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1、第八章 电泳分离技术本章主要内容本章主要内容n一、概述一、概述n二、电泳技术原理二、电泳技术原理n三、电泳技术问题和对策三、电泳技术问题和对策n四、在生物技术研究上应用的电泳技四、在生物技术研究上应用的电泳技术术n五、生物技术产品分离纯化上应用的五、生物技术产品分离纯化上应用的电泳技术电泳技术2一、概述一、概述 电泳技术电泳技术是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸是指带电荷的供试品（蛋白质、核苷酸等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼等）在惰性支持介质（如纸、醋酸纤维素、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于电场的脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶等）中，于电场的作用下，向其对应的电极方向按各自的速度进作
2、用下，向其对应的电极方向按各自的速度进行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的行泳动，使组分分离成狭窄的区带，用适宜的检测方法记录其电泳区带图谱或计算其含量检测方法记录其电泳区带图谱或计算其含量(%)的方法。的方法。 应用最普遍的是以应用最普遍的是以滤纸滤纸或或凝胶凝胶作为载体，故称作为载体，故称为纸电泳法或凝胶电泳法。为纸电泳法或凝胶电泳法。3电泳技术发展简史电泳技术发展简史 n 1809年俄国物理学家年俄国物理学家首次发现电首次发现电泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正泳现象。他在湿粘土中插上带玻璃管的正负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中负两个电极，加电压后发现正极玻璃管中原有的水层变混
3、浊，即带负电荷的粘土颗原有的水层变混浊，即带负电荷的粘土颗粒向正极移动，这就是电泳现象。粒向正极移动，这就是电泳现象。n 1909年年Michaelis首次将胶体离子在电场首次将胶体离子在电场中的移动称为电泳。他用不同中的移动称为电泳。他用不同pH的溶液的溶液在在U形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的形管中测定了转化酶和过氧化氢酶的电泳移动和等电点。电泳移动和等电点。4n1937年瑞典年瑞典Uppsala大学的大学的Tiselius对电对电泳仪器作了改进，创造了泳仪器作了改进，创造了Tiselius电泳仪，电泳仪，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，建立了研究蛋白质的移动界面电泳方法，并首次证明了
4、血清是由白蛋白及并首次证明了血清是由白蛋白及、球蛋白组成的，由于球蛋白组成的，由于Tiselius在电泳技术在电泳技术方面作出的开拓性贡献而获得了方面作出的开拓性贡献而获得了1948年的年的诺贝尔化学奖。诺贝尔化学奖。5n从本世纪从本世纪50年代起，特别是年代起，特别是1950年年Durrum用纸电泳进行了各种蛋白质的分用纸电泳进行了各种蛋白质的分离以后，开创了利用各种固体物质（如各离以后，开创了利用各种固体物质（如各种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀种滤纸、醋酸纤维素薄膜、琼脂凝胶、淀粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。粉凝胶等）作为支持介质的区带电泳方法。6n 1959年年Raymon
5、d和和Weintraub利用人工利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代。分辨率，开创了近代电泳的新时代。30多多年来，聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学年来，聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度：析鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度：即即电泳纯电泳纯（一维电泳一条带或二维电泳（一维电泳
6、一条带或二维电泳一个点）的标准分析鉴定方法，至今仍被一个点）的标准分析鉴定方法，至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段，即最后、最准确的手段，即Last Check 7n由由80年代发展起来的新的毛细管电泳技术，年代发展起来的新的毛细管电泳技术，是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展，是化学和生化分析鉴定技术的重要新发展，己受到人们的充分重视。己受到人们的充分重视。 8电泳技术的重要性电泳技术的重要性n电泳技术是一种先进的检测手段，与其它电泳技术是一种先进的检测手段，与其它先进技术相配合，能创造出惊人的成果，先进技术相配合，能创造出惊人
7、的成果，可使人们用较少代价获得最优效益。比如可使人们用较少代价获得最优效益。比如它对解决当前人类所面临的食品、能源、它对解决当前人类所面临的食品、能源、环境和疾病等一系列迫切问题，都有积极环境和疾病等一系列迫切问题，都有积极作用，显示出强大的生命力。因此电泳技作用，显示出强大的生命力。因此电泳技术正越来越多地为人们所重视术正越来越多地为人们所重视,广泛应用广泛应用于各个领域。于各个领域。 9n在医院临床检验中，利用电泳技术分析血在医院临床检验中，利用电泳技术分析血清中的酶及同工酶，可以诊断肾病综合症、清中的酶及同工酶，可以诊断肾病综合症、心绞痛、肝硬化、肝癌、多发生骨髓瘤、心绞痛、肝硬化、肝癌
8、、多发生骨髓瘤、恶性肿瘤、乙型肝炎、慢性肝炎等疾病；恶性肿瘤、乙型肝炎、慢性肝炎等疾病；分析血色素组份，可以判定血细胞的正常分析血色素组份，可以判定血细胞的正常与异常与异常 10n一九八四年九月，美国在航天飞机上首先使用一九八四年九月，美国在航天飞机上首先使用电泳技术提炼了一种治疗糖尿病的新药电泳技术提炼了一种治疗糖尿病的新药-胰胰岛素岛素细胞，为全世界上百万糖尿病患者带来了细胞，为全世界上百万糖尿病患者带来了福音。电泳技术在太空的应用，更使它一时身福音。电泳技术在太空的应用，更使它一时身价百倍，由于太空无重力作用，电泳液中不存价百倍，由于太空无重力作用，电泳液中不存在冷热对流现象，从而不影响
9、分离效果。被分在冷热对流现象，从而不影响分离效果。被分离的物质纯度高，成本低，如治疗血栓病的尿离的物质纯度高，成本低，如治疗血栓病的尿激酶，在太空生产，产量可以提高四百倍，售激酶，在太空生产，产量可以提高四百倍，售价可降低百分之九十，美国每年患血栓病的人价可降低百分之九十，美国每年患血栓病的人有一百多万，只此一项即可节约几亿美元。有一百多万，只此一项即可节约几亿美元。11 电泳分离：电泳分离：是利用带电粒子在电场中泳是利用带电粒子在电场中泳动速度的差别进行分离的方法。动速度的差别进行分离的方法。I.实验室中强有力的实验室中强有力的分析、鉴定和分离分析、鉴定和分离技技术术更大规模的制备应用。更大
10、规模的制备应用。II.与与HPLC相比在相比在可靠性、分辨率、使用可靠性、分辨率、使用的难易的难易度和成本上具优势。度和成本上具优势。III.在生物技术研究和产物分离纯化应用的在生物技术研究和产物分离纯化应用的是是区带电泳。区带电泳。12电泳分类电泳分类按分离的原理区分：按分离的原理区分：区带电泳区带电泳移界电泳移界电泳等速电泳等速电泳等电聚焦等电聚焦13 区带电泳区带电泳 ：是在半固相或胶状介质上加上：是在半固相或胶状介质上加上一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，一个点或一薄层样品溶液，然后加电场，分子在支持介质上或支持介质中迁移。分子在支持介质上或支持介质中迁移。是应用最广泛的电泳技术之一
11、。是应用最广泛的电泳技术之一。141516n按电场分：常压（按电场分：常压（500V，适用小分子），适用小分子）n仪器装置分：水平式、垂直式、悬架式仪器装置分：水平式、垂直式、悬架式17二、电泳技术原理二、电泳技术原理生物技术研究对象：生物技术研究对象：主要是核酸和蛋白质主要是核酸和蛋白质蛋白分子带电荷的基团：蛋白分子带电荷的基团：正电荷（氨基、亚氨正电荷（氨基、亚氨基、酰氨基）、负电荷（羧基、苯酚基、巯基、酰氨基）、负电荷（羧基、苯酚基、巯基）；基）；基团所带电荷的性质和数量随溶液环境（如基团所带电荷的性质和数量随溶液环境（如pH和离子强度）变化。和离子强度）变化。蛋白分子在电场内迁移所受到
12、的力（蛋白分子在电场内迁移所受到的力（F）与）与电场强度（电场强度（E）及蛋白分子的净电荷成正比）及蛋白分子的净电荷成正比关系。关系。18n另一种表示方法：另一种表示方法：n n由上式可知：由上式可知：蛋白质在电场内迁移速度与它的蛋白质在电场内迁移速度与它的净电荷成正比，与它的分子的半径及溶液的黏净电荷成正比，与它的分子的半径及溶液的黏度成反比。度成反比。19注意：注意：电泳使用的缓冲液的电泳使用的缓冲液的pH值、缓冲剂的类值、缓冲剂的类型、浓度及样品中的盐浓度均需要仔细选择。型、浓度及样品中的盐浓度均需要仔细选择。原因？原因？低离子低离子 溶液中，溶液中，带不同电荷的蛋白分子之间会发带不同电
13、荷的蛋白分子之间会发生相静电作用，形成大的分子团，从而影响到迁移生相静电作用，形成大的分子团，从而影响到迁移速度；速度；加大离子强度，加大离子强度，可减少此种情况，但会提高电流，可减少此种情况，但会提高电流，从而产生更多的热量，温度升高会促进蛋白质分子从而产生更多的热量，温度升高会促进蛋白质分子扩散，使电泳区带变宽，降低分辨率。扩散，使电泳区带变宽，降低分辨率。20应用最广泛的聚应用最广泛的聚丙烯酰胺电泳，丙烯酰胺电泳，具有分子筛作用。具有分子筛作用。实验证明实验证明“在分在分子筛范围子筛范围”内蛋内蛋白质的电泳迁移白质的电泳迁移速率（速率（u）与蛋白）与蛋白质分子量的对数质分子量的对数成线性
14、关系，如成线性关系，如图。图。21三、电泳技术问题和对策三、电泳技术问题和对策影响迁移率的有影响迁移率的有3个因素：个因素：各组分的分子净电荷数；各组分的分子净电荷数；分子量；分子量；电泳系统介质的有效黏滞度。电泳系统介质的有效黏滞度。此此3因素又受控于电泳条件。因素又受控于电泳条件。22电泳缓冲液的电泳缓冲液的pH值（决定蛋白分子所带的净值（决定蛋白分子所带的净电荷）电荷） 调调pH值应在允许的范围内（值应在允许的范围内（pH4.5-9.5）尽可）尽可能使各组分分子的净电荷数的差异加大。能使各组分分子的净电荷数的差异加大。选择适当的缓冲系统（缓冲液种类、浓度和选择适当的缓冲系统（缓冲液种类、
15、浓度和其他电解质浓度。）其他电解质浓度。）这些都会影响到蛋白质所带的净电荷及蛋白这些都会影响到蛋白质所带的净电荷及蛋白分子间的相互作用。分子间的相互作用。表面活性剂的存在会影响蛋白分子间的相互表面活性剂的存在会影响蛋白分子间的相互作用，同时消除了不同蛋白质分子的固有电作用，同时消除了不同蛋白质分子的固有电荷差异。荷差异。适当的凝胶孔径和添加增加介质黏度的物质适当的凝胶孔径和添加增加介质黏度的物质（蔗糖或甘油）（蔗糖或甘油） 会影响介质的有效黏滞度。会影响介质的有效黏滞度。23问题：电泳过程中产热？问题：电泳过程中产热？n后果：后果：a)蛋白质变性，分离失去意义；蛋白质变性，分离失去意义；b)温
16、度升高引起对流，蛋白质区带扩散，降温度升高引起对流，蛋白质区带扩散，降低分辨率。低分辨率。解决问题：解决问题：W（热量）（热量）=IE I是电流；是电流；E是电压是电压按按Ohm定律还有如下关系：定律还有如下关系：W=I2/K K是是电导率电导率24n由上式知降低产热的方法：由上式知降低产热的方法：降低电流和降低降低电流和降低电压。电压。n由由F=EZ知迁移率只与电压有关。知迁移率只与电压有关。n综上得：综上得：用降低电流、提高电压的方法对降热用降低电流、提高电压的方法对降热更有效。更有效。n要降低电流，要降低电流，要求使用的缓冲液是低离子浓度，要求使用的缓冲液是低离子浓度，但低离子浓度也会使
17、电导率降低，使产热增加，但低离子浓度也会使电导率降低，使产热增加，同时，会增加蛋白质分子间的相互作用。故需同时，会增加蛋白质分子间的相互作用。故需兼顾兼顾三个方面三个方面的影响。的影响。25n另一关系式：另一关系式：n应用条件是在应用条件是在一个绝热、不流动的系统中。一个绝热、不流动的系统中。n由上式可知：由上式可知：增加缓冲液体积、热容量或增加缓冲液体积、热容量或密度均可控制温度升高。但实际很难应用。密度均可控制温度升高。但实际很难应用。n有效的方法是对电泳系统进行冷却。有效的方法是对电泳系统进行冷却。影响影响冷却效果的三大因素：冷却效果的三大因素：26n冷却面积（热传递面积）。大面积：冷却
18、面积（热传递面积）。大面积：如采如采用毛细管或薄层或圆桶状电泳。矛盾：大的面用毛细管或薄层或圆桶状电泳。矛盾：大的面积会增加电渗，影响分辨率。积会增加电渗，影响分辨率。n电泳系统和冷却系统材质的热传递系数电泳系统和冷却系统材质的热传递系数n热传递的推动力热传递的推动力温差。温差。 低温冷却最有低温冷却最有效。同时，冷却液的流动速度也是很大影响。效。同时，冷却液的流动速度也是很大影响。27n提高电泳效果和分辨率可采以下措施：提高电泳效果和分辨率可采以下措施：增加缓冲系统黏度或增加介质的黏滞度增加缓冲系统黏度或增加介质的黏滞度均可减少扩散或对流。均可减少扩散或对流。减少热扩散层厚度减少热扩散层厚度
19、dc，在微重力条件下进行电泳。在微重力条件下进行电泳。28电渗：电渗：当固体与液体接触时，固体表面由于某种当固体与液体接触时，固体表面由于某种原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有原因带一种电荷，则因静电引力使其周围液体带有相反电荷，在液相反电荷，在液-固界面形成固界面形成双电层双电层，二者之间存，二者之间存在电位差。在电位差。当液体两端施加电压时，就会发生液体当液体两端施加电压时，就会发生液体相对固体表面的移动，这种液体相对固体表面的移相对固体表面的移动，这种液体相对固体表面的移动就称动就称。29四、在生物技术研究上应用的电泳技术四、在生物技术研究上应用的电泳技术n主要是对核酸和蛋白的
20、分析、分离、鉴定、主要是对核酸和蛋白的分析、分离、鉴定、检测。检测。n优点：其灵敏度高、重复性好、测定范围优点：其灵敏度高、重复性好、测定范围宽、结果直观等。宽、结果直观等。n研究中应用最多的是：研究中应用最多的是：平板电泳（琼脂糖平板电泳（琼脂糖凝胶平板电泳、聚丙烯酰胺凝胶平板电泳、凝胶平板电泳、聚丙烯酰胺凝胶平板电泳、SDS-聚丙烯酰胺电泳等）聚丙烯酰胺电泳等） 定性分析定性分析n毛细管电泳即可定性也可定量。毛细管电泳即可定性也可定量。30n发展：发展：新的电泳载体新的电泳载体淀粉胶、纸、纤维素及其衍生物淀粉胶、纸、纤维素及其衍生物琼琼脂糖、聚丙烯酰胺。脂糖、聚丙烯酰胺。显色技术显色技术氨
21、基黑氨基黑考玛斯亮兰考玛斯亮兰银染法（灵敏度银染法（灵敏度提高提高100倍）倍）荧光标记、放射性标记。荧光标记、放射性标记。电泳仪及相关设备和材料电泳仪及相关设备和材料31五、生物技术产品分离纯化上五、生物技术产品分离纯化上应用的电泳技术应用的电泳技术n大规模电泳技术仍然处于发展阶段。大规模电泳技术仍然处于发展阶段。n（一）平板电泳（适于批式操作，微克级（一）平板电泳（适于批式操作，微克级到毫克级）到毫克级）n一般平板电泳，一般平板电泳，如淀粉凝胶电泳、琼脂凝如淀粉凝胶电泳、琼脂凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。鉴定和检胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳。鉴定和检测及小量样品制备。测及小量样品制备。n特殊
22、平板电泳，特殊平板电泳，其使用的载体不仅仅为支其使用的载体不仅仅为支持物，还起分离作用。主要是鉴定和检测，持物，还起分离作用。主要是鉴定和检测，也可用于小量样品制备。也可用于小量样品制备。32n1、水平平板电泳、水平平板电泳n基本过程：基本过程：将凝胶和交联剂混合将凝胶和交联剂混合于玻于玻璃片上进行聚合形成凝胶平板璃片上进行聚合形成凝胶平板两端加两端加上电极液湿润的滤纸条或泡沫塑料条（与上电极液湿润的滤纸条或泡沫塑料条（与两端电极对准）两端电极对准）将用于加样的滤纸条将用于加样的滤纸条放在凝胶平板的适当位置放在凝胶平板的适当位置加样加样加加盖电泳。盖电泳。n结束后，结束后，切下一小条凝胶，显色
23、后，按区切下一小条凝胶，显色后，按区带位置，将所需的组分切下，然后用适当带位置，将所需的组分切下，然后用适当缓冲液提取。缓冲液提取。33n为了避免区带分割的盲目性，可用等电点电泳：为了避免区带分割的盲目性，可用等电点电泳：电泳缓冲液的电泳缓冲液的pH与目的蛋白等电点相同，目的与目的蛋白等电点相同，目的蛋白不迁移，保留在加样处，可多次加样。但蛋白不迁移，保留在加样处，可多次加样。但对在等电点容易发生沉淀和凝聚的蛋白不适用。对在等电点容易发生沉淀和凝聚的蛋白不适用。n注意：注意：电泳前，需测定目的蛋白质在电泳缓冲电泳前，需测定目的蛋白质在电泳缓冲液中不移动液中不移动pH值，因缓冲液中离子会与蛋白质
24、值，因缓冲液中离子会与蛋白质分子结合，而使等电点改变。要与等电聚焦测分子结合，而使等电点改变。要与等电聚焦测定的等电点区别开。定的等电点区别开。n电渗：影响迁移率和分辨率。电渗：影响迁移率和分辨率。用纯化的载体可减少固定电荷、减少电渗，但用纯化的载体可减少固定电荷、减少电渗，但不能消除。另加入与之相反电荷的材料（如不能消除。另加入与之相反电荷的材料（如DEAE-Sephadex）可中和电渗作用。）可中和电渗作用。34n2、垂直平板电泳、垂直平板电泳n夹心平板式（防止载体表面与缓冲液直接接触夹心平板式（防止载体表面与缓冲液直接接触造成损失）造成损失）n基本过程：基本过程：n可用紫外光检测或显色法
25、找出目的蛋白区带。可用紫外光检测或显色法找出目的蛋白区带。后用缓冲液提取目的蛋白，一般为毫克级。后用缓冲液提取目的蛋白，一般为毫克级。n增大平板的厚度可扩大制备量。增大平板的厚度可扩大制备量。n增加平板长度效果不大，且厚度增加也有限增加平板长度效果不大，且厚度增加也有限（太厚载体温度增高）。（太厚载体温度增高）。n一般来说，冷却系统很有限的情况下，凝胶厚一般来说，冷却系统很有限的情况下，凝胶厚度不超过度不超过18mm。35n分析电泳上样是按样品中总蛋白质量计分析电泳上样是按样品中总蛋白质量计算的；算的；n制备电泳上样是以目的蛋白为主要考虑制备电泳上样是以目的蛋白为主要考虑对象。对象。如目的蛋白
26、在样品中含量比例很低，如目的蛋白在样品中含量比例很低，且目的蛋白与杂蛋白区带邻近，分离目的蛋白且目的蛋白与杂蛋白区带邻近，分离目的蛋白区带很困难，最好进行预分离；否则上样量按区带很困难，最好进行预分离；否则上样量按总蛋白量考虑。总蛋白量考虑。n制备电泳上样量：制备电泳上样量：PAGE0.1mg/cm；IEF 1.0mg/cm；多相缓冲电泳（；多相缓冲电泳（MBE） 10mg/cm。36n（二）连续凝胶电（二）连续凝胶电泳泳n一种如右图一种如右图n关键是洗脱池设计关键是洗脱池设计此法回收目的产物浓度此法回收目的产物浓度很低；因产热问题限制很低；因产热问题限制凝胶柱的直径扩大，使凝胶柱的直径扩大，
27、使处理量很小。处理量很小。37n另一种是在垂直另一种是在垂直PAGE基础上发展起来。改进：基础上发展起来。改进：平板改薄的圆桶状，使设备体积变小。平板改薄的圆桶状，使设备体积变小。电场作用，各区带依次走出凝胶、洗脱、收集电场作用，各区带依次走出凝胶、洗脱、收集特殊结构的洗脱腔保证洗脱区带不相混合，分辨特殊结构的洗脱腔保证洗脱区带不相混合，分辨率高。率高。Bio-Rad开发连续洗脱电泳仪特点：开发连续洗脱电泳仪特点：可进行可进行PAGE，也可用于，也可用于SDS-PAGE；上样量为上样量为100ng-50mg总蛋白；总蛋白；可连续收集分离的蛋白质；上样简单，仅需几分可连续收集分离的蛋白质；上样简
28、单，仅需几分钟；钟；电泳分离时间电泳分离时间4-8h 。占总蛋白占总蛋白2%的不同分子量的蛋白也可纯化为单一的不同分子量的蛋白也可纯化为单一区；可与紫外检测和部分收集器连接。区；可与紫外检测和部分收集器连接。3839n对蛋白进行预纯对蛋白进行预纯化后，再进行电化后，再进行电泳分离效果更好，泳分离效果更好，如藻青蛋白粗提如藻青蛋白粗提取物经等电聚焦取物经等电聚焦纯化后的纯化后的SDS-PAGE效果如图。效果如图。40（三）等电聚焦电泳（三）等电聚焦电泳含多氨基多羧基的一系列聚合物形成的两性含多氨基多羧基的一系列聚合物形成的两性电解质在电场作用下能形成一个从阳极到阴电解质在电场作用下能形成一个从阳
29、极到阴极极pH逐渐增加的梯度。逐渐增加的梯度。关键：关键：调配稳定的连续调配稳定的连续pH梯度。一般用氨基梯度。一般用氨基酸混合物或聚氨基羧酸的缓冲液。酸混合物或聚氨基羧酸的缓冲液。 原理如下图原理如下图管式等电聚焦电泳和平板等电聚焦电泳。管式等电聚焦电泳和平板等电聚焦电泳。管式结构如下图管式结构如下图4142n特点：特点：n分离性能极高，要消除分子扩散引起的分离性能极高，要消除分子扩散引起的分离度下降。分离度下降。nIEF可有效分离只有一个氨基酸排列顺序可有效分离只有一个氨基酸排列顺序不同的两种蛋白质。不同的两种蛋白质。n缺点：缺点：载体两性电解质对产品产生污染；载体两性电解质对产品产生污染
30、；pH梯度的稳定性不高；梯度的稳定性不高；操作过程中易发生凝胶脱水起皱现象。操作过程中易发生凝胶脱水起皱现象。4344n柱式电泳时，柱式电泳时，一般要制备密度梯度，一般要制备密度梯度，防止对流和分离的区带混合。防止对流和分离的区带混合。n密度梯度材料：密度梯度材料：蔗糖、甘油、聚乙二蔗糖、甘油、聚乙二醇、甘露醇、右旋糖酐和聚蔗糖等。醇、甘露醇、右旋糖酐和聚蔗糖等。n柱内分重相（加有蔗糖）和轻相（无蔗柱内分重相（加有蔗糖）和轻相（无蔗糖）。糖）。n电泳结束后，电泳结束后，根据需要收集流出液，每根据需要收集流出液，每管收集量应适当，过大会降低分辨率。管收集量应适当，过大会降低分辨率。n在放出过程中
31、，可进行紫外检测。在放出过程中，可进行紫外检测。45改进：改进：1）旋管等电聚）旋管等电聚焦电泳焦电泳样品和两性电解质样品和两性电解质混合装入管内，并混合装入管内，并绕在圆柱上成螺旋绕在圆柱上成螺旋，将管的两端放到，将管的两端放到电极槽中电泳。电极槽中电泳。电泳结束后，分割电泳结束后，分割成几段，分别倾出成几段，分别倾出电泳液。电泳液。46n2）水平旋转等电聚焦电泳）水平旋转等电聚焦电泳n针对垂直柱式等电聚焦电泳存在的问题改进：针对垂直柱式等电聚焦电泳存在的问题改进：n电泳柱横放，用平行多孔的聚酯膜分隔（避免电泳柱横放，用平行多孔的聚酯膜分隔（避免对流）；对流）；n电泳柱绕中心轴旋转（克服重力
32、和对流对聚焦电泳柱绕中心轴旋转（克服重力和对流对聚焦区带的影响）；区带的影响）；n用离子交换膜将电极室与电泳室隔开（防止酸、用离子交换膜将电极室与电泳室隔开（防止酸、碱电极液对蛋白质的干扰）；碱电极液对蛋白质的干扰）；n柱内有冷却系统。柱内有冷却系统。4748（四）连续流动电（四）连续流动电泳泳纸电泳的基础上发展起纸电泳的基础上发展起来，滤纸为载体（减少来，滤纸为载体（减少组分在缓冲液中的扩散）组分在缓冲液中的扩散）。在垂直于电泳缓冲液。在垂直于电泳缓冲液方向施加电场，不同组方向施加电场，不同组分会在滤纸上形成不同分会在滤纸上形成不同抛物线状的轨迹。抛物线状的轨迹。4950n影响电泳效果的因素
33、：影响电泳效果的因素：迁移率的差异、迁移率的差异、缓冲液流动速度、液流分割的级数、缓冲液流动速度、液流分割的级数、电场强度、滤纸载体长度等。电场强度、滤纸载体长度等。n载体：载体：滤纸滤纸微球状的微球状的Sephadex、Sepharose、Sephacel、Sephacry和纤维素粉等。和纤维素粉等。51n（五）无载体连续流动电泳（五）无载体连续流动电泳n1、连续自由流动电泳。、连续自由流动电泳。n实质：实质：与连续流动动载体电泳类似，只是不用与连续流动动载体电泳类似，只是不用载体；载体；n电泳槽：电泳槽：由两张塑料板之间形成由两张塑料板之间形成0.5-0.8mm的的间隙组成。间隙组成。n过
34、程：过程：在两张塑料板之间制成厚度为在两张塑料板之间制成厚度为0.5-0.8mm的电泳液膜槽的电泳液膜槽缓冲液自下而上平行缓冲液自下而上平行流过电泳槽流过电泳槽样品自下端某一点加入样品自下端某一点加入垂垂直缓冲液方向有电场直缓冲液方向有电场带不同电荷的组分向带不同电荷的组分向不同电极迁移不同电极迁移缓冲液在末端被分割、检测缓冲液在末端被分割、检测及分离收集。及分离收集。52n电泳过程中存在问题及解决：电泳过程中存在问题及解决：n电渗：电渗：电泳仪材料对组分的吸附作用，易电泳仪材料对组分的吸附作用，易形成双电层、形成双电层、导致电渗导致电渗的发生。一般在电的发生。一般在电泳槽内壁涂低电位的多聚物
35、或用共价结合泳槽内壁涂低电位的多聚物或用共价结合纤维素衍生物的方法，也可用适当增加离纤维素衍生物的方法，也可用适当增加离子强度的方法。子强度的方法。n产热引起电泳液的对流：产热引起电泳液的对流：使电泳缓冲液流使电泳缓冲液流动膜厚度尽可能不超过动膜厚度尽可能不超过0.5mm，加入蔗糖，加入蔗糖或甘油来提高黏度，并加强冷却能力。或甘油来提高黏度，并加强冷却能力。53n水电解产生的气泡对电泳缓冲液产生扰动水电解产生的气泡对电泳缓冲液产生扰动作用：作用：用半透膜将电极室与电泳槽分离，将气用半透膜将电极室与电泳槽分离，将气体排出。膜应是低电阻膜，以减少膜两侧的离体排出。膜应是低电阻膜，以减少膜两侧的离子
36、浓度差。多孔膜连续自由电泳。子浓度差。多孔膜连续自由电泳。多孔膜可起到稳多孔膜可起到稳定液流，防止扩定液流，防止扩散的作用。散的作用。影响因素：影响因素：多孔多孔膜的个数、电泳膜的个数、电泳仪的长度、缓冲仪的长度、缓冲液的流速、电场液的流速、电场强度。强度。542、环形连续流动电、环形连续流动电泳泳改进：液流在两个同改进：液流在两个同心圆桶电极之间的环心圆桶电极之间的环状空隙通过，利用外状空隙通过，利用外圆桶电极的旋转稳定圆桶电极的旋转稳定自由对流，缓冲液在自由对流，缓冲液在柱顶端由环状狭缝分柱顶端由环状狭缝分流器分成流器分成29份，并分份，并分别收集。别收集。5556操作时应注意：操作时应注
37、意：电泳缓冲液和电极电解电泳缓冲液和电极电解质通常选用具有相同电质通常选用具有相同电荷的组分。荷的组分。电泳缓冲液应预冷。电泳缓冲液应预冷。电泳样品的蛋白质浓度电泳样品的蛋白质浓度在在50mg/mL以上。以上。57特点：特点：可分离的物质范围宽，从小分子（染料）可分离的物质范围宽，从小分子（染料）到生物材料（真核细胞）均可。到生物材料（真核细胞）均可。如从如从制备的人抗制备的人抗嗜血因子嗜血因子VIII制剂中除去大量的纤维蛋白。制剂中除去大量的纤维蛋白。生物学生物学活性几活性几乎乎100%，收率，收率在在80%以上。以上。58可用于粗提物的分离纯化。可用于粗提物的分离纯化。如下图，乳酸脱氢酶（
38、如下图，乳酸脱氢酶（LDH）和）和富马酸脱氢酶（富马酸脱氢酶（MDH）清楚分开，同时可将）清楚分开，同时可将MDH的同功酶的同功酶分离，经两次电泳，酶活力回收达分离，经两次电泳，酶活力回收达90-100%。59思考题思考题n1、影响迁移率的因素及可控制这几个影响的条、影响迁移率的因素及可控制这几个影响的条件？件？n2、为什么电泳使用的缓冲液的、为什么电泳使用的缓冲液的pH值、缓冲剂的值、缓冲剂的类型、浓度以及样品中的盐浓度均需仔细选择类型、浓度以及样品中的盐浓度均需仔细选择？n3、电泳中影响冷却效果的三大因素？、电泳中影响冷却效果的三大因素？n4、分析电泳技术近年来在哪些方面发展？、分析电泳技术近年来在哪些方面发展？n5、等电聚焦电泳的原理？、等电聚焦电泳的原理？n6、如何解决电渗对电泳的影响？、如何解决电渗对电泳的影响？n7、连续流动电泳的原理？、连续流动电泳的原理？n8、对自由流动区带电泳来说，在电泳过程中主、对自由流动区带电泳来说，在电泳过程中主要有哪些问题？要有哪些问题？60
