
46、脱落，流失填充床式，流速越慢，酶与底物接触时间越长，填充床式，流速越慢，酶与底物接触时间越长，反应越完全，但生产效率低，过快，影响转化效反应越完全，但生产效率低，过快，影响转化效率率膜反应器，容易产生浓差极化阻塞膜孔，需搅拌膜反应器，容易产生浓差极化阻塞膜孔，需搅拌和控制流速和控制流速66 2.2.酶反应器应用的注意事项酶反应器应用的注意事项（1 1）保持酶反应器的操作稳定性：一定时间后，）保持酶反应器的操作稳定性：一定时间后，检查酶活力，进行补充和替换检查酶活力，进行补充和替换（2 2）保持流体的流动方式和状态：流动状态的改）保持流体的流动方式和状态：流动状态的改变，会影响酶与底物，产物的接
47、触变，会影响酶与底物，产物的接触（3 3）防止酶的变性失活）防止酶的变性失活: :控制温度，控制温度，PHPH，金属离，金属离子，剪切力子，剪切力67（4 4）防止微生物污染：一般不必严格无菌操作，）防止微生物污染：一般不必严格无菌操作，但底物与产物为营养物时，需防微生物污染。但底物与产物为营养物时，需防微生物污染。 一般要符合必要的卫生条件，生产药用或食品酶一般要符合必要的卫生条件，生产药用或食品酶时，卫生条件要求较高时，卫生条件要求较高68措施：措施：要求环境清洁，要求环境清洁，反应器使用前后进行清洗和消毒反应器使用前后进行清洗和消毒严格管理，经常检测严格管理，经常检测加消毒剂等加消毒剂等
48、采用较高温度和低的采用较高温度和低的PHPH693.3.生产能力的下降及对策生产能力的下降及对策酶反应器操作中，生产能力逐渐降低，主要原因酶反应器操作中，生产能力逐渐降低，主要原因是是固定化酶活性降低或损失固定化酶活性降低或损失。造成固定化酶活性。造成固定化酶活性损失的原因：损失的原因：（1 1）酶本身的失活；）酶本身的失活；（2 2）酶从载体上脱落；）酶从载体上脱落；（3 3）载体的破碎或溶解。）载体的破碎或溶解。70固定化酶产品介绍固定化酶产品介绍(1)(1)氨基酰化酶氨基酰化酶：这是世界上第一种工业化生产的固：这是世界上第一种工业化生产的固定化酶，可以用于生产各种定化酶，可以用于生产各种
49、L-L-氨基酸药物。氨基酸药物。19691969年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离年，日本田边制药公司将从米曲霉中提取分离得到的氨基酰化酶，用得到的氨基酰化酶，用DEAE-DEAE-葡聚糖凝胶为载体通过葡聚糖凝胶为载体通过离子键结合法制成固定化酶，将离子键结合法制成固定化酶，将L-L-乙酰氨基酸水解乙酰氨基酸水解生成生成L-L-氨基酸，用来拆分氨基酸，用来拆分DL-DL-乙酰氨基酸，连续生产乙酰氨基酸，连续生产L-L-氨基酸。剩余的氨基酸。剩余的D-D-乙酰氨基酸经过消旋化，生成乙酰氨基酸经过消旋化，生成DL-DL-乙酰氨基酸再进行拆分。生产成本仅为用游离乙酰氨基酸再进行拆分。生产成本仅
50、为用游离酶生产成本的酶生产成本的6060左右。左右。71固定化酶法生产固定化酶法生产L-L-氨基酸氨基酸乙酰乙酰-DL-DLAla Ala L LAla+Ala+乙酰乙酰-D-DAlaAlaAminoacylaseAminoacylase氨基酰化酶氨基酰化酶72泵泵储罐反应产物离心机离心机消消旋旋反反应应器器固定化酶柱子固定化酶柱子DEAE-葡聚糖葡聚糖氨基酰化酶氨基酰化酶晶体 L-AlaL-Ala A-D-AlaA-L-Ala A-D-Ala73(2)(2)天门冬氨酸酶天门冬氨酸酶：19731973年日本用聚丙烯酰胺凝胶年日本用聚丙烯酰胺凝胶为载体，将具有高活力天门冬氨酸酶的大肠杆菌为载体，
51、将具有高活力天门冬氨酸酶的大肠杆菌菌体包埋制成固定化天门冬氨酸酶，用于工业化菌体包埋制成固定化天门冬氨酸酶，用于工业化生产，将延胡索酸转化生产生产，将延胡索酸转化生产L-L-天门冬氨酸。天门冬氨酸。19781978年以后，改用角叉菜胶为载体制备固定化酶，年以后，改用角叉菜胶为载体制备固定化酶，也可将天也可将天门冬门冬氨酸酶从大肠杆菌细胞中提取分离氨酸酶从大肠杆菌细胞中提取分离出来，再用离子键结合法制成固定化酶，用于工出来，再用离子键结合法制成固定化酶，用于工业化生产。业化生产。74(3)(3)天门冬氨酸脱羧酶天门冬氨酸脱羧酶：将含天门冬氨酸脱羧酶的：将含天门冬氨酸脱羧酶的假单胞菌菌体，用凝胶包
52、埋法制成固定化天门冬假单胞菌菌体，用凝胶包埋法制成固定化天门冬氨酸脱羧酶，于氨酸脱羧酶，于19821982年用于工业化生产，催化年用于工业化生产，催化L-L-天门冬氨酸脱去羧基，生产天门冬氨酸脱去羧基，生产L-L-丙氨酸。丙氨酸。75(4)(4)青霉素酰化酶青霉素酰化酶：是在药物生产中广泛应用的一：是在药物生产中广泛应用的一种固定化酶。可用多种方法固定化。种固定化酶。可用多种方法固定化。19731973年已用年已用于工业化生产，用于制造各种半合成青霉素和头于工业化生产，用于制造各种半合成青霉素和头孢菌素。孢菌素。用同一种固定化青霉素酰化酶，只要改变用同一种固定化青霉素酰化酶，只要改变pHpH等
53、条等条件，就既可以催化青霉素或头孢菌素水解生成件，就既可以催化青霉素或头孢菌素水解生成6 6一一氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸(6(6一一APA)APA)或或7 7一氨基头孢霉烷酸一氨基头孢霉烷酸(7(7一一ACA)ACA)，也可以催化，也可以催化6 6一一APAAPA或或7 7一一ACAACA与其他的羧酸与其他的羧酸衍生物进行反应，以合成新的具有不同侧链基团衍生物进行反应，以合成新的具有不同侧链基团的青霉素或头孢霉素。的青霉素或头孢霉素。76固定化细胞法生产固定化细胞法生产6-6-氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸青霉素酰化酶与抗生素改造青霉素酰化酶与抗生素改造777879 E.Coli E.Coli E.Coli E.Coli 斜面斜面斜面斜面 细胞细胞细胞细胞 固定化细胞固定化细胞固定化细胞固定化细胞 青霉素青霉素青霉素青霉素G G G G 转化液转化液转化液转化液 滤液滤液滤液滤液 6-APA 6-APA 6-APA 6-APA 粗品粗品粗品粗品培养培养固定固定转化转化过滤过滤抽提抽提1.1.技术路线技术路线80青霉素酰化酶转化流程图青霉素酰化酶转化流程图
