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1、第十三章第十三章 高效液相色高效液相色谱法法第一第一节 概述概述 高效液相色高效液相色高效液相色高效液相色谱谱法：以气相色法：以气相色法：以气相色法：以气相色谱为谱为根底，在根底，在根底，在根底，在经经典液相典液相典液相典液相色色色色谱实验谱实验和技和技和技和技术术根底上建立的一种液相色根底上建立的一种液相色根底上建立的一种液相色根底上建立的一种液相色谱谱法法法法一、一、HPLCHPLC与与经经典典LCLC区区别别二、二、HPLCHPLC与与GCGC差差别别三、高效液相色三、高效液相色谱仪谱仪流程流程图图四、特点四、特点.一、一、HPLC与与经典典LC区区别主要区主要区别别：固定相差：固定相差
2、别别，输输液液设备设备和和检测检测手段手段1 1经经典典LCLC：仅仅做做为为一种分一种分别别手段手段 柱内径柱内径13cm13cm，固定相粒径，固定相粒径100m 100m 且不均匀且不均匀 常常压压保送流保送流动动相相 柱效低柱效低HH，nn 分析周期分析周期长长 无法在无法在线检测线检测2 2HPLCHPLC：分：分别别和分析和分析 柱柱内内径径26mm26mm，固固定定相相粒粒径径10m10m球球形形，匀匀浆浆装柱装柱 高高压压保送流保送流动动相相 柱效高柱效高HH，nn 分析分析时间时间大大大大缩缩短短 可以在可以在线检测线检测.二、二、HPLC与与GC差差别一一样样：兼具分：兼具分
3、别别和分析功能，均可以在和分析功能，均可以在线检测线检测 主要差主要差别别：分析：分析对对象的差象的差别别和流和流动动相的差相的差别别1 1分析分析分析分析对对象象象象 GC GC：能气化、：能气化、：能气化、：能气化、热稳热稳定性好、且沸点定性好、且沸点定性好、且沸点定性好、且沸点较较低的低的低的低的样样品，品，品，品， 高沸点、高沸点、高沸点、高沸点、挥发挥发性差、性差、性差、性差、热稳热稳定性差、离子型及定性差、离子型及定性差、离子型及定性差、离子型及 高聚物的高聚物的高聚物的高聚物的样样品不可品不可品不可品不可检测检测 占有机物的占有机物的占有机物的占有机物的20%20% HPLC H
4、PLC：溶解后能制成溶液的：溶解后能制成溶液的：溶解后能制成溶液的：溶解后能制成溶液的样样品，品，品，品， 不受不受不受不受样样品品品品挥发挥发性和性和性和性和热稳热稳定性的限制定性的限制定性的限制定性的限制 分子量大、分子量大、分子量大、分子量大、难难气化、气化、气化、气化、热稳热稳定性差及高分子定性差及高分子定性差及高分子定性差及高分子 和离子型和离子型和离子型和离子型样样品均可品均可品均可品均可检测检测 用途广泛，占有机物的用途广泛，占有机物的用途广泛，占有机物的用途广泛，占有机物的80%80%.续前2 2流流流流动动相差相差相差相差别别GCGC：流：流：流：流动动相相相相为为惰性气体惰
5、性气体惰性气体惰性气体组组分与流分与流分与流分与流动动相无相无相无相无亲协亲协作用力，只与固定相作用作用力，只与固定相作用作用力，只与固定相作用作用力，只与固定相作用 HPLCHPLC：流：流：流：流动动相相相相为为液体液体液体液体流流流流动动相与相与相与相与组组分分分分间间有有有有亲协亲协作用力，作用力，作用力，作用力，为为提高柱的提高柱的提高柱的提高柱的选择选择性、性、性、性、 改善分改善分改善分改善分别别度添加了要素，度添加了要素，度添加了要素，度添加了要素，对对分分分分别别起很大作用起很大作用起很大作用起很大作用流流流流动动相种相种相种相种类较类较多，多，多，多，选择选择余地广余地广余
6、地广余地广流流流流动动相极性和相极性和相极性和相极性和pHpH值值的的的的选择选择也也也也对对分分分分别别起到重要作用起到重要作用起到重要作用起到重要作用 选选用不同比例的两种或两种以上液体作用不同比例的两种或两种以上液体作用不同比例的两种或两种以上液体作用不同比例的两种或两种以上液体作为为流流流流动动相相相相 可以增大分可以增大分可以增大分可以增大分别选择别选择性性性性3 3操作条件差操作条件差操作条件差操作条件差别别 GC GC：加温操作：加温操作：加温操作：加温操作 HPLC HPLC：室温；高：室温；高：室温；高：室温；高压压液体粘度大，峰展液体粘度大，峰展液体粘度大，峰展液体粘度大，
7、峰展宽宽小小小小.三、高效液相色三、高效液相色谱仪流程流程图1 1贮贮液罐液罐液罐液罐滤滤棒，可棒，可棒，可棒，可滤滤去去去去颗颗粒状物粒状物粒状物粒状物质质2 2高高高高压泵压泵输输液液液液泵泵3 3进样进样安装安装安装安装4 4色色色色谱谱柱柱柱柱分分分分别别5 5检测检测器器器器分析分析分析分析6 6废废液出口或液出口或液出口或液出口或组组分搜集器分搜集器分搜集器分搜集器 7 7记录记录安装安装安装安装.续续前前四、四、HPLC的特点和运用的特点和运用 “ “三高三高 “ “一快一快 “ “一广一广 高柱效高柱效n=104n=104片片/ /米，柱效高米，柱效高远远高于普通高于普通LCL
8、C高灵敏度高灵敏度高高选择选择性性分析速度快分析速度快运用范运用范围围广泛可分析广泛可分析80%80%有机化合物有机化合物.第二第二节 根本根本实际和条件和条件选择热热力学力学实际实际：塔板：塔板实际实际平衡平衡实际实际 根底根底动动力学力学实际实际：速率：速率实际实际VanderVander方程方程 一、塔板一、塔板实际实际二、速率二、速率实际实际 三、三、HPLCHPLC法中分法中分别别条件的条件的选择选择.一、塔板一、塔板实际.二、速率二、速率实际与与GCGC对比比 1. 1.续前2 2涡涡流分散流分散项项及其影响及其影响 next next2. 2.讨论讨论： 1 1流流流流动动相流速
9、相流速相流速相流速对对HPLCHPLC板高的影响与板高的影响与板高的影响与板高的影响与GCGC对对比比比比nextnext.图示backback.续前3 3传质传质阻抗阻抗项项及其影响及其影响 .图示.三、三、HPLC法中分法中分别条件的条件的选择1. 1. 固定相与装柱方法的固定相与装柱方法的选择选择： 选选粒径小的、分布均匀的球形固定相粒径小的、分布均匀的球形固定相dp10mdp10m 首首选选化学化学键键合相，匀合相，匀浆浆法装柱法装柱2. 2. 流流动动相及其流速的相及其流速的选择选择： 选选粘度小、低流速的流粘度小、低流速的流动动相相甲醇，甲醇，1ml/min 1ml/min 3.
10、3. 柱温的柱温的选择选择： 选选室温室温250C250C左右左右.第三第三节 各各类高效液相色高效液相色谱法法 一、液固吸附色一、液固吸附色谱谱法法LSCLSC 二、液液分配色二、液液分配色谱谱法法LLCLLC三、化学三、化学键键合相色合相色谱谱法法BPCBPC.一、液固吸附色一、液固吸附色谱法法LSC 流流动相相为液体，固定相液体，固定相为固体吸附固体吸附剂 1 1分分别别机制：利用溶机制：利用溶质质分子占据固定相外表吸附活性分子占据固定相外表吸附活性 中心才干的差中心才干的差别别 分分别别前提：前提：K K不等或不等或k k不等不等.续前2 2固定相：与固定相：与LCLC比，固定相粒径不
11、同比，固定相粒径不同10m17% 17% 分配色分配色谱谱 硅胶失活硅胶失活载载体体 吸附的水吸附的水固定液固定液.二、液液分配色二、液液分配色谱法法LLC1 1分分别别机制：利用机制：利用组组分在两相中溶解度的差分在两相中溶解度的差别别2 2固定相：固定相：载载体体+ +固定液物理或机械涂固定液物理或机械涂渍渍法法 缺陷：系缺陷：系统统内部内部压压力大，易流失，不适用力大，易流失，不适用 固定液固定液极性极性NLLCNLLC 固定液固定液非极性非极性RLLCRLLC3 3正正相相色色谱谱固固定定液液极极性性 流流动动相相极极性性NLLCNLLC 极性小的极性小的组组分先出柱，极性大的分先出柱
12、，极性大的组组分后出柱分后出柱 适于分适于分别别极性极性组组分分 反相色反相色谱谱固定液极性固定液极性 固定相极性固定相极性 底底剂剂 + + 有机有机调调理理剂剂极性极性调调理理剂剂 例：水例：水 + + 甲醇，乙甲醇，乙腈腈，THFTHF.续前4 4流流动动相极性与相极性与k k的关系：的关系： 流流动动相极性相极性 ，洗脱才干，洗脱才干 ，kk，组组分分tRtR5 5出柱出柱顺顺序：极性大的序：极性大的组组分先出柱分先出柱 极性小的极性小的组组分后出柱分后出柱6 6适用：非极性适用：非极性 中等极性中等极性组组分分HPLC80%HPLC80%问题问题.三正相三正相键合相色合相色谱1 1分
13、分别别机制：溶机制：溶质质分子与固定相之分子与固定相之间间定向作用力、定向作用力、 诱导诱导力、或力、或氢键氢键作用力作用力2 2固定相：极性大的固定相：极性大的氰氰基或氨基基或氨基键键合相合相3 3流流动动相：极性小同相：极性小同LSCLSC 底底剂剂 + + 有机极性有机极性调调理理剂剂 例：正己例：正己烷烷 + + 氯氯仿仿- -甲醇，甲醇，氯氯仿仿- -乙醇乙醇.续前4 4流流动动相极性与相极性与k k的关系：的关系： 流流动动相极性相极性 ，洗脱才干，洗脱才干 ，组组分分tRtR，kk5 5出柱出柱顺顺序：构造相近序：构造相近组组分，极性小的分，极性小的组组分先出柱分先出柱 极性大的
14、极性大的组组分后出柱分后出柱6 6适用：适用：氰氰基基键键合相与硅胶的柱合相与硅胶的柱选择选择性性类类似极性稍小似极性稍小 分分别别物物质质也也类类似似氨基氨基键键合相与硅胶性合相与硅胶性质质差差别别大，碱性大，碱性 分析极性大物分析极性大物质质、糖、糖类类等等.四离子四离子对色色谱和离子抑制色和离子抑制色谱1 1反相离子反相离子对对色色谱谱法法 2 2反相离子抑制色反相离子抑制色谱谱 .1反相离子反相离子对色色谱法法IPC或或PIC 反相色反相色谱谱中，在极性流中，在极性流动动相中参与离子相中参与离子对试剂对试剂，使被，使被测组测组分分与其中的反离子构成中性离子与其中的反离子构成中性离子对对
15、，添加，添加k k和和tRtR，以改善分，以改善分别别1 1离子离子对试剂对试剂：烷烷基磺酸基磺酸钠钠分析碱分析碱 四丁基季胺四丁基季胺盐盐分析酸分析酸2 2影响影响k k的要素的要素a a与与mm的极性有关同反相色的极性有关同反相色谱谱b b与与R R的的链长链长有关：有关：RR长长，极性，极性 小，小，tRtR，k k 3 3适用：适用：较强较强的有机酸、碱的有机酸、碱.2反相离子抑制色反相离子抑制色谱在反相色在反相色谱谱中，中，经过经过参与参与缓缓冲溶液冲溶液调调理流理流动动相相pHpH值值，抑制，抑制组组分解离，添加其分解离，添加其k k和和tRtR，以到达改善分，以到达改善分别别的目
16、的的目的1 1离子抑制离子抑制剂剂：弱酸、弱碱性物：弱酸、弱碱性物质质 pH pH一定的一定的缓缓冲溶液冲溶液2 2k k的影响要素：与流的影响要素：与流动动相极性有关，相极性有关，还还与与pHpH值值有关有关选择选择流流动动相：相：应应同同时时思索极性及思索极性及pHpH值值 酸性物酸性物质质参与酸参与酸HAc tRHAc tR，k k 碱性物碱性物质质参与碱参与碱NH3H2O tRNH3H2O tR，k k 调调理理pHpH范范围围：3.08.03.08.0 pH8.0 pH8.0 破坏破坏键键合相与合相与载载体的体的结结合合 pH3.0 pH3.0 腐腐蚀蚀柱子柱子3 3适用：极弱酸碱物
17、适用：极弱酸碱物质质 pH=37 pH=37弱酸；弱酸；pH=78pH=78弱碱；两性化合物弱碱；两性化合物.第四第四节 影响分影响分别的要素的要素1 1.续前2 2对对流流动动相的要求：相的要求：1 1与固定液不反响与固定液不反响2 2对样对样品有良好溶解度品有良好溶解度 k=110 k=110 k=25 k=25 最理想的最理想的3 3与与检测检测器匹配：器匹配： UV UV常用，常用，测测定波定波长应长应大于溶大于溶剂剂的截止波的截止波长长 荧荧光，光，电电化学化学4 4运用粘度小、运用粘度小、纯纯度高的流度高的流动动相甲醇，乙相甲醇，乙腈腈 运用前运用前过滤过滤、脱气、脱气.续前 3
18、3洗脱方式洗脱方式 1 1等度洗脱恒等度洗脱恒组组成溶成溶剂剂洗脱洗脱 以固定配比的溶以固定配比的溶剂剂系系统统洗脱洗脱组组分一个分一个泵泵 类类似似GCGC的等温度洗脱的等温度洗脱2 2梯度洗脱：梯度洗脱： 在一定分析周期内不断在一定分析周期内不断变换变换流流动动相的种相的种类类和比例和比例 即不断改即不断改动动其极性两个其极性两个泵泵 适于分析极性差适于分析极性差别较别较大的复大的复杂组杂组分分 类类似似GCGC的程序升温沸程的程序升温沸程较长样较长样品品.图示.第五第五节 高效液相色高效液相色谱仪1 1泵泵： 恒恒压泵压泵：流量精度不：流量精度不稳稳 恒流恒流泵泵：常用：常用2 2进样进
19、样安装安装 1 1隔膜隔膜进样进样高分子有机硅胶高分子有机硅胶垫垫进样进样室室 GC GC系系统压统压力力较较小，可以小，可以 HPLC HPLC系系统压统压力太大，必需停力太大，必需停泵进样泵进样早期早期 2 2阀进样阀进样：不用停：不用停泵泵，六通，六通阀阀.续前3 3色色谱谱柱：直径柱：直径46mm,46mm,柱柱长长1030cm1030cm 柱效柱效评评价：色价：色谱谱系系统顺应统顺应性性实验实验 R R，n n，fs fs拖尾因子拖尾因子 柱再生：柱再生：维护维护、保养、柱子的冲洗、保养、柱子的冲洗4 4检测检测器器 1 1紫外紫外检测检测器：适于吸收紫外光的物器：适于吸收紫外光的物质质 2 2荧荧光光检测检测器：只能分析本身器：只能分析本身发发光的物光的物质质 灵敏度高灵敏度高 3 3示差折光示差折光检测检测器：利用折光率的差器：利用折光率的差别别 灵敏度低，温度要求灵敏度低，温度要求严厉严厉 4 4电电化学化学检测检测器器 5 5化学化学发发光光.
