细胞实验课件实验八 2细胞的传代培养

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1、细细 胞胞 计计 数数 20世纪世纪60年代后，动物细胞大规模培养技术开始年代后，动物细胞大规模培养技术开始起步，并逐步发展，在现代生物技术中发挥着重要的起步，并逐步发展，在现代生物技术中发挥着重要的作用。技术应用领域主要有：生物制品的生产、筛选作用。技术应用领域主要有：生物制品的生产、筛选抗癌药物、器官移植培养、医学研究等。抗癌药物、器官移植培养、医学研究等。1.1.仪器、用具仪器、用具仪器、用具仪器、用具 CO2 CO2培养箱、倒置显微镜、培养皿、移液枪、培养箱、倒置显微镜、培养皿、移液枪、培养箱、倒置显微镜、培养皿、移液枪、培养箱、倒置显微镜、培养皿、移液枪、枪头、滴管、枪头、滴管、枪头

2、、滴管、枪头、滴管、EPEP管、血球计数板、棉花、盖管、血球计数板、棉花、盖管、血球计数板、棉花、盖管、血球计数板、棉花、盖玻片等玻片等玻片等玻片等2.2.材料材料材料材料 293T 293T细胞细胞细胞细胞( (人肾上皮细胞系人肾上皮细胞系) )3.3.试剂试剂试剂试剂 0.25 0.25胰酶，胰酶，胰酶，胰酶，PBSPBS，DMEMDMEM培养基（含培养基（含培养基（含培养基（含10%10%血血血血清）、清）、清）、清）、0.4%0.4%台盼蓝台盼蓝台盼蓝台盼蓝染液染液、70%70%乙醇乙醇乙醇乙醇悬悬浮浮细细胞胞 贴贴壁壁细细胞胞贴贴壁壁过过程程细胞计数细胞计数 用等渗稀释液将细胞稀释一

3、定倍数，充入血细胞计数池，计数一定体积内的细胞数目，经换算求出每毫升培养液中细胞数量。 计数板为一块特制的长方形厚玻璃板，在板的中部有4条槽，中间两槽之间有一条横槽把计数板的中部隔成二个平台，每个平台中间都有一个计数室，此平台比整个玻璃板的平面低0.1mm，当放上盖玻片后，平台与盖玻片之间的高度为0.1mm。在显微镜下可看到，计数室被划分为边长为1mm的9个大方格，四角的大方格，又分为16个中方格，适用于白细胞计数。中间的一个大方格又被双线分为25个中方格，每个中方格又各分成16个小方格，适用于红细胞计数，通常取四角的4个中方格和中间的1个中方格来计数红细胞。 原始培养细胞数/ml 四个大格子

4、细胞数/4104稀释倍数 细胞计数步骤：细胞计数步骤： 1.将血球计数板及盖玻片用蘸95乙醇的棉团擦干净晾干后，将盖玻片盖于计数池上面。 2.将细胞培养液适当稀释并充分混匀，吸取少量（约10L）沿盖玻片的边缘充填入计数池中，注意勿发生气泡或使稀释液流出计数池。 3.静置一两分钟后进行计数，计数时为了避免大的误差，应当稀释适当的细胞浓度；为了防止重复和遗漏，应按一定的顺序计数；如果细胞压在格线上时，依照“数上不数下，数左不数右“的原则进行计数；可以多次计数以求平均值。计数红细胞时，若各中方格数目相差20个以上，需重新计数。计数培养的细胞时，若细胞聚集成团只按照一个细胞计算；若成团达10以上，需重新制备悬液；若各个大格间数目相差10以上，需要重新计数。 4.计算细胞数。 5.用蘸95乙醇的棉团擦干净计数板及盖片。