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1、MSI诊断检测的方法和应用诊断检测的方法和应用主主 要要 内内 容容 微微卫星不星不稳定的相关背景定的相关背景MSI的的检测意意义MSI检测方法方法MSI检测试剂盒盒背背 景景 介介 绍绍 微卫星不稳定性微卫星不稳定性(microsatellite instability, (microsatellite instability, MSI)MSI)是指与正常组织相比，在肿瘤中某一微卫星由于重复是指与正常组织相比，在肿瘤中某一微卫星由于重复单位的插入或缺失而造成的微卫星长度的任何改变，出现单位的插入或缺失而造成的微卫星长度的任何改变，出现新的微卫星等位基因现象。新的微卫星等位基因现象。 主要机制
2、：主要机制： DNA DNA多聚酶的滑动导致重复序列中多聚酶的滑动导致重复序列中1 1个或多个碱基的个或多个碱基的错配错配 MS MS同源重组导致碱基对的丢失和插入同源重组导致碱基对的丢失和插入 19931993年，年，AltonenAltonen等首次发现，在等首次发现，在HNPCCHNPCC细胞中存在高频率细胞中存在高频率的的MSIMSI。目前已发现。目前已发现MSIMSI的肿瘤主要有的肿瘤主要有3 3类：类： 一类为一类为HNPCCHNPCC病人发生的结直肠癌、子宫内膜癌以及卵巢病人发生的结直肠癌、子宫内膜癌以及卵巢癌癌, ,这一类肿瘤几乎都表现为这一类肿瘤几乎都表现为MSIMSI； 另
3、一类为散发性结直肠癌另一类为散发性结直肠癌, ,这一类肿瘤发生这一类肿瘤发生MSIMSI概率约概率约15 30； 第三类为包括肺癌、乳腺癌和胰腺癌在内的其它肿瘤第三类为包括肺癌、乳腺癌和胰腺癌在内的其它肿瘤, ,这这一类肿瘤一类肿瘤MSIMSI发生频率相对较低。发生频率相对较低。背背 景景 介介 绍绍结直肠癌是是常见的消化道恶性肿瘤，我们每结直肠癌是是常见的消化道恶性肿瘤，我们每年有年有1313万万-16-16万人罹患结直肠癌，其发病率占肿瘤万人罹患结直肠癌，其发病率占肿瘤发病率的第三位，仅次于肺癌和胃癌。发病率的第三位，仅次于肺癌和胃癌。 HNPCCHNPCC是常见的遗传性肿瘤综合症，遗传性
4、结是常见的遗传性肿瘤综合症，遗传性结直肠癌是一个常染色体遗传疾病直肠癌是一个常染色体遗传疾病, ,目前研究表明微目前研究表明微卫星不稳定性可能是遗传性结直肠癌发生的重要卫星不稳定性可能是遗传性结直肠癌发生的重要机制。机制。背背 景景 介介 绍绍具有具有MSI的散的散发性性结直直肠癌癌,具有不同的具有不同的临床病理、床病理、分子生物学特征分子生物学特征,表表现为:发病年病年龄较小；小；对某些化某些化疗药物物(如如5-FU、顺铂等等)有原有原发性耐性耐药; 生物学行生物学行为较好。好。MSI-H是是期期结肠癌癌预后良好的一个后良好的一个标志物，也志物，也是患者不能从氟尿是患者不能从氟尿嘧啶单药辅助
5、化助化疗获益的益的疗效效预测指指标。背背 景景 介介 绍绍微卫星不稳定检测的意义微卫星不稳定检测的意义1. 1. 检测MSIMSI可以用于可以用于检测是否是否为LynchLynch综合征合征结直直肠癌的癌的遗传易感性包括一些研究易感性包括一些研究较清楚的清楚的遗传性性综合征，例如合征，例如LynchLynch综合征（又称之合征（又称之为遗传性非息肉病性非息肉病性性结直直肠癌，癌，HNPCCHNPCC）和家族性息肉病（）和家族性息肉病（FAPFAP）。）。在在HNPCC HNPCC 和散和散发性直性直肠癌中的微癌中的微卫星不星不稳定性是遍布整个定性是遍布整个基因基因组的的现象，并且可能是象，并且
6、可能是导致癌症致癌症发生的普遍机制。生的普遍机制。 专家家组推荐，推荐， MMRMMR蛋白蛋白检测应强强烈建烈建议在所在所有有5050岁以下的以下的结肠癌患者中开展，原因在于癌患者中开展，原因在于该群体中患群体中患LynchLynch综合征的可能性增加。而且，在合征的可能性增加。而且，在一些中心，一些中心，现在在对所有的所有的结直直肠肿瘤瘤组织进行行免疫免疫组化化检测（有（有时分析分析MSIMSI）以来决定哪些患）以来决定哪些患者需要者需要进行行LynchLynch综合征相关的基因合征相关的基因检测. .微卫星不稳定检测的意微卫星不稳定检测的意义义 2. 检测MSI可以用于判断患者可以用于判断
7、患者预后后高危高危期患者，定期患者，定义为预后后较差者，包括：差者，包括：T4（B、C期）、期）、组织学分化差（学分化差（3/4级，不包，不包括括MSI-H者），已者），已经有大量有大量证据表明据表明MMR蛋白蛋白表达缺失或表达缺失或MSI-H是是期期结肠癌癌预后良好的一个后良好的一个标志物。具有志物。具有MSI-H肿瘤的瘤的期期结肠癌患者，癌患者，3/4级分化（低分化）不再分化（低分化）不再认为是高危因素。是高危因素。微卫星不稳定检测的意义微卫星不稳定检测的意义3. 3. 检测检测MSIMSI以判断是否需要辅助化疗以判断是否需要辅助化疗对于对于期结肠癌是否需要辅助化疗，在做临床决期结肠癌是否
8、需要辅助化疗，在做临床决策时需要考量的一个重要信息就是微卫星不稳定策时需要考量的一个重要信息就是微卫星不稳定性（性（MSIMSI）。）。研究认为研究认为MMR MMR 基因为基因为MSI-HMSI-H（高度微卫星不稳定）（高度微卫星不稳定）会对顺铂、卡培他滨及会对顺铂、卡培他滨及5-FU 5-FU 产生耐药性，相反产生耐药性，相反MSI-LMSI-L、MSS MSS 的患者不会产生耐药。的患者不会产生耐药。微卫星不稳定检测的意义微卫星不稳定检测的意义 一项研究长期随访了一项研究长期随访了/期结肠癌患期结肠癌患者后发现，者后发现，MSI-LMSI-L或或MSSMSS者通过者通过5-FU5-FU辅
9、助化辅助化疗确实改善了预后；然而，疗确实改善了预后；然而，MSI-HMSI-H者却不能者却不能从术后从术后5-FU5-FU辅助化疗中显著获益，与单纯辅助化疗中显著获益，与单纯手术相比，手术相比，5-5-年生存率反而更低。年生存率反而更低。微卫星不稳定检测的意义微卫星不稳定检测的意义MSI 检检 测测 方方 法法1. 免疫组化方法免疫组化方法(IHC) 免疫组化方法仅用于与肿瘤细胞中的免疫组化方法仅用于与肿瘤细胞中的MLH1, MSH2, MSH6和和PMS2蛋白结蛋白结合。如果没有结合任何的蛋白，就证明发生了合。如果没有结合任何的蛋白，就证明发生了MSI。2. 直接测序法直接测序法 对对MMR
10、基因各区域（基因各区域（MLH1、MSH2、MSH6等）的扩增产物直接测序。等）的扩增产物直接测序。3. 多重荧光多重荧光PCR 采用多重荧光采用多重荧光PCR的方法对的方法对NCI建议的位点进行扩增，以确定建议的位点进行扩增，以确定MSI状态。状态。检检 测测 MSI 方方 法法 比比 较较 方法方法灵敏度灵敏度特异特异性性重现重现性性时间时间成本成本操作操作IHC90%低低低低3-5天天5001000复杂复杂直接测序直接测序法法80100%高高高高5-7天天10002000 简便简便多重荧光多重荧光PCR100%高高高高2-3天天5001000 简便简便Microread MSI 检检 测
11、测 试试 剂剂 盒盒 阅微基因根据阅微基因根据NCCNNCCN指南，针对结直肠癌基因诊断领域研发了指南，针对结直肠癌基因诊断领域研发了MSIMSI检测检测的试剂盒。的试剂盒。 微卫星不稳定（微卫星不稳定（microsatellite instabilitymicrosatellite instability，MSIMSI）检测试剂盒是）检测试剂盒是一款以多重荧光一款以多重荧光PCRPCR技术为基础的基因突变检测系统，一次扩增检测技术为基础的基因突变检测系统，一次扩增检测6 6个个MSIMSI位点，操作简便、快速。位点，操作简便、快速。扩扩 增增 检检 测测 位位 点点位点位点GenBankNu
12、mber重复序列重复序列产物范围产物范围1标记荧光类型标记荧光类型NR-27AF070674(A)2770-91HEXNR-21XM_033393(A)2192-113FAMBAT-26U41210(A)26160-185FAMBAT-25L04143(A)25105-125HEXNR-24X60152(A)24119-139TMRMONO-27AC007684(A)27155-177TMRPenta CAL138752(AAAAG)3-15190-250FAMPenta DAC000014(AAAAG)2-17151-224HEXAmel-107/113TMRMSI 检检 测测 送送 样样
13、要要 求求 若客户提供石蜡切片，则要求厚度若客户提供石蜡切片，则要求厚度5-20m的石蜡切片（切片的石蜡切片（切片中确保含有中确保含有9mm2以上大小的组织块）以上大小的组织块）10片或以上，注明石蜡片或以上，注明石蜡包埋组织的保存年限，组织类型和包埋前处理方式等。包埋组织的保存年限，组织类型和包埋前处理方式等。若客户提供若客户提供DNA样品，则从新鲜组织提取的样品，则从新鲜组织提取的DNA最佳，最佳，20ng/l以上的以上的DNA 20l即可（需提供即可（需提供DNA浓度）；若为石蜡浓度）；若为石蜡包埋组织提取的包埋组织提取的DNA，除了提供，除了提供DNA的浓度（的浓度（20ng/l以上的
14、以上的DNA至少至少20l）外，还需提供琼脂糖凝胶电泳图）外，还需提供琼脂糖凝胶电泳图MSI 检检 测测 试试 剂剂 盒盒 使使 用用 方方 法法DNA提取：根据样本不同，采用二甲苯或提取：根据样本不同，采用二甲苯或Chelex 100的方法提取的方法提取DNA；PCR扩增：扩增：毛细管电泳检测：按照毛细管电泳检测：按照（0.5lROX500）样品数样品数+（8.5l甲酰胺）甲酰胺）样品数样品数制备好样品，制备好样品，RUN 3130xl遗传分析仪。遗传分析仪。组分组分20 l体系体系(l)Master Mix无核酸酶超纯水无核酸酶超纯水6.02.5PCR Mix8.05MSI引物混合物引物混
15、合物4.0模板模板DNA2.0反应总体积反应总体积20.0操操 作作 流流 程程 示示 意意 图数数 据据 分分 析析n 目的峰：目的峰：A. 单核苷酸标记的位点单核苷酸标记的位点NR21、Bat26、NR27、Bat25、NR24、Mono27的峰型均为类似五指的手掌峰，见图的峰型均为类似五指的手掌峰，见图2； 图图2 单核苷酸标记位点峰型示意图单核苷酸标记位点峰型示意图B. 五核苷酸重复的位点五核苷酸重复的位点Penta C、Penta D和性和性别位点位点Amelogenin的峰型均的峰型均为单峰型，峰型，见图3。 图3 五核苷酸五核苷酸标记和性和性别位点峰型示意位点峰型示意图n 非目的
16、峰：非目的峰：pull-up峰、峰、stutter峰、染料峰、加峰、染料峰、加A不完全峰等。不完全峰等。数数 据据 分分 析析MSI 判判 定定 结结 果果微卫星不稳定MSI-H型 根据根据NCI建建议，与正常，与正常样本比本比较，有，有2个个发生改生改变可称定可称定为MSI-H型，型，只有只有1个出个出现不不稳定的定的为MSI-L型，没有出型，没有出现突突变的情况的情况为MSS型。型。微卫星不稳定MSI-L型MSI 判判 定定 结 果果微卫星稳定MSS型MSI 判判 定定 结 果果MSI 检检 测测 试试 剂剂 盒盒 优优 点点 基于基于MSIMSI的的NCI panelNCI panel标
17、准开发了适合中国人群的标准开发了适合中国人群的MSIMSI检测系统；检测系统； 采用多重荧光采用多重荧光PCRPCR技术，一次扩增和检测技术，一次扩增和检测6 6个准单态性单核苷酸个准单态性单核苷酸微卫星基因座，其中微卫星基因座，其中5 5个与国外检测相吻合，另外增加了一个适合个与国外检测相吻合，另外增加了一个适合中国人群的位点；中国人群的位点； 基于测序仪的基因分型研究领域拥有多年的经验和多项成果，基于测序仪的基因分型研究领域拥有多年的经验和多项成果，已经做了超过已经做了超过10001000例病例样本，积累了丰富的经验和数据基础。例病例样本，积累了丰富的经验和数据基础。MSI 检检 测测 案
18、案 例例XBH-XXBH-1* 接收委托方两份接收委托方两份样本，正常本，正常组织XBH-X和和肿瘤瘤组织XBH-1，要求，要求鉴定定肿瘤瘤组织的的MSI状状态，正常正常对照照样本分型正确，本分型正确，肿瘤瘤组织样品在品在BAT-26、NR-27、BAT-25、NR-24和和MONO-27等等5个位点出个位点出现双峰。双峰。该肿瘤瘤组织为MSI-H型。型。13MS6E13MS6C* 接收委托方两份接收委托方两份检材，分材，分别为肿瘤瘤组织13MS6C和正常和正常组织13MS6E，要求，要求检测该肿瘤瘤组织的的MSI状状态，6个个单核苷酸位点均未出核苷酸位点均未出现MSI，鉴定定结果果为MSS稳
19、定状定状态。MSI 检 测 案案 例例阅阅 微微 基基 因因 诊诊 断断 试试 剂剂 简简 介介n 脆性脆性X综合征检测试剂盒综合征检测试剂盒 五种特性检测脆性五种特性检测脆性X综合征：准确计算综合征：准确计算CGG重复数、灵敏度高于重复数、灵敏度高于Southern杂交、可识别女性纯合子及杂合子、检测杂交、可识别女性纯合子及杂合子、检测AGG插入、结果插入、结果100%可重复。可重复。n 白血病白血病BCR-ABL1检测试剂盒检测试剂盒 检测三种最常见检测三种最常见BCR-ABL1变体；可进行绝对定量；灵敏度达变体；可进行绝对定量；灵敏度达10-5；整合整合ARQ技术，检测结果稳定、准确；成
20、本较低。技术，检测结果稳定、准确；成本较低。n Y微缺失微缺失检测试剂盒盒 操作操作简便；便；8小小时内得到内得到结果；模版需要量低；果；模版需要量低；检测位点包含位点包含EAA/EMQN指指导意意见位点；每个位点；每个样品只需一个品只需一个扩增增检测反反应；可；可检测AZFb、AZFc区各常区各常见部分缺失及复制；可同部分缺失及复制；可同时对克氏克氏综合症合症进行行检测。n21三体三体综合征合征检测试剂盒盒 周期短、准确性高、灵敏度高、可清晰判断周期短、准确性高、灵敏度高、可清晰判断样本本污染情况、染情况、对于部分易位和嵌合体有更好的于部分易位和嵌合体有更好的检出率出率阅阅 微微 基基 因因 诊诊 断断 试试 剂剂 简简 介介
