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1、第五章、酶的性质与应用5.1 淀粉水解酶类n5.1.1、概述n淀粉是植物中碳水化合物贮存的主要形式，是一种由D-葡萄糖单体以-1，4糖苷键和-1，6糖苷键组成的多聚糖，淀粉可分为两种n直直链链淀淀粉粉（AmyloseAmylose）：葡萄糖残基借助于-1，4糖苷键连接起来的直链分子，分子量为几万-几十万(6-10万)，温水中易溶，粘度不大，与碘液呈蓝色分子。n支支链链淀淀粉粉( (AmylopectinAmylopectin) )：由-1，4糖苷键和-1，6糖苷键共同构成的分枝状多聚糖，分子量为几十万几百万（50-100万），需加热才能溶解，粘度大，遇碘呈蓝紫色。1直链淀粉结构直链淀粉结构2支
2、链淀粉结构支链淀粉结构3直链淀粉与I2形成兰色络合物4n淀粉是自然界分布极广的碳水化合物，高等植物的根、茎、叶、花、果、种子等组织器官中都有淀粉的存在。谷物种子、薯类块茎、各种水果和坚果等，是储存淀粉最多的器官。一般淀粉谷物中，都是由直链和支链淀粉共同构成的。n薯类和谷物淀粉中，支链淀粉占10-20%，直链淀粉占80-90%。5淀粉的特性n糯米淀粉中，支链淀粉99%。n豆类（如豌豆、绿豆等）淀粉，直链淀粉含量较高。n淀粉是白色或类白色，不溶于乙醚、乙醇、丙酮等有机溶剂，也不溶于冷水。淀粉是以颗粒状态存在于胚乳细胞中，其内部呈复杂的结晶组织，随原料品种不同，淀粉具有不同的形状和大小，淀粉颗粒可分
3、为圆形、椭圆形和多角形三种。n一般水分高，蛋白质含量少的植物淀粉颗粒较大，形状也比较整齐，多呈圆形或椭圆形，如马铃薯淀粉；反之颗粒较小，呈多角形，如米淀粉。6玉米淀粉1500倍稻米淀粉5000倍马铃薯淀粉1500倍小麦淀粉50007n不同淀粉粒不仅颗粒形状不一样，其大小也不相同，不同淀粉粒平均颗粒大小为：n马铃薯淀粉粒65m，小麦淀粉粒20m，甘薯淀粉粒15m，玉米淀粉粒16m，稻米淀粉粒5m。n就同一种淀粉而言，淀粉粒的大小也不均匀，如玉米淀粉粒中最大的为26m，最小的为5m。n在常见的淀粉中马铃薯淀粉的颗粒最大，稻米淀粉的颗粒最小。8n淀粉的糊化：又称“化”，是指淀粉颗粒在水中被加热，水分
4、迅速渗透到淀粉颗粒内部，使淀粉颗粒吸水膨胀，晶体结构消失，淀粉颗粒外膜完全破裂而解体，变成粘稠状的液体。n在这一过程中，淀粉颗粒吸水，体积增加50-100倍；-淀粉酶水解颗粒淀粉（天然淀粉）和水解糊化淀粉的速度比为1：20000。淀粉的糊化9淀粉的老化n淀粉的老化（凝沉）：糊化淀粉缓慢冷却，会变浑浊，甚至产生凝结沉淀，这种现象称为“老化”或“回生、凝沉”，是分子间氢键已断裂的糊化淀粉又重新排列形成新氢键的过程，也就是一个复结晶过程，发生凝沉的淀粉不易溶解，淀粉酶很难进入老化淀粉的结晶区，淀粉很难液化，更谈不上糖化。10n直链淀粉容易老化，支链淀粉难老化；n在高温（60）或低于-20 条件下，淀
5、粉不易老化；而在2-4条件下，极易老化。快速升温及快速降温，淀粉不易老化，反之容易老化。n淀粉糊浓度越高，淀粉糊极易老化；nDE值越小，越易老化；一般在碱性条件下，有抑制老化的作用。n利用淀粉加热糊化、冷却又老化的原理，可制作粉丝、粉皮、龙虾片等食品，选用含直链淀粉多的绿豆淀粉，糊化后使它在4左右冷却，促使老化发生。11淀粉的液化n淀粉的液化：淀粉经糊化后，晶体结构被破坏，淀粉分子就直接暴露在酶（-淀粉酶）分子的作用之下，分子链迅速断开、变短，最终形成含有少量葡萄糖的低分子糊精溶液，液体的粘度随之降低，这就是淀粉的液化过程。125.1 淀粉水解酶类淀粉水解酶类 凡是能催化淀粉（或糖元）分子及其
6、分子片段中的-葡萄糖苷键水解的酶，统称为淀粉酶，包括-淀粉酶，糖化酶，-淀粉酶，异淀粉酶，普鲁蓝酶，环状糊精生成酶，麦芽寡糖生成酶等。135.1.2、-淀粉酶淀粉酶-淀淀粉粉酶酶：是一种内切酶，作用于淀粉时，它能水解淀粉分子内-1，4葡萄糖苷键（但该酶不能切开-1，6键），将淀粉分子任意切断成长短不一的短链糊精和少量低聚糖，使淀粉糊粘度迅速下降，即为液化作用，故-淀粉酶又称为液化酶。因水解产物还原性末端葡萄糖的第一位C1的光学性质呈-构型，故称-淀粉酶。14-淀粉酶的用量与液化终点的判断-淀粉酶用量：中温-淀粉酶，6-8U/g淀粉；高温-淀粉酶，10U/g淀粉左右。液化终点的判断： 取2-3稀
7、碘液于小试管内，滴入液化后的料液2-3滴，显示浅黄色或浅棕红色为液化良好，紫色为一般，兰色为较差。15DE值：葡萄糖值，表示淀粉水解程度及糖化程度，指的是还原糖占干物质的百分率。DE=还原糖（%）/干物质（%）100%还原糖用斐林氏法或碘量法测定；干物质（可溶固形物）用阿贝折光仪测定。纯净的葡萄糖DE值为100%，DE值越高，水解越彻底，反之亦然。酶活力定义： 1毫升酶液于60，pH6.0条件下，1小时液化可溶性淀粉1克即为一个酶活力单位，以u/mL来表示。16-极限糊精：-淀粉酶作用于支链淀粉时，它可以任意水解-1，4键，但不能切开分支点的-1，6键，也不能水解-1，6键附近（1，2个）的-
8、1，4键，可以越过-1，6键而切开-1，4键，因此水解产物除麦芽糖、葡萄糖外，还有一系列-极限糊精，如下所示： 62-麦芽糖基麦芽三糖：表示葡萄糖残基 ：为还原性末端：表示-1，4键； ：表示-1，6键。17低温-淀粉酶：最适温度20-70，中温-淀粉酶：最适温度60-70，工作温度可达70-90由枯草杆菌BF7658、解淀粉芽孢杆菌BAA产生。高温-淀粉酶：85-115，由地衣芽孢杆菌产生。（最适pH范围pH5.5-7.0，有效pH范围5.0-8.0,最适 温 度 范 围 90-95， 有 效 温 度 范 围 90-100。在喷射液化工艺中瞬间温度达 105-110，仍能有效水解淀粉。）-淀
9、粉酶的种类18霉菌（真菌）-淀粉酶：50-55，由米曲霉或黑曲酶产生，它能从淀粉分子内部切开-1，4键生成各种寡糖，在长时间作用下，还可切开这些寡糖-1，4键而生成麦芽糖，麦芽糖含量可达50%，故又称麦芽糖生成酶，欧美用它制造高麦芽糖。酸性-淀粉酶，耐pH2-4，正在开发中（主要在酒精、焙烤、饲料中应用。）除酸性-淀粉酶外，其余-淀粉酶最适pH在6左右。19生淀粉酶n生淀粉酶：是一种包括-淀粉酶和糖化酶的复合酶，能将未经蒸煮糊化的生淀粉直接水解转化成葡萄糖等可发酵性糖供微生物生长与代谢， 它比传统的高温蒸煮糖化节约25%30%的能耗。n能产生生淀粉酶的有黑曲霉、米曲霉、宇佐美曲霉、少根根霉、爪
10、哇根霉、泡盛曲霉、青霉等。20n杰能科公司新近推出了 STARGENTM 001 n是一种生淀粉水解酶，适用于无蒸煮的低能耗工艺。n该酶含有 Aspergillus kawachii(白曲霉) alpha-amylase expressed in Trichoderma reesei and a glucoamylase from Aspergillus niger that function synergistically to hydrolyze starch into glucose.21耐高温 -淀粉酶n菌种：地衣芽胞杆菌 抗红霉素，菌落为乳白色n发酵培养基：玉米淀粉20%，豆粕5%，
11、玉米浆2%，硫酸铵0.5%，磷酸二氢钾0.5%，磷酸氢二钾 1.7%，柠檬酸钠0.2%；加高温淀粉酶液化，pH 6.26.4。n 发酵工艺：35t发酵罐发酵条件温度(421)，风量6.67-16.67 m3min，pH值6.46.8，培养时间80100h。n分批发酵酶活为8000-9000U/mL， 补料发酵酶活为14000-15000U/mL。22耐高温 -淀粉酶n 耐高温 -淀粉酶能随机水解淀粉、糖原及其降解物内部的-1，4葡萄糖苷键使淀粉溶液的粘度迅速下降，产生可溶性糊精和寡聚糖，过度的水解可产生少量葡萄糖和麦芽糖。 n用 途： 耐高温 -淀粉酶具有极好的耐热性，能广泛应用于淀粉、酒精、
12、啤酒、味精、酿造、纺织退浆等工业上。 n物理特性n外观：棕褐色液体 溶解性：易溶于水 n比重： 1.15-1.25g/mL23n化学物性 n钙离子对酶活稳定性的影响 :较低浓度的钙离子存在，对于淀粉的水解，推荐加入50-100ppm钙离子。 npH范围：5.5-7.0 最适6.0n温度范围： 90-95 n在喷射液化工艺中瞬间温度达 105-110，仍能有效水解淀粉。 n产品规格： n1、耐高温-淀粉酶为液体酶制剂。酶活力：20000U/mL（相当于丹麦Novo公司Termanyl-120L） n2、酶活力定义：1ml酶液在70 ，pH6.0条件下，1分钟液化可溶性淀粉的毫克数。 24中温-淀
13、粉酶n目前国内中温-淀粉酶生产菌种主要采用枯草芽孢杆菌BF7658和解淀粉芽孢杆菌BAA。n解淀粉芽孢杆菌BAA发酵酶活相对较高，34培养60-70h，酶活可达600-900U/mL；BF7658菌株，37培养36-48h，酶活300-400U/mL，而且液体酶有臭味，限制了中温-淀粉酶在食品行业中的应用，因此工业上使用BAA菌株较多。25中温 -淀粉酶n中温 -液化型淀粉酶系用枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis)经发酵提炼精制而成。 n用 途： 适用于酒精、啤酒、味精、发酵工业的液化以及纺织退浆等。 n产品特性： 物理特性 n外观：棕褐色液体 n溶解性：易溶于水 n比重： 1.
14、15-1.25g/mL26n化学物性 n热稳定性：需Ca2+150ppm，最适作用温度 60-70，在70-90之间，随着温度升高，其反应速度加快，但失活也加快，适用于最高达90的液化过程。 npH 6.0-7.0较为稳定；最适作用pH 6.0，pH5.0以下失活严重。 n产品规格： n1、中温-淀粉酶分为固体和液体两种剂型。 n固体分为 2000、4000u/g, 6000u/g 三种。液体为2000 u/mL。n2、酶活力定义；1ml酶液(1g酶粉)在60 ，pH6.0条件下，1小时液化可溶性淀粉的克数。272、-淀粉酶是一种外切型的淀粉酶，它从淀粉或低聚糖的非还原性末端，以以麦麦芽芽糖糖
15、为为单单位位，顺次水解-1，4糖苷键，并使切下的麦芽糖还原性末端葡萄糖残基构型转变为-型，故称为-淀粉酶。-淀粉酶广泛存在于大麦、小麦、玉米、大豆、甘薯等植物和一些微生物中，其中麦芽粉含量最高，大麦、小麦、大豆、麸皮也存在大量的-淀粉酶，甘薯含量稍低。微生物发酵法生产的-淀粉酶活力低，成本高。28-极限糊精-淀粉酶不能水解支链淀粉的-1，6键，也不能跨过分支点的-1，6键而切开内部的-1，4键，故水解支链淀粉是不完全的，水解在达到分支点-1，6键前2-3个葡萄糖残基时，它便停止不前，由于在生成50-65%麦芽糖时，就不再水解残留下来的大分子，称为-极限糊精。29-淀粉酶的提取n从植物中提取-淀
16、粉酶，添加一定量的还原剂可提高酶的提取率。因-淀粉是一种巯基酶，易与蛋白质形成二硫键而被屏蔽，此外，即使是游离的-淀粉酶，巯基也很容易与重金属盐(如Pb 2+、Ag+、Zn2+、Cu2+)作用生成难溶性硫化物沉淀，导致失活。为此，提取时常加EDTA等螯合剂以防重金属与巯基结合，添加 NaHSO3、Na2S03、L-胱氨酸、巯基乙醇等还原剂以防巯基氧化造成的酶失活。 n-淀粉酶可从麸皮、小麦、大麦中提取，也可从大豆提取蛋白质后的废水中，或甘薯制取淀粉的废水中提取。n大麦发芽第三天后-淀粉酶活力最大；-淀粉酶提取工艺：料液比1：17，温度44，pH6.4、提取时间2.3h，还原剂用量1.64g/L
17、；得到-淀粉酶活为1230.22U/g绝干麦芽。n黄豆粉中提取-淀粉酶工艺：料水比1:10,添加0.1mol/L NaCl，0.2%(w/v)烷基醇酰胺，0.5%(w/v)Na2SO3，50和pH 6.5下提取0.5h,-淀粉酶的产量为34.78U/mL。30来源大豆小麦大麦甘薯最适pH5.35.25.0-6.05.5-6.0稳定pH范围3.5-104.5-9.24.8-8.0最适温度()60-6550-5550-55等电点(pI)5.256.06.04.8淀粉水解率(%)65656565不同来源-淀粉酶的性质313、糖化酶（葡萄糖淀粉酶，Glucoamylase）n葡萄糖淀粉酶（EC 3.2
18、.1.3），俗称糖化酶。是一种外切型淀粉酶，能从淀粉分子非还原性端，依次水解-1，4糖苷键，切下葡萄糖单位，也能水解支链淀粉分支点的-1，6键，但水解速度慢，仅及水解-1，4的1/10。n糖化酶可由黑曲霉(Aspergillus niger)优良菌种经液态发酵提取而成。该酶的最适温度：60，最适pH 4.0-4.5。糖化酶加量:生产上多采用30%淀粉乳，用量为100-200U/g淀粉左右。32糖化酶发酵工艺n1级罐5M3; 2级罐10M3; 发酵罐径高比为1:2.5，3档6弯叶机械搅拌，转速187r/ min ,发酵罐容积30M3。n一级种子培养基：玉米淀粉16%, 豆饼粉4.4 % ,玉米浆
19、2 % ,营养膏0.1%,定容2M3。n二级种子培养基：玉米淀粉 25%,豆饼粉3.6%,玉米浆1.5%,营养膏0.1%,定容5M3。n发酵培养基： 玉米淀粉33 % ，豆饼粉4%，玉米浆1.5%， 硫酸铵0.5%，定容17M3。n补料方法：中后期一次性补入。n控制条件：培养温度：3435；风量控制(v/v)：前期1：0.4，中期1:0.60.8，后期1:0.4；pH范围:4.34.7，通液氨维持pH4.7。发酵时间135hn发酵产酶活力3.54.0万U/mL。33高转化率糖化酶n由糖化酶与普鲁兰酶复配组成，可提高葡萄糖浓度，加快糖化水解速度。 n用 途：广泛用于生产白酒、黄酒、酒精、啤酒、乳
20、酸钙作糖化剂；用于以葡萄糖作发酵培养基的各种抗生素，有机酸、氨基酸、维生素的发酵，还大量用于生产各种规格的葡萄糖。 34n产品特性 :物理特性 n外观：浅褐色液体 n溶解性：易溶于水 n比重： 1.08g/ml n化学物性 n最适作用温度： 58-60 n最适作用 pH：4.0-5.0 n产品规格： 糖化酶为液体酶制剂。酶活力： 100000U/mL; 110000U/mL,120000U/mL（AMG400） n 酶活力定义； 1mL酶液在40，pH4.6条件下，1小时内分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖的酶量为1个酶活力单位（U） 35糖化终点的判断糖化终点判断：由于只有葡萄糖溶于无水酒精，麦
21、芽糖微溶，其它糖（如寡糖、糊精）不溶，所以糖化终点通常以无水酒精检测无白色反应，即为糖化终点。糖化酶含少量葡萄糖苷转移酶（将游离的葡萄糖转移到其它葡萄糖残基的-1，6和-1，3位，而生成各种寡糖，如非发酵性的潘糖、异麦芽糖等），对淀粉的糖化有重要影响，会降低淀粉糖转化率，应设法去除。364、脱枝酶(Debranching enzyme)：是一类切开支链淀粉或糖原等大分子化合物中的-1，6键的酶，是一种内切型酶。脱枝酶作用于淀粉时，随着解枝作用的进行，淀粉对碘的呈色反应由红色变蓝，还原力增加，在丁醇中发生沉淀，淀粉容易老化（发生浑浊），表现出直链淀粉的特性。37脱枝酶可分为2种即普鲁蓝酶和异淀粉
22、酶。（1）普鲁蓝酶（Pullulanase）：能水解普鲁蓝多糖的-1，6键，可水解支链淀粉、-极限糊精，-极限糊精的-1，6键，但几乎不作用分支密集的糖原-1，6键。该酶可由酸性解普鲁蓝芽孢杆菌生产。普鲁蓝多糖:微生物产生的由麦芽三糖通过-1，6结合成的线性结构多糖 普鲁蓝酶 ( )n ( )n （2）异淀粉酶（Isoamylase）：它只对支链淀粉和糖原的-1，6键有专一性，而对普鲁蓝多糖的-1，6键无作用。该酶可由产气杆菌生产。38（1）作用的底物有差别普鲁蓝酶可水解普鲁蓝多糖、支链淀粉、-和-极限糊精，最好的底物是小分子的寡糖，几乎不能作用糖原。异淀粉酶对分之密集的糖原或支链淀粉容易水解
23、，也可水解某些分支的麦芽糊精个寡糖的-1，6键，但不能水解普鲁蓝多糖的-1，6键，-极限糊精，最好的底物是高分子的多糖。（2）两种酶所作用的最小底物不同普鲁蓝酶水解的最小底物是62-麦芽糖基麦芽糖（OO OO） 异淀粉酶所能水解的最小底物是63-麦芽糖基麦芽四糖普鲁蓝酶与异淀粉酶的区别39n1983年NOVO公司生产，由酸酸性性解解普普鲁鲁蓝蓝芽芽孢孢杆杆菌菌（Bacillus acidopullulyticus）生产的具有耐热、耐酸特点的普鲁兰酶。nPromozyme 400L（普鲁兰酶）n标示活性： 400PUN/mln最适温度： 50-65n最适pH： 4.0-5.5n用量： 1-2.5
24、L/吨原料（麦芽和辅料），或0.1-0.15L/吨冷麦汁。n添加地点： 糖化锅，投料五分钟后加入，或发酵开始时与冷麦汁一起加入发酵罐中。n主要作用： 切断支链淀粉和糊表的分支点，增加可发酵性糖含量，提高啤酒的发酵度。40商品普鲁蓝酶的要求n普鲁兰酶必须具有有以下三种特性的脱枝酶:耐酸性(工作pH4.5)；热稳定性工作温度60；适合于食品生产。41普鲁兰酶生产n1983年NOVO公司生产，由酸酸性性解解普普鲁鲁蓝蓝芽芽孢孢杆杆菌菌（Bacillus acidopullulyticus）生产的具有耐热、耐酸特点的普鲁兰酶。nPromozyme 400L（普鲁兰酶）n标示活性： 400PUN/mln
25、最适温度： 50-65n最适pH： 4.0-5.542普鲁兰酶发酵生产n 将Bacillus naganoensis(ATCC53909)克隆得到的普鲁兰酶基因片段与表达载体pPIC9K连接，构建表达载体pPIC9KPullulanase, 经Sac I线性化后电穿孔法电击转化重组酵母表达载体pPIC9K-Pullulanase转化到表达宿主酵母SMDll68，用G418平板筛选阳性转化子，在含有4mgmL的G418平板上，出现了若干个转化予，随机取其中102个转化子进行发酵，测定酶活，酶活最高的一转化有重组酵母表达载体pPIC9K株,发酵单位可达350.8U/mL，命名为SMD-Pullul
26、anase P8，是原始出发菌株(2.7U/mL)的129.9倍，通过对重组毕赤酵母P8发酵工艺优化，在30，甘油培养基培养48h后，补料添加甲醇和甘油诱导培养48h，5批次的诱导表达实验，普鲁兰酶活平均值为507.32.8U/mL。43普鲁兰酶在啤酒中的使用n添加地点： 糖化锅，投料五分钟后加入，或发酵开始时与冷麦汁一起加入发酵罐中。n主要作用： 切断支链淀粉和糊表的分支点，增加可发酵性糖含量，提高啤酒的发酵度。44普鲁蓝酶的应用n（1）高葡萄糖浆：由于糖化酶对-1，6键水解速率很低以及糖化酶中-转苷酶催化葡萄糖生成异麦芽糖的聚合反应，因此在糖化过程中加入普鲁蓝酶，普鲁蓝酶与糖化酶协同作用，
27、可有效地提高淀粉的水解率；可降低糖化酶的用量、缩短反应时间；可提高淀粉乳的浓度。n（2）高麦芽糖浆：大豆-淀粉酶不能水解淀粉中的分枝链，有许多-极限糊精不能分解，淀粉的最大转化率不超过30%。如果添加普鲁蓝酶，可作用于DE5的30%淀粉乳液化液，可得到80%以上的超高麦芽糖浆。n（3）干啤:普鲁蓝酶能降低麦汁中-极限糊精的含量，增加可发酵性糖的含量，从而大幅度提高发酵度，制造干爽啤酒，一般在糖化阶段添加普鲁蓝酶。n（4）生产抗消化淀粉(resisant starch，enzyme-resistant starch，RS)，又称抗酶解淀粉，指不能在人体小肠中消化吸收，但在结肠内可被微生物发酵利用
28、的淀粉。n（5）其他：直链淀粉，环糊精等生产。455、环状糊精葡萄糖苷转移酶（环状糊精生成,Cyclodextringlycosyltransferase，CGTase）n催化淀粉通过分子内葡萄糖基转移反应（环化反应）而生成由612个D-吡喃葡萄糖基以-1,4-葡萄糖苷键连接而成的环状n低聚糖环糊精 (Cyclodextrin, CD），在有适当受体（如蔗糖或葡萄糖）存在下，它可以通过分子间葡萄糖基转移反应将葡萄糖从一个-1，4葡聚糖或CD转移到受体分子上（偶联反应或歧化反应），还可以水解-1，4-葡聚糖或CD。46n5、环状糊精葡萄糖苷转移酶（环状糊精生成酶，CGTase）n（1）分子内葡萄
29、糖基转移反应n当CGTase作用于淀粉时，非还原性末端一侧的某些-1，4键上发生分子内葡萄糖基转移反应而生成聚合度为6-8的环状糊精（同时淀粉溶液粘度下降，碘反应减弱，呈内切型淀粉酶反应）。n淀粉、-CD。n-CD 6个葡萄糖构成的环己直链淀粉。n-CD 7个葡萄糖构成的环庚直链淀粉。n-CD 8个葡萄糖构成的环辛直链淀粉。47n（2）分子间葡萄糖基转移反应（偶联反应）n当有淀粉以外的适当受体糖类存在时，可发生分子间的葡萄糖基转移反应（偶联或歧化反应），将形成的环糊精裂开而转移到受体糖分子C4的OH上，形成新的-1，4键（可作为受体的糖类有葡萄糖、D-木糖、山梨糖、蔗糖、葡萄糖的C1衍生物）n
30、CGTasen-CD+-n打开环糊精，将其偶联到其它糖上（偶联作用）n歧化作用，在低聚糖分子间进行转移nCGTaseCGTaseGn+2GnG2n-2+Gn+2或Gn+GnGn+1+Gn-148n（3）水解作用nCGTase可水解淀粉和CD生成麦芽糊精，但水解能力很小，只占总催化能力的2-8%。n H2On如-CD -n CGTasen嗜碱芽孢杆菌的CGTase，由淀粉主要生成-CD，最高得率可达80%，n软化芽孢杆菌的CGTase，主要生成-CD，49环糊精性质n环糊精由6-12个葡萄糖单位通过-1，4键连接而成的环状化合物，无还原性末端，能抗外切型淀粉酶（糖化酶）的水解作用。环糊精只能被-
31、 淀粉酶水解而不能被- 淀粉酶水解。50不同种类环糊精的性质种类葡萄糖单元数分子量室温下水中溶解度(g/100ml)空腔直径( )外圆周直径()-环糊精697214.51500.54.705.3014.60.4-环糊精711351.85162.50.56.006.5015.40.4-环糊精8129723.2177.40.57.508.3017.50.n-CD在水中的溶解度最小，-CD在水中的溶解度最大。51不同微生物来源的CGTase的性质52酶法生产环糊精n常用于工业化生产的菌种一般有嗜热脂肪芽胞杆菌、嗜碱脂肪芽胞杆菌、软化芽胞杆菌等。环糊精的生产过程通常包括以下几个主要阶段：n菌种的筛选、
32、培养，CGTase的制备(分离、纯化、浓缩、粉体化)；n将淀粉水解为环状；n环糊精的分离、纯化与结晶。n制备环糊精的底物原料包括玉米淀粉、马铃薯淀粉、木薯淀粉等，不同的原料环糊精的收率不等。53制备CGTasen制备CGTase 的培养基和培养条件因菌种而异。n软腐芽孢杆菌产酶培养基：玉米浆1%、可溶性淀粉1%、(NH4)2SO4 0.1%、CaCO3 0.3%，用豆油为消泡剂，pH5.06.0、37培养70h，主要产物是-环糊精；n巨大芽孢杆菌：麸皮1%、蛋白胨1%、玉米浆1%、可溶性淀粉4%、干酵母0.5%，37振荡培养70h，主要产物为-环糊精；nKlebsiella oxytoca 1
33、9-1：可溶性淀粉1.0%、蛋白胨1.0%、K2SO4 0.1%、MgSO47H2O 0.02%，pH7.0、37培养90h；nBacillus stearothermophilus R2：复合胨0.5%、酵母膏0.5%、K2SO4 0.1%、MgSO47H2O 0.02%、葡萄糖0.5%、谷氨酸0.1%，pH9、60培养72h；nBacillus circulans：牛肉膏0.5%、蛋白胨1.0%、NaCl 0.2%、酵母膏0.2%、可溶性淀粉1.0%，pH7.2；n含有质粒pCGT3的Bacillus subtilis NH-1产-CGTase 的培养基：可溶性淀粉1.0%、蛋白胨5.0%
34、、酵母膏5.0%、K2SO4 1.0%、MgSO47H2O 0.2%。54环糊精的生产工艺流程 将CGTase 加入15%的淀粉悬浮液(含10mmo1/L CaCl2、pH8.5)中，于8590液化30min，冷至6065后，在糊化淀粉溶液中加入Ca(OH)2，再次调节pH 至8.5，再加入适量的CGTase，继续于60进行环化反应3045h，升温至100使酶失活，再冷却至80，调pH至6，用糖化酶将未转化的淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖，水解液经活性炭和离子交换树脂处理后，减压浓缩至45%60%(w/V)， 低温放置，收得纯度大于98%的-环糊精结晶，分离出-环糊精后的母液经离子交换柱分级分离和凝
35、胶过滤，分离出其中的-环糊精和-环糊精，再通过一个精制系统，可直接得到-环糊精结晶和-环糊精结晶。55n现已报道的绝大多数CGTase 作用淀粉后的产物为、和 - 环糊精的混合物，绝大多数以 - 环糊精为主，极少有产生单一环糊精的。n根据物理性质的差异来分离的，其中-环糊精在水中的溶解度最小，只要对发酵后的淀粉悬浮液进行浓缩，-环糊精就会以结晶态沉淀出来。n另一种方法是用有机溶剂络合，由于、 - 环糊精所含的葡萄糖残基数不同，内部孔径不同，可以与不同分子大小的有机络合剂相结合，生成不溶的络合物而从反应体系中分离出来。n应用甲苯和三氯乙烯可分离-环糊精，应用乙醇可增加-环糊精的产量，应用葵醇可分
36、离-环糊精。随着先进设备的应用及生产工艺的改进，环糊精的分离方法会越来越成熟。56n环糊精在酸、碱中稳定，能在水或有机溶剂中结晶析出，它的立体结构呈中空圆筒状，中间空隙半径约6-10，内侧具疏水性，从而改变被包接物的性质，如溶解度、挥发性、化学反应性等，有以下用途：（1）稳定香料、防止挥发（2）作为抗氧化剂、抗光热分解剂（3）作为药物或生理活性物质的缓释剂（4）用作除臭剂（掩盖剂）、乳化剂、色谱柱载体（5）食品、药物上脱苦以及用于增加化合物的溶解度。57环状糊精的结构特点n环状糊精，是白色结晶性粉末，溶于水，难溶于乙醇和丙酮，是一类由6个以上（常为6、7、8个）葡萄糖分子首尾相连而形成的环状低
37、聚糖，具有十分奇特的空间结构圆筒形的空心结构，由于其空腔内外“壁”上还“挂”有许多葡萄糖分子上的不同基团，故使环状糊精空腔的内外具有完全不同的性质：外表具有亲水性，内表具有具疏水性、亲油性。这样，通过其“两面性”，为难以共溶的油和水之间架设了一座“桥梁”，从而表现出神奇的妙用。58n在环糊精的分子结构中，由于葡萄糖的2位和3 位仲醇羟基位于截锥体的下面开口和外部，6位的伯醇羟基位于截锥体的上面开口，使环糊精分子外部亲水；同时6 位的-CH2- 和葡萄糖甙结合的氧原子排列在空隙的内部，呈疏水性。这种性质与表面活性剂相似，故可起乳化剂的作用.59环状糊精的应用（1）清凉剂：将具有清凉解渴、消暑解乏
38、、焕发精神等特殊功效的薄荷油与环状糊精混合并进入到其空腔里去，可解决因薄荷油难溶于水而无法配制薄荷饮料的难题，从而成功地为薄荷在冷饮及其它食品中的应用展现了可喜的前景。n（2）留香剂：将香料预先包络在环状糊精的空腔内后，可使散发花香的时间比天然花香长好几倍到几十倍，从而可以非常理想地作为塑料花朵的涂料以及化妆品、日用品以至食品的渗和留香剂。60环状糊精的应用n（3）除臭剂：环状糊精还可以把某些有臭气的物质包络起来，起到除臭作用。如有一种名叫“5氟脲嘧啶”的抗肿瘤口服药，气味难闻，但在经与环状糊精掺和后，难闻的气味就被掩盖了。n（4）缓释剂：“拟除虫菊酯”是近年发展起来的一种药性高、对人畜毒性低
39、、使用安全的农药，但它在农田中容易受紫外线的作用迅速分解而失去药效，在经与环状糊精掺和后，就可使药性缓慢释放，药效大大延长。n（5）保护剂：用无色、无味、可食的环状糊精喷洒于某些易氧化而引起变质的蔬菜、食品等表面可抵挡住光线对它们的氧化、分解作用而达到保鲜、保色、保味、延长存放时间的目的。61n麦芽低聚糖是以淀粉为原料而制成的由2-10个葡萄糖分子聚合而成的糖，以-1，4键结合的直链麦芽低聚糖有麦芽三糖（G2）、G3、G4、G5、G6、G7、G8、G8、G10。n近年来由微生物来源只生成麦芽低聚糖的特异性酶相继被发现，如：n灰色链霉菌NA468 可分泌麦芽三糖酶n施氏假单胞菌NRRLB3389
40、 可分泌麦芽四糖酶n地衣芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌 可产生麦芽五糖酶n高温根霉 G3-G7n麦芽低聚糖的功能性：是一种能延长供能、强化机体耐力和作功能力、易消化吸收、低甜度、低渗透压的性糖原。l麦芽寡糖生成酶62麦芽三糖n麦芽三糖的甜度约是蔗糖的30%。n其最大特征是非结晶状态和强大的保湿性能，具有防止淀粉老化的作用。因此，经常用于制作需要保留水分的糕点中。n 形成麦芽三糖的淀粉酶AMT1.2L是一种由微小杆菌（Microbacterium imperiale）菌株，通过发酵培养并精制而得的酶制剂。n 是一种能优先生产麦芽三糖的内切型maltotriohydrolase(EC 3.2.1.116
41、)。水解直链淀粉糖、支链淀粉糖、糖原、淀粉主要生成麦芽三糖。对普鲁兰不起作用。n 最适pH为pH6.5, 最适温度为45。n淀粉糊精化活力AMT 法 pH6.0 1200u/ml 以上n避免日光直射、10以下冷藏密闭保存。63nMaltotetraohydrolase 麦芽四糖nMALTOPENTAOSE 麦芽五糖64n-葡萄糖转苷酶（-glucosidase , EC3.2.1.20)又名葡萄糖苷转移酶，简称-糖苷酶，具有水解和转糖苷双重作用，它能切开麦芽糖、麦芽三糖或麦芽低聚糖分子结构中的-1，4糖苷键，并能将游离出来的一个葡萄糖残基转移到另一个葡萄糖分子或麦芽糖、麦芽三糖等分子中-1，6
42、位上，形成异麦芽糖（IG2）、异麦芽三糖（IG3）、异麦芽四糖（IG4）、五糖（IG5）和潘糖（P）等。n + -葡萄糖转苷酶葡萄糖转苷酶65-糖苷酶是以淀粉为原料生产低聚异麦芽糖（双歧杆菌增殖因子）的关键酶，1982年由日本林原生化科研所开发出-糖苷酶，1985年开始生产异麦芽低聚糖，年产1万吨。66转葡萄糖苷酶 L Transglucosidase L (TGL)的性质 n转葡萄糖苷酶 L Transglucosidase L (TGL) n由黑曲霉（Aspergillus niger）生产n 最适温度：55-60 （pH 5.0）n 最适pH 5.0-5.5n pH5.0时，产品酶活为3
43、00,000 u/ml n一种特殊的具有良好货架寿命的液体,用于生产低聚异麦芽糖浆,该酶作用于麦芽糖、麦芽三糖等含有-1,4键的低聚糖，通过转糖苷作用生成含有-1,6键的异麦芽糖、潘糖和其它带分枝的低聚糖 67转葡萄糖苷酶反应所生成的产物68n日本天野制药株式会社所生产的转苷酶（Transglucosidase, GTase）由黑曲霉产生, 酶活为3105U/ml，使用量1L/吨淀粉。n该酶的最适pH 5.5，温度 55， 反应时间：12-20h69n以淀粉为原料，用-淀粉酶液化，再用-淀粉酶糖化，同时用葡萄糖苷转移酶转化麦芽糖成为低聚异麦芽糖（IMO），再经脱色、脱盐浓缩而成，制造工艺如下：
44、n耐高温 -淀粉酶 -淀粉酶(2-4g/Kg淀粉)n30%淀粉乳喷射液化液npH6.0（105DE=12-17）或真菌淀粉酶n糖化转苷（糖化转苷（pH5-6pH5-6，50-50-6060）n糖化（麦芽糖75%）粗制品藻土过滤（反应20h，葡萄糖苷转移酶，1L/吨淀粉)n活性碳脱色阴阳离子树脂混合床离交n脱盐糖浆真空浓缩（75%成品）IMO50糖nn浆喷雾干燥IMO50糖粉n分离葡萄糖麦芽糖IMO9070nIMO-90产品可采用“微生物分离法”、“色谱分离法”和“纳滤分离法”三种高效分离技术生产。71IMO 的应用nIMO 具有促进人体肠道有益菌群增殖,防龋齿,利于维生素和矿物元素吸收,增强机
45、体免疫力等良好生理功能；同时还具有低甜度、耐热、耐酸、良好的保湿性及低水分活度等优良物化特性。IMO 作为一种健康糖源和一般食品添加剂广泛应用于食品工业中:n (1) 饮料:果蔬汁饮料、茶饮料、豆奶、含酒精饮料、乳酸菌饮料、粉末速溶饮料等; n(2) 乳制品:婴儿奶粉、鲜乳、调味乳、发酵乳等; n(3) 糖果、糕点:高级奶糖、口香糖、泡泡糖、各种中西式糕点等; n(4) 冷饮、果酒、葡萄糖、果酱、蜂蜜加工品、焙烤食品等。nIMO-50和IMO-90产品经生理功能试验，都具有显著的改善肠功能和润肠通便作用。IMO-90的功效更好，而且适合糖尿病人食用。在“脑白金”“乐百氏”“娃哈哈AD钙奶”“昂
46、立”“盐水瓶口服液”等保健品和众多高档食品中得到广泛应用。 72海藻糖n 为一种天然二糖：在许多生物中均有发现（但含量极微），海藻糖是2分子葡萄糖以1，1结合的非还原性二糖。n，-型，即为海藻糖；，-型，为新海藻糖；，-型为异海藻糖。n ， -1, 1-糖苷键非常稳定，耐高温、耐酸碱， 非特异性地保护生物大分子。n海藻糖的甜度是蔗糖的半左右，但与蔗糖不同的是，它的甜味爽口，不留后味（口感变酸）。n海藻糖在冻结、干燥脱水、高渗透压等这类严酷的环境下，对生物体膜、膜蛋白、DNA等具有保护功效， 在医药、食品、农业、化妆品工业等有广泛用途。 被称为“生命之糖”。73海藻糖的结构74海藻糖：目前的主要
47、生产方法目前能够进行规模生产的方法有：n 干酵母提取法n 微生物发酵法n 酶转化75干酵母提取法活性干酵母热乙醇水溶液提取冷却、离心上清液活性碳趁热脱色浓缩串联阴阳离子交换加热真空浓缩结晶脱水、干燥海藻糖成品原料问题、有机溶剂、产率较低（510）、成本较高（海藻糖酶）76微生物发酵法：培养高海藻糖酵母，从酵母中提取 腹孢膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera)30oC发酵发酵4850小时小时海藻糖在微生物细胞内积累达到细胞干重的16%18%产量较低：约为每吨发酵液产海藻糖2020千克左右例如：77酶转化法n 1990年首先被意大利那不勒斯第二大学的M. De Rosa小
48、组发现；改变了有史以来科学家论断：（1）不可能从淀粉转化成海藻糖；（2）自然界不可能存在不需要消耗ATP的海藻糖合成途径。即“微生物的提取物能将淀粉水解物转化为海藻糖”这一现象是意大利人发现的，并于1990和1991年发表了论文（他们没有申请专利！）78酶转化法分为两种：双酶法和单酶法 Two-enzymes system（双酶法）双酶法）: :以淀粉为原料以淀粉为原料n麦芽寡糖基海藻糖合成酶 (MTSase) and 麦芽寡糖基海藻糖基海藻糖水解酶 (MTHase)；nSingle-enzyme system（单酶法）：单酶法）：以麦芽糖为原料（可由淀粉水解产生），海藻糖合成酶 (Tres)
49、；n 这两种酶系在自然界的微生物中广泛存在：目前至少有15各菌属含有上述酶。79双酶法双酶法Scheme of trehalose production by MTSase and MTHase.FromT.Higashiyama,Novel functions and applications of trehalose,Pure Appl. Chem.,Vol.74,No.7,pp.12631269,2002.lDiscovered by L. Lama et al. Biotechnol. Lett. 12:431432, 1990l Gene cloning by Hayashibara
50、 & Kirin, in 1995199680n. - - - - -n 麦芽低聚糖n MTSasen . - - - - n 低聚麦芽糖基海藻糖n MTHasen . - - - + （海藻糖）n n 葡萄糖残基， ：含还原端的葡萄糖残基，n ，-1,1葡萄糖苷键81n从土壤中分离得到能从淀粉的部分水解物生成海藻糖的微生物，这种微生物能产生两种酶，一 种 是 低 聚 麦 芽 糖 基 海 藻 糖 生 成 酶（ Maltooligosyl Trahalose Synthase简 称MTSase），n能作用于淀粉的部分分解物，在其末端生成具有海藻糖结构的非还原性糖质。n另 一 种 是 低 聚 麦
51、芽 糖 基 海 藻 糖 水 解 酶（Maltooligosyl Trahalose Hydrolase简称MTHase）。n能从上述的非还原性糖质特异性地水解出游离海藻糖。通过这两种酶的协同作用，就能从淀粉的部分水解物连续地生成海藻糖。82n淀粉酶法（双酶法）生产海藻糖工艺流程：淀粉酶法（双酶法）生产海藻糖工艺流程：n淀粉n耐热性-淀粉酶n液化液n异淀粉酶、MTSase、MTHasen糖化n40,20hn精制n脱色（活性碳）n过滤n脱盐n过滤n浓缩、结晶n海藻糖浆、无水结晶海藻糖、含水结晶海藻糖83 酶对底物的转化率酶对底物的转化率Two-enzymes systemStarchLiquefi
52、ed StarchIsoamylaseDe-brached Liquefied StarchMTSase80% conversion rateMTHase80% conversion rate终产品：海藻糖终产品：海藻糖Thermostable a a-amylase双酶法：两步的转化率都是708084单酶法单酶法 麦芽糖麦芽糖 海藻糖海藻糖Trehalose Synthaseke 可由褐色喜热裂孢菌可由褐色喜热裂孢菌T. fusca产生产生(Nishimoto T, et al. Biosc. Biotechnol. Biochem. 1995, 59:2189-2190) 85海藻糖不同的
53、生产方法比较方方 法法技术成熟年份技术成熟年份成本成本干酵母提取法干酵母提取法 1990 高高其他微生物发酵法其他微生物发酵法1 2005 高高双酶法双酶法 (MTSase & MTHase)2 1997 低低单酶法单酶法 (Tres) 3 2000 低低海藻糖磷酸化酶法海藻糖磷酸化酶法4 2008 低低1. Chi ZM, Liu J, Zhang W, 2001, Enzyme Micro. Technol. 28:240-245（山东大学池振明小组）（山东大学池振明小组）2. Nakada T, etal. Biosc. Biotech. Biochem .60 (1996):2633.
54、 Nishimoto T, et al. Biosc. Biotechnol. Biochem. 1995, 59:2189-21904. Klimacek M, et al, 1999, Biotechnol. Techniques, 13:243 86酶转化法：国外情况 n日本林原研究所：年产3.0万吨n美国Cargill公司：预计年产5.0万吨生产线近期建成87酶法转化：国内情况n广西南宁中诺生物工程有限公司：已建好年产500吨生产线。2006年9月前建成3000吨生产线；在2008年建成2万吨生产线。88酶转化法：可降低成本的一些环节一、酶制备 天然酶：产酶量较低，提取也较困难。如果用
55、固定化细胞的方法则酶的密度过低。提高酶产量的方法有：常规诱变育种、基因组改组（genome shuffling）。 基因工程酶：产酶量通常是天然菌的数千乃至数万倍。 89n 酶的费用可占海藻糖生产总成本的1/20到1/10。n 解决办法：固定化酶。实验表明可重复使用达60次以上90n 二、酶反应时间 通常是4872小时。太长。解决办法：（1）、提高反应温度：从30oC提高到45oC，反应达到平衡时所需时间可以从48小时缩短到2428小时，但提高温度会导致逆反应的增强： 30oC: 麦芽糖 海藻糖45oC：麦芽糖海藻糖（22）（78）（30）（70）91n 三、酶的转化率 目前国内外的酶法生产海
56、藻糖其转化率只有7080左右 底物浪费 增加分离单元 成本增加显然，提高转化率可以大幅度降低成本。解决办法：蛋白质工程 酶分子改性 92n 四、降低能耗 糖液浓缩过程 结晶过程 干燥过程耗能的成本可以占海藻糖生产总成本的101593Single-enzyme system Maltose TrehaloseTrehalose Synthase(Nishimoto T, et al. Biosc. Biotechnol. Biochem. 1995, 59:2189-2190) (20%)(80% trehalose)Enzyme Tres can not shift the reaction
57、equilibrium, and it can only speed up the reaction. So when enzymatic reaction reaches the equilibrium point, there are always 20% maltose and 80% trehalose.反应达到平衡时的各组分比例94Optimal temperatureOptimal pHConversion rateGlucose has strong inhibition褐色喜热裂孢菌T. fusca海藻糖合成酶的性质95n 海藻糖生产车间一角海藻糖生产车间一角n 用木薯淀粉作为
58、出发原料（已用木薯淀粉作为出发原料（已申请专利）申请专利）962千克包装20千克包装97出口包装出口包装98TheleadcontentThearseniccontentTrehaloseSpecsbyHayashibara99TrehaloseSpecsbySinozymeNanning广西南宁中诺生物工程有限责任公司LeadArsenic100Thetestresultsshowthatourproductcontains100250timeslessheavymetalsthantheonebyHayashibara101102103n1994年日本林原生物化学研究所首先确立了以淀粉为原
59、料，酶法糖化生产海藻糖的新方法，使得海藻糖能够大量而较廉价地工业化生产。n1995年11月，高纯度98%以上的海藻糖含水结晶正式上市，售价从2-3万日元/Kg，下降到350日元/Kg，使得海藻糖在医药、化妆品、食品工业能够广泛应用。104海藻糖级别价格（元/公斤）食品级65医药级结晶400高纯度无水680105n医药：可作为淋巴、激素、疫苗、抗生素、维生素、酶等各种生物制品的稳定剂或品质改良剂。作为活菌制剂（双歧杆菌）的稳定剂，可提高效价，延长其货架周期。n分子生物学：用海藻糖干燥抗体、血小板、酶、病毒等生物活性物质，无需冷冻保存，复水后均能恢复活力。n化妆品：海藻糖的硫酸衍生物可用于化妆品的
60、洁肤剂、皮肤保湿剂、紫外吸收剂、口红、唇膏的品质改良剂。106海藻糖在食品工业中具有广阔的应用前景n海藻糖能很好地防止蛋白质在冷冻、冷藏或干燥时变性。在含蛋白质的各种食品中加入海藻糖，能非常有效地保护蛋白质分子的天然结构，使食品的质地和风味保持不变。 n海藻糖具有优异的防止淀粉老化作用。应用于面、饼、米饭、烤肉佐料酱、炸肉饼等含有淀粉的食品中会有效地提高这些食品的风味与口感水平。这种效果在低湿或冷冻条件下表现得更为突出。 n脂类物质受氧化分解会产生过氧化物和挥发性醛等物质，使食品风味劣变而失去食用价值。几乎所有的食品都含有脂质，海藻糖对油脂成分中的脂肪分解的抑制率高达 70以上，具有良好地抑制
61、脂质酸败的效果。n 海藻糖可在动植物组织和细胞失水时，代替组织或细胞中水分的作用，有效地保护组织和细胞结构不受干燥和冷冻的破坏，从而维持它们的生命过程或生物特征。因此，对蔬菜、肉类、水果的保鲜非常有效。如水果、蔬菜浓浆、番茄浆等物质中添加海藻糖，由于海藻糖可在干燥过程中很好地保护其细胞结构，因此其复水后其味道新鲜如初。 n食品中的一些令人不快的异味主要是由挥发性醛类、乙基硫醇和三甲胺三大类物质构成，加入海藻糖可有效地抑制异味的生成。如在鱼类食品加工过程中，如在加热前加入海藻糖就能抑制三甲胺（腥味的主要成分）的生成，降低腥味的产生。此外，在加工过程中添加适量海藻糖，就能很好地减轻鸡、鸭、鹅肉等的
62、怪味。 107葡萄糖异构酶（Glucose Isomerase）又称木糖异构酶（EC5.3.1.5），可将木糖、葡萄糖、核糖等醛糖转化为相应的酮糖，由于葡萄糖异构化为果糖具有重大经济价值，故工业上习惯把木糖异构酶称为葡萄糖异构酶。 果糖是棱柱状晶体，熔点103105，是所有的糖中最甜的一种，它比蔗糖甜一倍，以游离状态大量存在于水果的浆汁和蜂蜜中，广泛用于食品工业，如制糖果、糕点、饮料等。果葡糖浆的甜度与蔗糖相当。108葡萄糖异构酶的性质：n用米苏里游动放线菌AC812、嗜热链霉菌M1033等微生物发酵法生成的酶经固定化制得，近白色或浅棕黄色颗粒，柱状或条状。（1）大多数微生物异构酶需Co2+、
63、Mg2+，才表现活力。Mg2+是表现酶活所必需的；Co2+是酶热稳定性所必需的。最高活性在反应系统中需要有Mg2+及Co2+,其最适浓度分别为10-2mol/L和10-3mol/L。但Hg2+、Ag+、Pb2+、Zn2+、Ni2+、Cu2+、Al3+、Ca2+、Fe2+对酶活有不同程度的抑制；酶也受到一些糖醇的抑制，如山梨糖醇、甘露糖醇、阿拉伯糖醇、戊糖醇，木糖醇对异构酶的抑制最为强烈。（2）温度、pH对酶反应的影响 大多葡萄糖异构酶对热很稳定，最适作用温度60，适用温度3075。最适作用pH7.07.5，适用pH6.08.0。其催化反应是吸热反应，果糖的生成量随温度而增加，工业上采用60，底
64、物葡萄糖浓度一般是35-45%,葡萄糖含量93%97%，进口处pH8.2（25），温度61，MgSO47H2O添加量0.1g/L糖浆。 109葡萄糖异构酶产生菌n米苏里游动放线菌（Actinoplanes missouriensis）n嗜热链霉菌 (Streptomyces thermoviolaceus)n凝结芽孢杆菌（Bacillus Coagulans）n橄榄色链霉菌（Streptomyces Oliuvaceous；Streptomyces Olivochromogenes)。n锈霉链霉菌（Streptomyces rubiginosus)、n紫黑链霉菌（Streptomyces Vi
65、olaceoniger）等,制备成固定化葡萄糖异构酶110果葡糖浆的生产及技术（1）糖液纯度要高，不存在不溶性淀粉颗粒，DE值93%以上，除去糖液中的Cu2+、Fe2+等杂质，Ca2+控制在1mg/Kg以下，异构化反应保持较好的稳定性。（2）糖液浓度要高，异构化前，糖液浓度由30%浓缩到35-45%。（3）添加激活金属离子 MgSO4.7H20 0.1Kg/m3.（4）糖液pH控制在7.5，温度60恒温下进行。果糖含量达到42%，经脱色、离交、色谱分离(模拟移动床)、真空浓缩制成不同果糖含量的糖浆。n诺维信葡萄糖异构酶 IT （Sweetzyme IT）在其使用寿命期间内每公斤酶可生产至少15
66、,000公斤（干物）的糖浆。111葡萄糖异构酶的应用112葡萄糖氧化酶（Glucose oxidase，简称GOD，EC1.1.3.4）在氧存在下，它催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，并生成过氧化氢，同时产生的过氧化氢酶分解H202为水和氧气，解除H202对微生物的毒害作用。葡萄糖氧化酶葡萄糖氧化酶2葡萄糖+2O22葡萄糖酸+2H2O2过氧化氢酶过氧化氢酶2H2O22H2O+O2 每moL葡萄糖氧化酶蛋白含2moL黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）。发酵法生产的葡萄糖氧化酶，同时存在这两种酶，对工业应用来说是，2种酶不需分离。113产酶菌种：曲霉属（黑曲霉、米曲霉）、青霉属（点青霉、灰绿青霉、尼崎青霉、紫青
67、霉等）。酶的性质：来源于黑曲霉的葡萄糖氧化酶，最适pH5.5-5.8，稳定pH3.5-6.5; pH8或pH2.0, 酶迅速失活。最适温度30-40。 黑曲霉葡萄糖氧化酶是胞内酶，结合于菌丝体或存在于细胞内，提取时应将细胞破壁，可用自溶、机械破壁、溶壁酶等方法处理，将酶从细胞释放。114葡萄糖氧化酶的应用（1）食品的除氧保鲜；（2）葡萄糖酸的生产；（3）蛋类制品的脱糖保鲜，可避免美拉德反应而产生褐变现象；（4)面粉添加剂代替有致癌作用的溴酸钾，过氧化氢能将面筋分子中的巯基（SH）氧化为二硫键（SS），从而增强面筋的强度，提高面团延展性和咬劲。（5）新型饲料添加剂，GOD催化葡萄糖生成葡萄糖酸和
68、过氧化氢，反应过程消耗O2，促使厌氧有益菌的增殖；葡萄糖酸抑制大肠杆菌、沙门氏菌等有害菌，改善肠道酸性环境、保持肠道菌群生态平衡，去除霉菌毒素等作用。GOD在肠道中可起到酸化剂和益生元的作用。（6）用葡萄氧化酶制造酶电极，可用于血液、尿液、发酵液等样品中葡萄糖含量的检测。（7）啤酒中加入GOD，可除去啤酒中溶解氧与瓶颈氧，对阻止啤酒的氧化，防止啤酒老化，保持啤酒原有风味，延长保存期有显著效果。115淀粉酶类的应用n淀粉液化方法：1、间歇液化法(直接升温液化法,中温-淀粉酶)n在液化锅里，将30%淀粉乳调pH为6-6.5，加入所需的Ca2+(中温酶需150ppm)，加入中温-淀粉酶6-8U/g淀
69、粉，搅拌均匀逐渐加热到85-90，继续搅拌并维持30-60min，以达到所需的液化程度（DE值为15-18%）。116n淀粉液化方法：n1、间歇液化法（高温-淀粉酶）n如用高温-淀粉酶，可不加或少加钙离子，温度控制在95-100，耐高温酶对pH特别敏感，在pH4左右迅速失活，液化后，在向糖化罐输送的中间设一个边降温边流加盐酸的调节pH装置，可简便杀酶。1172、喷射液化技术n是利用喷射器进行粉浆的糊化和液化，可以达到迅速升温、瞬间液化的目的，其优点为：n（1）液化时间短、液化彻底，能提高原料利用率；n（2）蛋白质絮凝效果好，可减少难溶性淀粉颗粒，加快过滤速度；n（3）迅速升温，更适合高温酶的作
70、用；n（4）设备简单、操作方便、生产效率高。118n喷射器是利用高速蒸汽均匀而迅速地与有淀粉酶的浆料相接触，料液瞬间达到酶作用所需温度，料液、酶液和蒸汽三者在喘流下混合，大大强化了传热过程，使料液受热瞬间膨胀，酶迅速作用，料液粘度迅速降低，淀粉质原料糊化和液化连续进行，相互促进。119n喷射液化器分为两种“料带汽”、“汽带料”。n“料带汽”：淀粉乳进料泵用工作压力大于 0.6Mpa的高温浓浆泵把料液送入喷射器中，蒸汽压力小（0.05-0.1MPa），蒸汽通过很多小孔与料液在锤形管中均匀接触、混合，升温、液化、排出。（料液较纯，不含杂质颗粒）n “汽带料”：利用高速蒸汽产生一定负压，料液在泵压推
71、进下，在蒸汽负压的吸引下，淀粉乳被吸入，迅速混合，由于蒸汽压力大，汽液交换迅速，在喷射器内迅速升温、糊化、液化，然后喷出。（蒸汽压力要大）n根据加酶次数和喷射次数，可分为n一次加酶喷射液化、一次加酶二次喷射、 二次加酶二次喷射120低压喷射液化（料带汽）121n1、原料：原料粉碎度一般在60目左右。n2、粉浆浓度：淀粉乳浓度30-40%。n3、液化液pH：pH 6.0-6.5。n4、温度控制：用中温酶在钙离子及30-40%淀粉乳保护下，温度可控制在85-90，瞬时喷射液化，温度可在90-92。n用高温酶，在30-40%淀粉乳保护下，温度可控制在97-100，瞬时喷射液化可在110-130。液化
72、条件的要求：122液化工艺图123n5、液化程度的控制:（1）碘试反应，液化完全呈棕红色或黄色（2）DE值控制：液化液DE值对以后的糖化液DE值有很大影响。DE值太高，则造成糊精分子太小，不利于糖化酶的作用，影响糖化酶的催化效率；DE值太低，液化不彻底，糖化酶作用速度慢，酶用量大，糖化时间长，并使液化液过滤性能差。DE值应控制在10-20%，以12-18%较为合适。n6、透光率及澄清度的控制：液化完全，蛋白絮凝好，分层明显，过滤性能好；如液化温度增加到130左右，就能解决蛋白絮凝及过虑性能问题。124糖化技术n（1）糖化理论：在液化工序中，淀粉由-淀粉酶水解成糊精和低聚糖等较小分子产物，酶法糖
73、化是利用糖化酶进一步将这些产物水解成葡萄糖。n（C6H10O5）n+nH2OnC6H12O6n16218180n100111.11n因此葡萄糖的理论收率为111.11%，但在实际生产中，双酶法制得糖液的DE值为96-98%，实际葡萄糖含量在96-97%，粉糖转化率为105-108%（由于在制糖过程中，复合分解反应及生产过程中的损失）125（2）酶法糖化工艺npH4.0-4.2， 温度60-62，加酶量100-200U/g淀粉，糖化时间40-48hr，终点DE值96-98%。糖化结束后，升温到80灭酶。n液化结束后，迅速将料液用酸将pH调至4.0-4.5，同时迅速闪蒸降温至60，然后加入糖化酶（
74、150 U/g淀粉），60保温数小时后，当用无水酒精检验无糊精存在时，将料液pH调至4.8-5.0，同时加热到80，保温20min，然后料液温度降到60-70时，开始过滤，滤液进入贮罐。n糖化罐的材料，用碳钢表面涂上防腐材料即可，外层包以保温材料，内部有一盘管，通热水即可保温。126麦芽糊精n以淀粉为原料，经控制水解DE值在20%以下,再经精制喷雾干燥而成。的产品，称麦芽糊精，其商品的英文简称为MD，为白色或略带黄色的无定形粉末。n麦芽糊精DE值与糖成分的组成nDE值（%） 4-6 9-12 13-17 18-22nG1 - 0.5 1.0 1.0nG2 - 3.5 3.5 6.0nG3 -
75、6.5 7.5 8.0nG4以上 100 89.5 88.0 85.0DE值越高，则甜度越高，吸湿性越强，粘度越低。127n麦芽糊精具有很好的增稠性、载体性、水溶性和成膜性，在食品、医药、纺织、造纸、化工等部门应用极广，我国80年代开始工业化生产，至今年产量超过50万吨。128n麦芽糖浆（按麦芽糖含量可分为饴糖、高麦芽糖、超高麦芽糖浆）n饴糖：麦芽糖含量40%以上。淀粉液化后DE值15-20%，用-淀粉酶糖化。n高麦芽糖浆：麦芽糖含量在45%以上。淀粉液化后DE值10-20%，真菌淀粉酶糖化。n超高麦芽糖浆：麦芽糖含量在70%以上。淀粉液化后DE值要低于8%，用-淀粉酶+普鲁蓝酶糖化。n直链淀
76、粉:采用脱枝酶分解经液化的淀粉的分枝部分，使其转变为直链淀粉，然后用丁醇或缓慢冷却沉淀直链淀粉，收集含少量水分的晶型沉淀物，通过喷雾干燥制得粉状的直链淀粉。129多孔淀粉：多孔淀粉：n多孔淀粉又称微孔淀粉,是一种新型的酶变性淀粉,是具有生淀粉酶活力的酶在低于淀粉糊化温度下作用于生淀粉颗粒的非结晶区,形成的一种多孔性蜂窝状产物。多孔淀粉在本质上仍是淀粉,与原淀粉有相似的性能,但与原淀粉相比,最明显的区别是多孔淀粉具有较强的吸附能力。130红薯多孔淀粉电镜照片131n由于其表面具有很多伸向淀粉粒中心的小孔，因而具有良好的吸附性能，可用作功能性物质(如药剂、香料、色素、保健物质等)的吸附载体。它不仅
77、能弥补我国在此类变性淀粉生产上的空白，推动我国变性淀粉工业的发展，而且能够为医药、食品、化妆品等行业提供一种廉价的工业原料，具有重要的现实意义。132多孔淀粉的制备方法多孔淀粉的制备方法n称取20 g玉米淀粉, 置于500 ml烧杯中, 加入一定pH值的醋酸钠缓冲液200 ml,于一定温度的水浴锅中预热20 min，同时用电动搅拌机搅拌。分别精确称取一定量的酶(葡萄糖淀粉酶、-淀粉酶) ,用醋酸钠缓冲液配成一定浓度的酶液，按一定比例将酶液全部转移到淀粉悬浮液中并准确计时，搅拌反应一定时间后，加碱中和终止反应。n将悬浮液在3 000 r/min转速下离心5 min，量取上清液移入容量瓶中，用于水
78、解。剩余淀粉用蒸馏水洗涤并离心，如此重复3次，将所得淀粉置于50真空干燥箱中干燥至恒重,用粉碎机粉碎,即得微孔淀粉样品。133制备多孔淀粉所用的酶n测定比较了糖化酶、- 淀粉酶、- 淀粉酶和普鲁兰酶等10 种酶的生淀粉酶活力，发现糖化酶的酶活普遍较高，-淀粉酶和糖化酶组合使用效果较好，而且在二者比例为14时，形成的多孔淀粉的吸水率、吸油率最高。由此可见,复合酶具有协同效应，比单独使用任何一种酶的效果都好。134多孔淀粉的应用n在医药上作为片剂的基体材料,将药剂吸附在淀粉孔中，可缓释放药剂和防止药剂散失，提高其使用效果；n在农业上可用作杀虫剂、除草剂载体,能有效控制农药挥发、分解和释放速度,延长
79、农药有效期;在食品工业上可作为油脂、脂溶性维生素、保健物质和色素等包埋剂，减少其在食品储藏期损失,还可作为粉末油脂、脂肪替代物原料;应用于化妆品工业。n因此,研究多孔淀粉,不仅能推动我国变性淀粉行业的发展,更能为医药、食品、化妆品等行业提供廉价工业原料,对国民经济的增长具有重要意义。135-淀粉酶活力的测定方法淀粉酶活力的测定方法原理：原理：-淀粉酶能将淀粉分子链中的-1，4葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异性反应逐渐消失，呈红棕色，其颜色的消失速度与酶活力有关，故可通过固定反应后的吸光度计算其酶活力。136-淀粉酶活力的测定方法淀粉酶活力的
80、测定方法试剂和溶液：1、稀碘液：吸取原碘液2 ml(碘2.2%，KI4.4%)，加KI20克，用水溶解并定容至500ml，贮于棕色瓶中。2、2%可溶淀粉：称取2.000g可溶淀粉(浙江菱湖食品化工联合公司生产)，用水调成浆状物，在搅动下缓缓倾入70ml沸水中，加热至完全透明，冷却，定容至100ml。(现配现用)3、pH6.0磷酸盐缓冲液：称取Na2HPO4 12H2O 45.32g,柠 檬 酸 (C6H8O7 H2O)8.07g， 用 水 溶 解 并 定 容 至1000ml，配好后用pH校正。137-淀粉酶活力的测定方法淀粉酶活力的测定方法分析步骤：酶液的稀释：吸取酶液1.00ml（或称取酶粉
81、1-2g,精确至0.0002g），先用少量的pH6.0磷酸盐缓冲液溶解，倾入容量瓶中，摇匀（酶活力应在3.7-5.6U/ml范围内）测定：测定：吸取可溶淀粉溶液20.0ml于试管中，加入缓冲液5.00ml，摇匀后，于60恒温水浴中预热5ml。加入稀释好的待测酶液1，立即记时，摇匀，准确反应5min。立即吸取反应液1ml于5ml稀碘液中，摇匀，并以稀碘液作空白，于660nm波长下，用1cm比色皿迅速测定吸光度（A），根据吸光度值查附表，求得测试酶液的浓度(c)。138-淀粉酶活力的测定方法淀粉酶活力的测定方法酶活计算:X=cn（U/ml， 或U/g）X-测试酶液的浓度n-稀释倍数。 139淀粉糖系列产品n葡萄糖（山梨醇）、果糖n（葡萄糖可以发酵生产众多产品，）n麦芽糖（麦芽糖浆、高麦芽糖浆、超高麦芽糖浆） 麦芽糖醇n海藻糖n低聚异麦芽糖n环糊精n麦芽糊精n直链淀粉140141淀粉为原料通过酶法生产的功能性低聚糖142作业n以淀粉为原料，双酶法制备葡萄糖(粉状或结晶)的工艺技术方法？143
