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1、 大肠杆菌感受态细胞的制备、大肠杆菌感受态细胞的制备、重组重组DNA的转化的转化、克隆筛选、克隆筛选1. 实验目的和要求实验目的和要求 通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆通过本实验学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞和外源质粒菌感受态细胞和外源质粒DNA转入受体转入受体菌细胞的技术以及筛选转化体的技术。菌细胞的技术以及筛选转化体的技术。 了解细胞转化的概念及其在分子生物了解细胞转化的概念及其在分子生物学研究中的意义。学研究中的意义。2. 相关知识及原理相关知识及原理 感受态细胞感受态细胞(Competent cells): 受受体体细细胞胞经经过过一一些些特特殊殊方方法法（如如：CaCl2等等化化
2、学学试试剂剂法法）的的处处理理后后，细细胞胞膜膜的的通通透透性性发发生生变变化化，成成为为能能容容许许多多有有外外源源DNA的的载体分子通过的细胞载体分子通过的细胞 。（人人工工构构建建的的质质粒粒载载体体中中,一一般般缺缺乏乏此此种种转转移移所所必必需的需的mob基因基因 ） 转化（转化（transformation）： 是是将将异异源源DNA分分子子导导入入受受体体细细胞胞，使使受受体体细细胞胞获获得得新新的的遗遗传传性性状状的的一一种种手手段段，是是基基因因工工程程等研究领域的基本实验技术。等研究领域的基本实验技术。 进入细胞的进入细胞的DNA分子通过复制表达，才能实分子通过复制表达，才
3、能实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。性状。 转化过程所用的受体细胞一般是转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰限制修饰系统缺陷系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株。基化酶的突变株。转化的方法：转化的方法：1.化学的方法化学的方法(热击法热击法)；使用化学试剂（如使用化学试剂（如CaCl2）制备的感受态细胞，通过热击处）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体理将载体DNA分子导入受体细胞；分子导入受体细胞；2.电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过
4、高压脉冲的作用将载体感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。分子导入受体细胞。转化方法的转化方法的实验原理实验原理实验原理实验原理热激法是利用冰冷的热激法是利用冰冷的热激法是利用冰冷的热激法是利用冰冷的CaClCaCl2 2处理对数生长期的细处理对数生长期的细处理对数生长期的细处理对数生长期的细胞，可以诱导其产生短暂的胞，可以诱导其产生短暂的胞，可以诱导其产生短暂的胞，可以诱导其产生短暂的“ “感受态感受态感受态感受态” ”，易于，易于，易于，易于摄取外源摄取外源摄取外源摄取外源DNADNA。转化效率为。转化效率为。转化效率为。转化效率为106 106 107107转化子转
5、化子转化子转化子/g DNA/g DNA。电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，因而需用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的用冰冷的超纯水多次洗涤处于对数生长前期的细胞，以使细胞悬浮液中含有尽量少的导电离细胞，以使细胞悬浮液中含有尽量少的导电离细胞，以使细胞悬浮液中含有尽量少的导电离细胞，以使细胞悬浮液中含有尽量少的导电离子。转化效率为子。转化效率为子。转化效率为子。转化效率为1091091
6、010 1010 转化子转化子转化子转化子/g DNA/g DNA。3仪器、材料和试剂仪器、材料和试剂 无无菌菌超超净净台台，电电热热恒恒温温水水浴浴，分分光光光光度度计计，离心机离心机，移液器，微型离心管等；移液器，微型离心管等； 菌株：菌株：E.coliE.coli jM109 jM109 质粒：质粒：pUC+DNA 片段的重组质粒片段的重组质粒 LBLB培养基；培养基； 含含抗抗菌菌素素的的LBLB平平板板培培养养基基（氨氨苄苄青青霉霉素素，终终浓浓度度100100g gmLmL ) 氨苄青霉素；氨苄青霉素；母液母液200mg/ml 预冷预冷CaClCaCl2 2溶液（溶液（0.1mol
7、0.1molL L） 4操作步骤操作步骤 1）大肠杆菌感受态细胞的制备）大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法法) （1）从从新新活活化化的的E.coli E.coli jM109菌菌平平板板上上挑挑取取一一单单菌菌落落，接接种种于于35ml LB液液体体培培养养中中，37振振荡荡培培养养12h左左右右,将将该该菌菌悬悬液液以以1:1001:50转转接接于于100ml LB液液体体培培养养基基中中，37振振荡荡扩扩大大培培养养，当当培培养养液液开开始始出出现现混混浊浊后后，每每隔隔2030min测测一一次次OD600nm，至至OD600nm0.5时停止培养；时停止培养；（2）每每组组取取培培养
8、养液液1-4ml转转入入离离心心管管中中，在在冰冰上上冷冷却却5min(可可省省略略）,5000rmin离离心心2min （ 3） 倒倒 净净 上上 清清 培培 养养 液液 ， 用用 1ml冰冰 冷冷 的的0.1mo1L CaCl2溶溶液液轻轻轻轻悬悬浮浮细细胞胞，冰冰浴浴30min ；（4） 5000rmin离心离心2min；（ 5） 弃弃 去去 上上 清清 液液 ， 加加 入入 400l冰冰 冷冷 的的0.1mo1L CaCl2溶溶液液，小小心心悬悬浮浮细细胞胞。 5000rmin离心离心2min ；（6）弃弃去去上上清清液液，加加入入200l冰冰冷冷的的0.1mo1L CaCl2溶溶液液
9、，小小心心悬悬浮浮细细胞胞，冰冰上上放放置置片片刻刻后，即制成了感受态细胞悬液；后，即制成了感受态细胞悬液；（7）制制备备好好的的感感受受态态细细胞胞悬悬液液可可直直接接用用于于转转化化实实验验，也也可可加加入入占占总总体体积积15左左右右高高压压灭灭菌菌过过的的甘甘油油，混混匀匀后后分分装装于于1.5ml离离心心管管中中，置置于于-70条件下，可保存半年至一年。条件下，可保存半年至一年。2）细胞细胞转化转化 (1)分别取分别取3个个200l感受态细胞悬液感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作则需化冻后马上进行下面的操作)，(2)第一组，第一组，转化实验组
10、转化实验组 加入加入5 l重组质粒重组质粒DNA + 200l感受态细胞感受态细胞 第二组，第二组，插入插入插入插入DNADNA片段对照组片段对照组片段对照组片段对照组， 插入插入插入插入DNADNA片段片段片段片段+ +200l感受态细胞悬液；感受态细胞悬液； 第三组，质粒第三组，质粒DNA对照组对照组 1ng 质粒质粒DNA十十200l感受态细胞悬液。感受态细胞悬液。 (2) 将将以以上上各各样样品品轻轻轻轻摇摇匀匀，冰冰上上放放置置30min，于于42水水浴浴中中保保温温1.5min，然然后后迅迅速冰上冷却速冰上冷却2min(3) 立立即即向向上上述述管管中中分分别别加加入入0.6ml
11、LB液液体体培培养养基基（不不需需在在冰冰上上操操作作），使使总总体体积积到到0.8ml，该该溶溶液液称称为为转转化化反反应应原原液液，摇摇匀匀后后于于37振振荡荡培培养养约约45min ，使使受受体体菌菌恢恢复复正正常生长状态常生长状态 3) 平板培养（有时需要稀释）平板培养（有时需要稀释）(1)取取各各样样品品培培养养液液0.1ml，分分别别接接种种于于含含抗抗菌菌素素LB平平板板培培养养基基上上，涂涂匀匀（如如果果用用玻玻璃璃棒棒涂涂抹抹，酒酒精精灯灯烧烧过过后稍微凉一下再用，不要过烫后稍微凉一下再用，不要过烫）。）。(2) 菌液完全被培养基吸收后菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，倒置
12、培养皿，于于37恒温培养箱内培养过夜恒温培养箱内培养过夜(12-16小时小时)，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养养 用用 CaCl2法制备的感受态细胞，可使每微法制备的感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒克超螺旋质粒 DNA产生产生5 106-2 107个转化个转化菌落。在实际工作中，每微克有菌落。在实际工作中，每微克有105以上的转以上的转化菌落足以满足一般的克隆实验。化菌落足以满足一般的克隆实验。n n为了提高转化效率为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几实验中要考虑以下几个重要因素：个重要因素： n nn n 1. 细胞生长状态和密度细胞生长状态和密
13、度: 不要用经过多不要用经过多次转接或储于次转接或储于的培养菌，最好从的培养菌，最好从70或或-20甘油保存的菌种中直接转接甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。用于制备感受态细胞的菌液。 n nn n2. 质粒的质量和浓度质粒的质量和浓度: n n 用于转化的质粒用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。转化效率与外源。转化效率与外源DNA的的浓度在一定范围内成正比浓度在一定范围内成正比 n n 加入的外源加入的外源DNA的量过多或体积过大的量过多或体积过大时时,转化效率就会降低。转化效率就会降低。n n 1ng的的cccDNA即可使即可使50l
14、 的感受态细的感受态细胞达到饱和。一般情况下胞达到饱和。一般情况下,DNA溶液的体溶液的体积不应超过感受态细胞体积的积不应超过感受态细胞体积的5。 n nn n3. 试剂的质量试剂的质量: n n 所用的试剂所用的试剂,如如CaCl2 等均需是最高纯等均需是最高纯度的度的(GR.或或AR.),并用超纯水配制并用超纯水配制,最好分最好分装保存于干燥的冷暗处。装保存于干燥的冷暗处。 n nn n4. 防止杂菌和杂防止杂菌和杂DNA的污染：的污染：n n 整个操作过程均应在无菌条件下进行整个操作过程均应在无菌条件下进行, 所用器皿所用器皿, 如离心管如离心管, tip头等最好是新的头等最好是新的,并
15、经高压灭菌处理并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂酶或杂DNA所污染所污染, 否则均会影响转化效率或否则均会影响转化效率或杂杂DNA的转入的转入, 为以后的筛选、鉴定带为以后的筛选、鉴定带来不必要的麻烦。来不必要的麻烦。 重组质粒克隆的鉴定重组质粒克隆的鉴定鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有 -互补互补 小规模制备质粒小规模制备质粒DNA进行酶切分析进行酶切分析 插入失活插入失活 PCR 杂交筛选的方法杂交筛选的方法最常用的方法是小规模制备质粒最常用的方法是小规模制备质粒DNA进行进行
16、酶切分析，对于带有酶切分析，对于带有LacZ基因的载体还可基因的载体还可以结合以结合 -互补现象来筛选。互补现象来筛选。组组组组含抗菌素的平板含抗菌素的平板含抗菌素的平板含抗菌素的平板结果说明结果说明结果说明结果说明 转化实验组转化实验组转化实验组转化实验组 白色白色白色白色菌落和少量菌落和少量菌落和少量菌落和少量蓝色菌落蓝色菌落蓝色菌落蓝色菌落说明有重组质粒导入说明有重组质粒导入说明有重组质粒导入说明有重组质粒导入细细细细胞中（有时还需要酶切胞中（有时还需要酶切胞中（有时还需要酶切胞中（有时还需要酶切进一步鉴定进一步鉴定进一步鉴定进一步鉴定插入插入插入插入DNADNA片片片片段对照组段对照组
17、段对照组段对照组无菌落或极少量无菌落或极少量无菌落或极少量无菌落或极少量白色菌落白色菌落白色菌落白色菌落说明插入片段比较纯或说明插入片段比较纯或说明插入片段比较纯或说明插入片段比较纯或有少量模板有少量模板有少量模板有少量模板DNADNA存在存在存在存在 质粒对照组质粒对照组质粒对照组质粒对照组 蓝色菌落蓝色菌落蓝色菌落蓝色菌落可以判断感受态细胞的可以判断感受态细胞的可以判断感受态细胞的可以判断感受态细胞的效率效率效率效率各实验组在培养皿内菌落生长状况及结果分析各实验组在培养皿内菌落生长状况及结果分析n n思考题思考题 n n1. 制备感受态细胞的原理是什么？制备感受态细胞的原理是什么？ n n2. 如果实验中对照组本不该长出菌如果实验中对照组本不该长出菌落的平板上长出了一些菌落，你将如何落的平板上长出了一些菌落，你将如何解释这种现象？解释这种现象？
