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1、第七章第七章酶工程制药酶工程制药本章主要内容n第一节第一节 概述概述n第二节第二节 酶的来源和生产酶的来源和生产n第三节第三节 酶和细胞的固定化酶和细胞的固定化n第四节第四节 酶工程在医药工业中的应用酶工程在医药工业中的应用n第五节第五节 酶工程研究进展酶工程研究进展第一节第一节 概述概述n一、酶的特性一、酶的特性n酶酶(enzyme)是是由由生生物物体体活活细细胞胞产产生生的的具具有有特特殊殊催催化化功功能能的的一一类类蛋蛋白白质质，也也被被称称为生物催化剂。为生物催化剂。n多数酶的本质是多数酶的本质是蛋白质蛋白质，有些酶是核酸。，有些酶是核酸。n酶酶作作为为生生物物催催化化剂剂的的，除除具
2、具有有一一般般催催化化剂剂的的特特性性：加加快快反反应应速速度度、降降低低反反应应活活化化能能、不不改改变变反反应应平平衡衡点点、反反应应前前后后无无数量和性质变化等数量和性质变化等。n还具有独有的特点还具有独有的特点：n催化效率高催化效率高n专一性强专一性强n反应条件温和反应条件温和n催化活性易受调节和控制催化活性易受调节和控制二、酶工程简介二、酶工程简介n是酶学和工程学相互渗透、发展而是酶学和工程学相互渗透、发展而形成的一门新的技术科学。形成的一门新的技术科学。n从应用的目的出发研究酶、应用酶从应用的目的出发研究酶、应用酶的特异催化功能，并通过工程化将的特异催化功能，并通过工程化将相应原料
3、转化成有用物质的技术。相应原料转化成有用物质的技术。第二节第二节 酶的来源和生产酶的来源和生产n一、一、酶的来源酶的来源n普遍存在于生物体中，可直接从生物体普遍存在于生物体中，可直接从生物体中分离。化学合成方法目前还不成熟。中分离。化学合成方法目前还不成熟。早期是以动植物为原料进行提取，由于早期是以动植物为原料进行提取，由于动植物生长周期长、来源有限、受地理、动植物生长周期长、来源有限、受地理、气候和季节等因素的影响，不适于大规气候和季节等因素的影响，不适于大规模生产，模生产，利用微生物来生产酶制品是一利用微生物来生产酶制品是一个更好的选择。个更好的选择。 利用微生物来生产酶制品利用微生物来生
4、产酶制品优点优点 n1 1、微微生生物物种种类类繁繁多多，动动植植物物体体内内的的酶在微生物中几乎都可以找到；酶在微生物中几乎都可以找到；n2 2、繁殖快、生产周期短、繁殖快、生产周期短n3 3、培培养养简简便便、并并可可以以通通过过控控制制培培养养条件来提高产量；条件来提高产量；n4 4、微微生生物物具具有有较较强强的的适适应应性性，通通过过各各种种遗遗传传变变异异手手段段能能培培育育出出新新的的高高产菌株。产菌株。 二、二、酶的生产菌酶的生产菌n1 1、对菌种的要求对菌种的要求n产酶量高，产酶量高，酶的性能符合使用要求，酶的性能符合使用要求，最好是胞外酶；最好是胞外酶；n不是不是致病菌致病
5、菌、在系统发育上与病源、在系统发育上与病源体无关，不产生毒素；体无关，不产生毒素；n稳定稳定，不易变异退化，不易感染噬，不易变异退化，不易感染噬菌体；菌体；n生产生产成本低成本低, ,能利用廉价原料，发酵能利用廉价原料，发酵周期短，易于培养。周期短，易于培养。2 2、生产菌来源、生产菌来源n菌种保藏机构、有关研究部门；菌种保藏机构、有关研究部门；n从从自自然然界界中中分分离离筛筛选选，土土壤壤、深深海海、温温泉泉、火火山山、森森林林都都是是菌菌种种采采集集地地，筛筛选选包包括括菌菌样样采采集集、菌菌种种分分离离、初初筛、纯化、复筛、生产性能鉴定。筛、纯化、复筛、生产性能鉴定。3 3、常用产酶微
6、生物、常用产酶微生物n大肠杆菌（最常用的产酶微生物）：大肠杆菌（最常用的产酶微生物）：n一一般般属属于于胞胞内内酶酶，需需要要经经过过细细胞胞破破碎碎才才能能得得到到。谷谷氨氨酸酸脱脱羧羧酶酶，用用于于测测定定谷谷氨氨酸酸含含量量或或-氨氨基基丁丁酸酸；天天冬冬氨氨酸酸酶酶，催催化化延延胡胡索索酸酸加加氨氨生生成成L-L-天天冬冬氨氨酸酸；苄苄青青霉霉素素酰酰化化酶酶，生生成成新新的的半半合合成成青青霉霉素素或或头头孢孢霉霉素素；-半半乳乳糖糖苷酶，用于分解乳糖。苷酶，用于分解乳糖。n枯草杆菌枯草杆菌：-淀粉酶、蛋白酶、葡淀粉酶、蛋白酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸脂酶。萄糖氧化酶、碱性磷酸脂酶。n
7、青霉菌青霉菌：产黄青霉用于生产葡萄糖：产黄青霉用于生产葡萄糖氧化酶、青霉素酰化酶；橘青霉用氧化酶、青霉素酰化酶；橘青霉用于生产脂肪酶、葡萄糖氧化酶、凝于生产脂肪酶、葡萄糖氧化酶、凝乳蛋白酶。乳蛋白酶。n黑曲霉黑曲霉：有胞外酶和胞内酶，糖化酶、：有胞外酶和胞内酶，糖化酶、-淀粉酶、酸性蛋白酶、葡萄糖氧化酶、淀粉酶、酸性蛋白酶、葡萄糖氧化酶、脂肪酶、纤维素酶。脂肪酶、纤维素酶。n米曲霉米曲霉：糖化酶和蛋白酶，在传统的酒：糖化酶和蛋白酶，在传统的酒曲和酱油曲中得到广泛应用。曲和酱油曲中得到广泛应用。n木霉木霉：纤维素酶，含有较强的：纤维素酶，含有较强的17-17-羟化羟化酶，常用于甾体转化。酶，常用
8、于甾体转化。n根根霉霉：糖糖化化酶酶、-淀淀粉粉酶酶、转转化化酶酶、酸酸性性蛋蛋白白酶酶、脂脂肪肪酶酶、纤纤维维素素酶酶，含含有有较较强强的的11-11-羟羟化化酶酶，常常用用于于甾甾体转化。体转化。n链链霉霉菌菌：葡葡萄萄糖糖异异构构酶酶、青青霉霉素素酰酰化化酶酶、纤纤维维素素酶酶、碱碱性性蛋蛋白白酶酶、中中性性蛋蛋白白酶酶，含含有有丰丰富富的的11-11-羟羟化化酶酶，可用于甾体转化。可用于甾体转化。n啤啤酒酒酵酵母母：酿酿造造啤啤酒酒、酒酒精精、饮饮料料酒酒和和面面包包制制造造。可可生生产产转转化化酶酶、丙丙酮酸脱羧酶等的生产。酮酸脱羧酶等的生产。三、提高药用酶产量的措施三、提高药用酶产
9、量的措施n1 1、添加诱导物添加诱导物n2 2、控制阻遏物浓度控制阻遏物浓度n3 3、添加表面活性剂添加表面活性剂n4 4、添加产酶促进剂添加产酶促进剂1 1、添加诱导物、添加诱导物n对对于于诱诱导导酶酶的的发发酵酵生生产产，在在发发酵酵培培养养基基中中添添加加适适当当的的诱诱导导物物，可可使使产产酶酶量量显显著著提提高高。乳乳糖糖诱诱导导-半半乳乳糖糖苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶。苷酶，纤维二糖诱导纤维素酶。n诱诱导导物物可可分分为为三三种种：酶酶的的作作用用底底物物、酶的反应产物酶的反应产物、酶的底物类似物酶的底物类似物。n有有些些酶酶的的合合成成受受到到阻阻遏遏物物的的阻阻遏遏作作用用，应
10、设法解除阻遏作用来提高酶的产量。应设法解除阻遏作用来提高酶的产量。2 2、控制阻遏物浓度、控制阻遏物浓度3 3、添加表面活性剂、添加表面活性剂n可可分分为为离离子子型型和和非非离离子子型型，离离子子型型对对细细胞胞有有毒毒害害作作用用，只只能能使使用用非非离离子子型型，可可聚聚集集在在细细胞胞膜膜上上，增增加加细细胞胞通通透透性性，有有利利于于酶酶的的分分泌泌，可可增增加酶的产量。加酶的产量。4 4、添加产酶促进剂、添加产酶促进剂n植植酸酸钙钙镁镁可可使使霉霉菌菌蛋蛋白白酶酶和和橘橘青青霉霉磷酸二酯酶的产量提高磷酸二酯酶的产量提高1-201-20倍。倍。第三节第三节 酶和细胞的固定化酶和细胞的
11、固定化n使用纯酶的缺点使用纯酶的缺点：只能使用一次，：只能使用一次，成本高，产品分离困难；酶溶液很成本高，产品分离困难；酶溶液很不稳定，容易变性和失活。不稳定，容易变性和失活。n固定化酶的优点固定化酶的优点：性能稳定；可反：性能稳定；可反复使用，降低了成本，易与产品分复使用，降低了成本，易与产品分离，简化下游操作。离，简化下游操作。一、固定化酶的制备一、固定化酶的制备n1 1、定义、定义n限制或固定于特定空间位置的酶，限制或固定于特定空间位置的酶，即经物理化学方法处理，使酶变成即经物理化学方法处理，使酶变成不易随水流失、运动受到限制，而不易随水流失、运动受到限制，而又能发挥催化作用的酶制剂。又
12、能发挥催化作用的酶制剂。n2 2、固定化酶的特点、固定化酶的特点n（1 1）、可可以以多多次次使使用用，而而且且在在多多数数情情况况下下，酶酶的的稳稳定定性性提提高高；（2 2）、反反应应后后，酶酶与与底底物物和和产产物物易易于于分分开开，产产物物中中无无残残留留酶酶，易易于于纯纯化化，产产品品质质量量高高；（3 3）、反反应应条条件件易易于于控控制制，可可实实现现转转化化反反应应的的连连续续化化和和自自动动控控制制；（4 4）、酶酶的的利利用用效效率率高高，单单位位酶酶催催化化的的底底物物量量增增加加，用用酶酶量量减减少少；（5 5）、比比水水溶溶性性酶酶更更适适合合于于多多酶反应。酶反应。
13、第四节第四节 酶工程在医药工业中的应用酶工程在医药工业中的应用n酶酶工工程程的的优优点点是是工工艺艺简简单单、效效率率高高、生生产产成成本本低低、环环境境污污染染小小、产产品品收收率率高高、纯纯度度好好、还还可可制制造造出出化化学学方方法法无无法法生生产产的产品。的产品。一、酶在疾病预防和治疗方面的应用一、酶在疾病预防和治疗方面的应用n1 1、蛋白酶、蛋白酶n临临床床上上使使用用最最早早、用用途途最最广广的的药药用用酶酶之之一。一。n消消化化剂剂，用用于于治治疗疗消消化化不不良良和和食食欲欲不不振振，使使用用时时常常常常与与淀淀粉粉酶酶、脂脂肪肪酶酶等等一一起起制制成成复复合合酶酶制制剂剂，以
14、以增增加加疗疗效效，片片剂剂，可可口服。口服。n消炎剂消炎剂，对各种炎症有很好的疗效，对各种炎症有很好的疗效，它能分解一些蛋白质和多肽，使炎症它能分解一些蛋白质和多肽，使炎症部位的坏死组织溶解，增加组织的通部位的坏死组织溶解，增加组织的通透性，抑制浮肿，促进病灶附近组织透性，抑制浮肿，促进病灶附近组织积液的排出并抑制肉芽的形成，可口积液的排出并抑制肉芽的形成，可口服、外敷和肌肉注射。服、外敷和肌肉注射。n蛋白酶蛋白酶经组织注射可治疗高血压，经组织注射可治疗高血压，由于蛋白酶催化运动迟缓素原及胰由于蛋白酶催化运动迟缓素原及胰血管舒张素原的部分肽段水解生成血管舒张素原的部分肽段水解生成运动迟缓素和
15、胰血管舒张素，从而运动迟缓素和胰血管舒张素，从而使血压下降。使血压下降。n2 2、-淀粉酶淀粉酶n消化药。消化药。n3 3、脂肪酶、脂肪酶n消化剂。消化剂。n假单胞菌脂肪酶能分解血液中的低假单胞菌脂肪酶能分解血液中的低密度脂蛋白和乳糜微粒，可用于预密度脂蛋白和乳糜微粒，可用于预防和治疗高血脂病。防和治疗高血脂病。4 4、右旋糖苷酶、右旋糖苷酶n水解右旋糖苷生产小分子产物，对水解右旋糖苷生产小分子产物，对龋齿有显著的预防作用，可加到牙龋齿有显著的预防作用，可加到牙膏和淑口水中。膏和淑口水中。n抗菌、消炎、镇痛作用，作用于细胞壁，抗菌、消炎、镇痛作用，作用于细胞壁，使其受到破坏，而使病原菌、腐败性
16、细使其受到破坏，而使病原菌、腐败性细菌等溶解死亡。菌等溶解死亡。5 5、溶菌酶、溶菌酶6 6、超氧化物歧化酶、超氧化物歧化酶n抗氧化、抗辐射、抗衰老、保护机抗氧化、抗辐射、抗衰老、保护机体的体的DNADNA、蛋白质和细胞膜免受超氧、蛋白质和细胞膜免受超氧负离子的破坏。对红斑狼疮、皮肤负离子的破坏。对红斑狼疮、皮肤炎、结肠炎、白内障、风湿性关节炎、结肠炎、白内障、风湿性关节炎、氧中毒等疾病有显著疗效，对炎、氧中毒等疾病有显著疗效，对辐射有防护作用。辐射有防护作用。n治疗乳糖缺乏症，有些人或婴儿肠道中治疗乳糖缺乏症，有些人或婴儿肠道中缺乏乳糖酶，饮用含有乳糖的牛奶等食缺乏乳糖酶，饮用含有乳糖的牛奶
17、等食品时，由于不能分解乳糖，在肠道中，品时，由于不能分解乳糖，在肠道中，乳糖会因为细菌分解而产生有机酸，刺乳糖会因为细菌分解而产生有机酸，刺激肠道引起呕吐。激肠道引起呕吐。7 7、乳糖酶、乳糖酶n8 8、链激酶、链激酶n可催化纤维蛋白酶原，激活成纤维可催化纤维蛋白酶原，激活成纤维蛋白酶，将纤维蛋白水解，使血栓蛋白酶，将纤维蛋白水解，使血栓溶解。溶解。n9 9、尿激酶、尿激酶n溶解血栓。溶解血栓。二、固定化细胞法生产二、固定化细胞法生产6-6-氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸n青青霉霉素素G G经经青青霉霉素素酰酰化化酶酶作作用用，水水解解除除去去侧侧链链后后的的产产物物称称为为6-6-氨氨基基青青霉霉
18、烷烷酸酸（6-APA6-APA），也也称称无无侧侧链链青青霉霉素素。它它是是生生产产半半合合成成青青霉霉素素的的最最基基本本原原料。料。6-氨基青霉烷酸氨基青霉烷酸（6-APA）技术技术路线路线n产青霉素酰化酶产青霉素酰化酶第五节第五节 酶工程研究进展酶工程研究进展n包包括括酶酶的的修修饰饰、酶酶的的人人工工模模拟拟、有有机相的酶反应和基因工程酶的构机相的酶反应和基因工程酶的构建。建。一、酶的化学修饰一、酶的化学修饰n1 1、目的和意义、目的和意义n天天然然酶酶的的缺缺陷陷：易易于于变变性性失失活活（酸酸、碱碱、有有机机溶溶剂剂、热热）；容容易易受受产产物物和和抑抑制制剂剂的的抑抑制制；工工业
19、业反反应应要要求求的的酸酸度度和和温温度度并并不不总总是是在在酶酶反反应应的的最最适适酸酸度度和和温温度度范范围围内内；底底物物不不溶溶于于水水，或或酶酶的的米米式式常常数数过过高高；酶酶做做为为药药物物在在体体内内的的半半衰衰期期较较短短等等因因素素限限制制了了酶酶制制剂剂的的应用。应用。n酶的化学修饰酶的化学修饰：对酶在分子水平上：对酶在分子水平上用化学方法进行改造，即在体外将用化学方法进行改造，即在体外将酶分子通过人工方法与一些化学基酶分子通过人工方法与一些化学基团，特别是具有生物相容性的大分团，特别是具有生物相容性的大分子进行共价连接，从而改变酶分子子进行共价连接，从而改变酶分子的酶学
20、性质的技术。的酶学性质的技术。n目的目的：提高酶的稳定性、降低或消除：提高酶的稳定性、降低或消除酶分子的免疫原性（医药）。酶分子的免疫原性（医药）。n意义意义: :扩大了酶制剂的应用范围，同时扩大了酶制剂的应用范围，同时化学修饰法也是研究酶的活性中心性化学修饰法也是研究酶的活性中心性质的重要手段。质的重要手段。2 2、常用化学修饰剂、常用化学修饰剂n要求：要求：n较大相对分子量；较大相对分子量；n良好的生物相容性和水溶性；良好的生物相容性和水溶性；n分子表面有较多的反应活性基团；分子表面有较多的反应活性基团；修饰后酶的半衰期较长。修饰后酶的半衰期较长。常用修饰剂常用修饰剂 n糖糖及及糖糖的的衍
21、衍生生物物：右右旋旋糖糖苷苷、右右旋旋糖糖苷苷硫酸酯，糖肽，葡聚糖凝胶，聚乳；硫酸酯，糖肽，葡聚糖凝胶，聚乳；n高分子多聚物高分子多聚物：聚乙二醇，聚乙烯醇；：聚乙二醇，聚乙烯醇；n生生物物大大分分子子：肝肝素素，血血浆浆蛋蛋白白质质，聚聚氨氨基酸；基酸；n双功能试剂双功能试剂：戊二醛，二胺；：戊二醛，二胺；n其其他他：固固定定化化酶酶载载体体，糖糖基基化化试试剂剂，甲甲基基化化试试剂剂，乙乙基基化化试试剂剂和和小小分分子子有有机机化化合物。合物。3 3、修饰方法、修饰方法n（1 1）、修饰酶的功能基团）、修饰酶的功能基团n酶酶分分子子中中可可解解离离的的基基团团如如氨氨基基、羟羟基基、羧羧基
22、基、巯巯基基等等都都可可以以修修饰饰。如如脱脱氨氨基基可可消消除除酶酶分分子子表表面面氨氨基基酸酸的的电电荷荷；通通过过碳碳二二亚亚胺胺反反应应，可可以以改改变变侧侧链链羧羧基基的的性性质质；通通过过酰酰化化反反应应可改变侧链羟基的性质。可改变侧链羟基的性质。 n（2 2）、）、酶分子内或分子间进行交联酶分子内或分子间进行交联，应用某些双功能试剂可将酶蛋白分子应用某些双功能试剂可将酶蛋白分子之间、亚基之间或分子内部不同肽链之间、亚基之间或分子内部不同肽链部分进行共价交联。部分进行共价交联。n（3 3）修修饰饰酶酶的的辅辅因因子子，可可将将辅辅因因子子共共价价结结合合在在酶酶分分子子上上，或或引
23、引入入新新的的或修饰过的具有强反应性的辅因子。或修饰过的具有强反应性的辅因子。n（4 4）、酶酶与与高高分分子子化化合合物物结结合合，蛋蛋白质或多糖结合后可提高稳定性。白质或多糖结合后可提高稳定性。4 4、修饰酶的特性、修饰酶的特性n稳定性提高、抗各类失活因子的能稳定性提高、抗各类失活因子的能力提高、抗原性消除、体内半衰期力提高、抗原性消除、体内半衰期延长、最适酸度改变、酶化学性质延长、最适酸度改变、酶化学性质改变，对组织分布能力改变。改变，对组织分布能力改变。5 5、前景、前景n酶分子经过化学修饰后，并不是所酶分子经过化学修饰后，并不是所有的缺点都可以克服了，并且修饰有的缺点都可以克服了，并
24、且修饰的结果难以预测，今后，应选用更的结果难以预测，今后，应选用更多的、合适的修饰方法，如使用基多的、合适的修饰方法，如使用基因工程法、蛋白质工程法、人工模因工程法、蛋白质工程法、人工模拟法和某些物理修饰法等，使酶的拟法和某些物理修饰法等，使酶的性质进一步改善。性质进一步改善。二、有机相的酶反应二、有机相的酶反应n有有机机相相酶酶反反应应指指酶酶在在具具有有有有机机溶溶剂剂存存在的介质中所进行的催化反应。在的介质中所进行的催化反应。n这这是是一一种种在在极极端端条条件件（逆逆性性环环境境）下下进进行行的的酶酶反反应应，它它可可以以改改变变某某些些酶酶的的性质。性质。n有有机机相相酶酶反反应应的
25、的优优点点： 增增加加疏疏水水性性底底物物或或产产物物的的溶溶解解度度；热热力力学学平平衡衡向向合合成成方方向向移移动动；可可抑抑制制有有水水参参与与的的副副反反应应；酶酶不不溶溶于于有有机机溶溶剂剂，易易于于回回收收再再利利用用；容容易易从从低低沸沸点点的的溶溶剂剂中中分分离离纯纯化化产产物物；酶酶的的热热稳稳定定性性提提高高，酸酸度度适适用用范范围围扩扩大大；无无微微生生物物污污染染；能能测测定定某某些些在在水水介介质质中中不不能能测测定定的的常常数数；固固定定化化酶酶方方法法简简单，可以只沉淀在载体表面。单，可以只沉淀在载体表面。n有有机机相相酶酶反反应应的的溶溶剂剂体体系系 水水- -
26、水水溶溶性性溶溶剂剂均均相相体体系系；水水- -水水不不溶溶性性溶溶剂剂两两相相体系；单相有机溶剂体系。体系；单相有机溶剂体系。n有有机机相相的的酶酶工工程程 但但在在有有机机相相中中，天天然然酶酶容容易易变变性性而而失失活活、分分散散性性差差、容容易易聚聚结结成成团团。固固定定化化酶酶，酶酶的的化化学学修修饰饰和和表表面活性剂包埋。面活性剂包埋。三、基因工程酶的构建三、基因工程酶的构建n1 1、酶基因的克隆和表达、酶基因的克隆和表达n重重组组DNADNA技技术术克克隆隆各各种种天天然然酶酶的的基基因因，在在微微生生物物中中表表达达，筛筛选选出出高高产产菌菌株株，可以通过发酵大量生产所需要的酶。可以通过发酵大量生产所需要的酶。n2 2、酶基因的遗传修饰、酶基因的遗传修饰n人为地将酶基因中个别核苷酸加以人为地将酶基因中个别核苷酸加以修饰或更换，从而改变酶蛋白分子修饰或更换，从而改变酶蛋白分子中某个或几个氨基酸，不仅改变酶中某个或几个氨基酸，不仅改变酶的结构，的结构，而且改变而且改变酶酶的催化活力，的催化活力，专一性及稳定性。专一性及稳定性。
