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1、课题课题1 1 菊花的组织培养菊花的组织培养1 通过必修课的学习，我们已经了解到大多绿色开花植物都是靠种子来繁殖的。那么，有没有不用种子来培育植物的方法呢？ 组织培养组织培养营养繁殖营养繁殖扦插扦插嫁接嫁接压条压条 2扦插扦插嫁接嫁接压条压条 3是指在人工培养是指在人工培养基上，离体培养植物的器基上，离体培养植物的器官、组织、细胞和原生质官、组织、细胞和原生质体，并使其生长、增殖、体，并使其生长、增殖、分化以及再生植株的技术。分化以及再生植株的技术。 组织培养组织培养（一）植物组织培养的基本过程（一）植物组织培养的基本过程4（1 1）基础知识）基础知识细胞离体细胞离体必要条件：必要条件：一定的
2、营养物质、激素和其他一定的营养物质、激素和其他外界条件外界条件原理原理: :细胞的全能性细胞的全能性植物细胞具有全能性，即已分化的植物细胞具有全能性，即已分化的细胞，具有使后代细胞形成完整个细胞，具有使后代细胞形成完整个体的潜能。体的潜能。原理：原理： 定义：定义： 生物体的每一个细胞都包含有该物种所生物体的每一个细胞都包含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因整个体所必需的全部基因5细胞的分化细胞的分化概念：概念： 在个体发育中，相同细胞的后代在形在个体发育中，相同细胞的后代在形态、结构、生理功能上发生稳定性差态、结构、生理功能上
3、发生稳定性差异的过程异的过程 结果：结果：形成不同的细胞和组织形成不同的细胞和组织原因：原因：基因在特定的时间和空间条件下的选基因在特定的时间和空间条件下的选择性表达的结果择性表达的结果6离体的植物离体的植物器官、组织、器官、组织、细胞细胞脱分化脱分化愈愈伤伤组组织织再分化再分化根根芽芽植植物物体体植物组织培养的基本过程植物组织培养的基本过程7愈伤组织愈伤组织8（二）影响植物组织培养的因素（二）影响植物组织培养的因素1.不同的植物组织，培养的难易程度差别很不同的植物组织，培养的难易程度差别很大。例如，烟草和胡萝卜的组织培养较为容大。例如，烟草和胡萝卜的组织培养较为容易，而枸杞愈伤组织的芽诱导就
4、比较难。因易，而枸杞愈伤组织的芽诱导就比较难。因此，此，植物材料的选择直接关系到实验的成败。植物材料的选择直接关系到实验的成败。对于同一种植物材料，材料的年龄、保存时对于同一种植物材料，材料的年龄、保存时间的长短等也会影响实验结果。间的长短等也会影响实验结果。菊花的组织菊花的组织培养，一般选择未开花植株的茎上部新萌生培养，一般选择未开花植株的茎上部新萌生的侧枝。的侧枝。92.离体的植物组织和细胞，对营养、环境等条离体的植物组织和细胞，对营养、环境等条件的要求相对特殊，需要配制适宜的培养基。件的要求相对特殊，需要配制适宜的培养基。常用的一种培养基是常用的一种培养基是MS培养基。其主要成培养基。其
5、主要成分包括：大量元素，如分包括：大量元素，如N、P、K、Ca、Mg、S;微量元素，如微量元素，如B、Mn、Cu、Zn、Fe、Mo、I、Co；有机物，如甘氨酸、烟酸、肌；有机物，如甘氨酸、烟酸、肌醇、维生素，以及蔗糖等。在配制好的醇、维生素，以及蔗糖等。在配制好的MS培养基中，常常需要添加植物激素。培养基中，常常需要添加植物激素。10MS固体培养基成分及比例固体培养基成分及比例11微生物培养基以有机营养为主。与微生物的培养不微生物培养基以有机营养为主。与微生物的培养不同，同，MS培养基则需提供大量无机营养，无机盐混合物包培养基则需提供大量无机营养，无机盐混合物包括植物生长必须的大量元素和微量元
6、素两大类。括植物生长必须的大量元素和微量元素两大类。阅读课文，思考以下问题阅读课文，思考以下问题1. 同微生物培养基相比，同微生物培养基相比，MS培养基的配方有哪些明显的不培养基的配方有哪些明显的不同？同？2、你认为组织培养过程中，成功的关键有哪些？这些步骤的、你认为组织培养过程中，成功的关键有哪些？这些步骤的适宜条件是什么？适宜条件是什么？组织的脱分化及愈伤组织的再分化。组织的脱分化及愈伤组织的再分化。植物组织培养过程中，影响植物细胞脱分化、再分植物组织培养过程中，影响植物细胞脱分化、再分化的最重要因素是植物激素，细胞分裂素与生长素之间化的最重要因素是植物激素，细胞分裂素与生长素之间的浓度比
7、可以调控植株组培过程中芽和根的形成。的浓度比可以调控植株组培过程中芽和根的形成。 123.植物激素浓度、使用的先后顺序以及植物激素浓度、使用的先后顺序以及用量的比例等，会影响实验结果。用量的比例等，会影响实验结果。 植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细植物激素中生长素和细胞分裂素是启动细胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。胞分裂、脱分化和再分化的关键性激素。按照不同的顺序使用这两类激素，会得到按照不同的顺序使用这两类激素，会得到不同的实验结果。不同的实验结果。13当同时使用这两类激素时，两者用量的比例决定着发当同时使用这两类激素时，两者用量的比例决定着发当同时使用这两类激素时，两者用量的比例决
8、定着发当同时使用这两类激素时，两者用量的比例决定着发育的方向，是愈伤组织、长根还是长芽。如为了促进育的方向，是愈伤组织、长根还是长芽。如为了促进育的方向，是愈伤组织、长根还是长芽。如为了促进育的方向，是愈伤组织、长根还是长芽。如为了促进芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓度，或者调芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓度，或者调芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓度，或者调芽器官的分化，应除去或降低生长素的浓度，或者调整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。整培养基中生长素与细胞分裂素的比例。 高高高高 利于根的分化，抑制芽的形
9、成利于根的分化，抑制芽的形成利于根的分化，抑制芽的形成利于根的分化，抑制芽的形成 生长素生长素生长素生长素/ /细胞分裂素细胞分裂素细胞分裂素细胞分裂素 适中适中适中适中 利于促进愈伤组织的形成利于促进愈伤组织的形成利于促进愈伤组织的形成利于促进愈伤组织的形成 低低低低 利于芽的分化，抑制根的形成利于芽的分化，抑制根的形成利于芽的分化，抑制根的形成利于芽的分化，抑制根的形成4.除了上述因素外，除了上述因素外，PH、温度、光照等条件也很重、温度、光照等条件也很重要。要。不同的植物对各种条件的要求往往不同。进行不同的植物对各种条件的要求往往不同。进行 菊花的组织培养，一般将菊花的组织培养，一般将P
10、H值控制在值控制在5.8左右，温度左右，温度控制在控制在18-22，并且每日用日光灯照射，并且每日用日光灯照射12h。14生长素生长素/细胞分裂素细胞分裂素高高 有利于根的分化、抑制芽的形成有利于根的分化、抑制芽的形成低低 有利于芽的分化、抑制根的形成有利于芽的分化、抑制根的形成15同常规的无性繁殖方法相比，组织培养快速繁殖法主要同常规的无性繁殖方法相比，组织培养快速繁殖法主要具有以下优点：具有以下优点：（1）快速。）快速。采用常规的方法如分株法，一棵花卉一年一般只能生产几株采用常规的方法如分株法，一棵花卉一年一般只能生产几株或几十株，但用组织培养的方法则每年可以繁殖出几万或几十株，但用组织培
11、养的方法则每年可以繁殖出几万甚至数百万的小植株。甚至数百万的小植株。（2）周年生产。）周年生产。花卉组织培养快速繁殖是在实验室中进行，花卉组织培养快速繁殖是在实验室中进行，因条件可控，所以不受季节限制，可以全年进行连续生因条件可控，所以不受季节限制，可以全年进行连续生产。而常规的无性繁殖则受季节限制，只能在花卉生长产。而常规的无性繁殖则受季节限制，只能在花卉生长季节进行繁殖。季节进行繁殖。（3）经济效益高。）经济效益高。花卉组织培养快速繁殖所需要的空间小，花卉组织培养快速繁殖所需要的空间小，在一个在一个200平方米的培养室内一年可生产试管苗上百万株。平方米的培养室内一年可生产试管苗上百万株。如
12、按每株如按每株1元计算，每年产值上百万元。元计算，每年产值上百万元。（4）以组织培养繁殖的种苗与母株有著相同的遗传基因。）以组织培养繁殖的种苗与母株有著相同的遗传基因。所以使用这项技术可让优良的品种不断地延续。所以使用这项技术可让优良的品种不断地延续。组织培养与常规繁殖相比优点众多组织培养与常规繁殖相比优点众多16（一）制备（一）制备MSMS固体培养基固体培养基（二）外植体消毒（二）外植体消毒（三）接种（三）接种（四）培养（四）培养（五）移栽（五）移栽（六）栽培（六）栽培二、实验操作二、实验操作17二、实验操作二、实验操作（一）制备（一）制备MSMS固体培养基固体培养基MSMS培养基包括培养基
13、包括2020多种营养成分，实验室一般多种营养成分，实验室一般使用使用4 4。C C保存配制好的培养基母液来制备保存配制好的培养基母液来制备1 1、配置各种母液、配置各种母液为了避免每次配制培养基都要称量几十种成分，为了避免每次配制培养基都要称量几十种成分，减少工作量，可以将各种成分按比例配置成浓减少工作量，可以将各种成分按比例配置成浓缩液，即培养基母液，一般将常用药品配成比缩液，即培养基母液，一般将常用药品配成比所需浓度高所需浓度高1010100100倍的母液。使用时，根据浓倍的母液。使用时，根据浓缩比例计算用量，加水稀释缩比例计算用量，加水稀释18无机物中大量元素浓缩无机物中大量元素浓缩10
14、10倍，微量元素浓倍，微量元素浓缩缩100100倍，常温保存倍，常温保存激素类、维生素类以及用量较小的有机物一激素类、维生素类以及用量较小的有机物一般可按般可按1mg/ml1mg/ml的质量浓度单独配制成母液的质量浓度单独配制成母液用母液配制培养基时，需要根据各种母液用母液配制培养基时，需要根据各种母液的浓缩倍数，计算用量的浓缩倍数，计算用量1950202 2、配置培养基、配置培养基分装到锥形瓶中，每瓶分装分装到锥形瓶中，每瓶分装50ml50ml或或100ml100ml 配制培养液配制培养液配制配制1LMS1LMS培养基，先将称好的琼脂加培养基，先将称好的琼脂加800ml800ml蒸馏蒸馏水，
15、加热使琼脂溶化，然后加入蔗糖水，加热使琼脂溶化，然后加入蔗糖30g30g，取配，取配制好的大量元素、微量元素、有机物和植物激素制好的大量元素、微量元素、有机物和植物激素的母液，依次加入，加蒸馏水定容至的母液，依次加入，加蒸馏水定容至1000ml1000ml 调调PHPH培养基的分装培养基的分装 由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此由于菊花的茎段的组织培养比较容易，因此不必添加植物激素不必添加植物激素213 3、灭菌、灭菌分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸分装好的培养基连同其他器械一起进行高压蒸汽灭菌汽灭菌1 1、选材：、选材：菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝菊花茎段，取生长旺盛的嫩枝（二）外
16、植体消毒（二）外植体消毒2 2、消毒、消毒流水冲洗流水冲洗菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷菊花茎段用流水冲洗后可少许洗衣粉，用软刷轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗轻轻刷洗，刷洗后在流水下冲洗20min20min左右左右22 酒精处理酒精处理用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入体积分数为积分数为7070的酒精中摇动的酒精中摇动2 23 3次，持续次，持续6 67s7s，立即将外植体取出，在无菌水中清洗，立即将外植体取出，在无菌水中清洗 消毒液处理消毒液处理取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，取出后用无菌吸水纸吸干外植体表面的水分，放入质量分数为放
17、入质量分数为0.10.1的氯化汞溶液中的氯化汞溶液中1 12min2min，取出后在无菌水中至少清洗，取出后在无菌水中至少清洗3 3次，漂净次，漂净消毒液消毒液23（三）接种（三）接种污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种污染的主要来源是空气中的细菌和孢子，接种室消毒是至关重要的。用室消毒是至关重要的。用7070的酒精喷雾使空的酒精喷雾使空气消毒，气消毒， 酒精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫酒精或新洁尔灭搽洗工作台并用紫外线照射外线照射2020分钟分钟1 1、接种室消毒、接种室消毒2 2、无菌操作要求、无菌操作要求操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后，操作要在酒精灯火焰旁完成，每次使用器械后
18、，都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。都需要用火焰灼烧灭菌，接种后立即盖好瓶盖。243 3、材料的切取和接种、材料的切取和接种将装有培养基的锥形瓶整齐地排列在酒精灯左侧。将装有培养基的锥形瓶整齐地排列在酒精灯左侧。将消过毒的菊花茎段在无菌培养皿中切成小段将消过毒的菊花茎段在无菌培养皿中切成小段（长约（长约0.5-1cm0.5-1cm）。左手持锥形瓶。右手拉开捆）。左手持锥形瓶。右手拉开捆扎锥形瓶的绳子，并将封口膜攥在右手手心，以扎锥形瓶的绳子，并将封口膜攥在右手手心，以避免封口膜接触瓶口的一面被污染。左手持瓶，避免封口膜接触瓶口的一面被污染。左手持瓶，使瓶口旋转通过火焰，右手用镊子夹取菊
19、花茎段，使瓶口旋转通过火焰，右手用镊子夹取菊花茎段，放入培养基中。插入时应注意不要倒插。每瓶接放入培养基中。插入时应注意不要倒插。每瓶接种种6 68 8块外植体。接种后，将封口膜重新扎好块外植体。接种后，将封口膜重新扎好25264 4、接种注意事项、接种注意事项每接种一块外植体前，镊子需放入体积分每接种一块外植体前，镊子需放入体积分数为数为7575的酒精溶液中消毒一次，然后在酒的酒精溶液中消毒一次，然后在酒精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种精灯火焰上烧一遍，冷却后再接种外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体外植体在培养基中要分布均匀，放置外植体数量根据锥形瓶的大小确定，一般胡萝卜数量根据锥形瓶的大
20、小确定，一般胡萝卜3 34 4块，菊的茎或叶块，菊的茎或叶6 68 8块，也不要太少，以充分块，也不要太少，以充分利用培养基中的营养成分和光照条件利用培养基中的营养成分和光照条件插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎尖插入时应注意方向，不要倒插。茎段、茎尖基部插入培养基利于吸收水分和养分基部插入培养基利于吸收水分和养分27（四）培养（四）培养接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养，接种后的锥形瓶最好放在无菌箱中培养，培养期间应定期消毒。培养温度控制在培养期间应定期消毒。培养温度控制在18-22，并且每日用日光灯光照，并且每日用日光灯光照12h。28（五）移栽（五）移栽移栽生根的菊花试管苗之前，应先打
21、开培养移栽生根的菊花试管苗之前，应先打开培养瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日瓶的封口膜，让试管苗在培养间生长几日1 1、打开封口膜、打开封口膜2 2、清洗转移、清洗转移用流水清洗根部的培养基，用流水清洗根部的培养基，将幼苗移植到消将幼苗移植到消过毒的蛭石或珍珠岩等环境下过毒的蛭石或珍珠岩等环境下生活一段时间生活一段时间29（六）栽培（六）栽培3 3、移栽、移栽珍珠岩：固体基质型，含水量高、蓄水性强、珍珠岩：固体基质型，含水量高、蓄水性强、透性好，适合栽培透性好，适合栽培幼苗长壮后，移栽到土壤中幼苗长壮后，移栽到土壤中幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情幼苗移栽后，每天观察并记录幼苗的生长情况，适时浇水、施肥，直至开花况，适时浇水、施肥，直至开花303132
