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1、会计学1分子生物学实验分子生物学实验(shyn)实验实验(shyn)操作操作第一页，共25页。基因基因基因基因(jyn)(jyn)(jyn)(jyn)、载体、受体菌株、载体、受体菌株、载体、受体菌株、载体、受体菌株基因基因(jyn(jyn) )载体载体(zit(zit)菌株菌株质粒质粒酶切连接酶切连接转化转化质粒提取质粒提取PCRPCR第1页/共24页第二页，共25页。实验实验实验实验(shyn)(shyn)技术要求技术要求技术要求技术要求n n应掌握的实验技术应掌握的实验技术应掌握的实验技术应掌握的实验技术n n酶切酶切酶切酶切, ,连接连接连接连接n n凝胶回收凝胶回收凝胶回收凝胶回收n
2、n制备制备制备制备(zhbi)(zhbi)感受感受感受感受态细胞态细胞态细胞态细胞n n质粒提取质粒提取质粒提取质粒提取n nPCRPCRn n琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳n n考察指标考察指标考察指标考察指标(zhbio)(zhbio)n n电泳电泳电泳电泳n n电泳电泳电泳电泳n n感受态细胞转化感受态细胞转化感受态细胞转化感受态细胞转化率率率率n n电泳电泳电泳电泳n n电泳电泳电泳电泳n n电泳电泳电泳电泳第2页/共24页第三页，共25页。实验实验实验实验(shyn)(shyn)流程流程流程流程: :第一天第一天第一天第一天rhIL-18rhIL-18基因基
3、因(jyn)(jyn)的的PCRPCR产物产物质粒质粒pUC18pUC18BglBgl和和PstPst双双酶切酶切BamHBamH和和PstPst双双酶切酶切浓度浓度(nngd)1%(nngd)1%琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶电泳电泳凝胶回收凝胶回收配制配制 LB LB 液体与固体平板培养基液体与固体平板培养基灭菌灭菌第3页/共24页第四页，共25页。实验实验实验实验(shyn)(shyn)流程流程流程流程: :第二天第二天第二天第二天凝胶回收凝胶回收(hushu)(hushu)与溶液回与溶液回收收(hushu)(hushu)电泳电泳(din yn)(din yn)检验检验T4T4连接酶连接酶连接过夜
4、连接过夜E .E .colicoli DH5 DH5菌株菌株 3737过夜培养过夜培养第4页/共24页第五页，共25页。实验实验实验实验(shyn)(shyn)流程流程流程流程: :第三天第三天第三天第三天提取提取(tq)(tq)质粒质粒DNADNA浓度浓度(nngd)1%(nngd)1%琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶电泳电泳第5页/共24页第六页，共25页。实验实验实验实验(shyn)(shyn)流程流程流程流程: :第四天第四天第四天第四天PCRPCR浓度浓度(nngd)1%(nngd)1%琼脂糖琼脂糖凝胶电泳凝胶电泳第6页/共24页第七页，共25页。双酶切反应双酶切反应双酶切反应双酶切反应(fny
5、ng)(fnyng)（20L20L体系）体系）体系）体系）n nrhIL-18rhIL-18的的PCRPCR产物产物(chnw)(chnw)n nPCRPCR产物产物(chnw)10L(chnw)10Ln nBufferO2LBufferO2Ln n无菌水无菌水7L7Ln n质粒质粒pUC18pUC18n n质 粒质 粒1 0 L1 0 Ln nBamHBuffer2LBamHBuffer2Ln n无菌水无菌水 n nPstPst 1 L1 L37酶切反应(fnyng)3 小时。第7页/共24页第八页，共25页。Hybridsite第8页/共24页第九页，共25页。培养基配制培养基配制培养基配
6、制培养基配制(pizh)(pizh)(pizh)(pizh)n nLBLB液体培养基液体培养基n n每每1L1L配量配量(pi lin(pi lin ) )：n n蛋白胨蛋白胨 10g 10gn n酵母提取物酵母提取物 5g 5gn n氯化钠氯化钠 5g 5gn n调节调节pHpH到到n nLBLB固体培养基固体培养基: :n n每每100ml100ml液体培养基添加琼脂液体培养基添加琼脂n n每组准备：每组准备：n n1 1个个30ml 30ml 液体培养基液体培养基第9页/共24页第十页，共25页。灭菌灭菌灭菌灭菌(mijn)(mijn)(mijn)(mijn)n n1个30ml LB 液
7、体(yt)培养基n n微量移液器枪头（200uL）第10页/共24页第十一页，共25页。琼脂糖电泳琼脂糖电泳琼脂糖电泳琼脂糖电泳(dinyn)(dinyn)n n琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。n nDNA的分子大小n n琼脂糖浓度n nDNA分子的构象n n电源电压n n嵌入染料的存在n n离子强度(qingd)影响第11页/共24页第十二页，共25页。琼脂糖凝胶回收琼脂糖凝胶回收琼脂糖凝胶回收琼脂糖凝胶回收(hushu)(hushu)琼脂糖凝胶电泳检验，回收酶切产物：使用UNIQ-10柱式凝胶回收试剂盒分别对：目的基因片段(pindun)（片段(pindun)）溶液回收
8、载体片段(pin dun)（片段(pindun)）进行凝胶回收第12页/共24页第十三页，共25页。1. 1.通过琼脂糖凝胶电泳将目的通过琼脂糖凝胶电泳将目的DNADNA片段与其他片段尽可能分开，然后用干净的片段与其他片段尽可能分开，然后用干净的手术刀切下含需回收手术刀切下含需回收DNADNA的琼脂块，放入的琼脂块，放入EpEp管。管。2. 2.按按300L/100mg300L/100mg（3:13:1）的比例加入）的比例加入BindingBufferBindingBuffer，置于，置于50-6050-60水浴中水浴中10min10min，使凝胶彻底融化，使凝胶彻底融化(rnghu)(rng
9、hu)。期间，每。期间，每2min2min混匀一次。混匀一次。3. 3.将融化将融化(rnghu)(rnghu)的溶胶液转移到套在的溶胶液转移到套在2-ml2-ml收集管的收集管的UNIQ-10UNIQ-10柱中，室温放置柱中，室温放置 2min2min。12000rpm12000rpm室温离心室温离心1min1min。4. 4.取下取下UNIQ-10UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10UNIQ-10柱放入同一个收集管中，柱放入同一个收集管中，加入加入500LWashSolution500LWashSolution，12000rpm12000rpm室
10、温离心室温离心1min1min。5. 5.重复步骤重复步骤4 4一次。一次。琼脂糖凝胶回收琼脂糖凝胶回收琼脂糖凝胶回收琼脂糖凝胶回收(hushu)(hushu)第13页/共24页第十四页，共25页。6. 6.取下取下UNIQ-10UNIQ-10柱，倒掉收集管中的废液，将柱，倒掉收集管中的废液，将UNIQ-10UNIQ-10柱放入同柱放入同一个收集管中，一个收集管中，12000rpm12000rpm室温离心室温离心2min2min。7. 7.将将UNIQ-10UNIQ-10柱放入一根新的柱放入一根新的EpEp管中，在柱子膜中央加管中，在柱子膜中央加30L30LElutionBufferEluti
11、onBuffer，6060放置放置5min5min。8.12000rpm8.12000rpm室温离心室温离心1min1min，离心管中的液体即为回收的，离心管中的液体即为回收的DNADNA片片段。段。从溶液中回收从溶液中回收DNADNA： 根据溶液的体积，加入根据溶液的体积，加入(jir)3(jir)3倍体积的倍体积的BindingBufferBindingBuffer混匀。混匀。 以下操作参照琼脂糖凝胶中回收以下操作参照琼脂糖凝胶中回收DNADNA步骤步骤3-8.3-8.第14页/共24页第十五页，共25页。计算基因计算基因计算基因计算基因(jyn)(jyn)(jyn)(jyn)与载体片段比
12、例与载体片段比例与载体片段比例与载体片段比例n n紫外下观察基因与载体片段紫外下观察基因与载体片段(pindun)(pindun)的亮度的亮度n n基因的摩尔数基因的摩尔数 基因片段基因片段(pin(pindun)dun)亮度亮度/ /碱基数（碱基数（495bp495bp）n n载体的摩尔数载体的摩尔数 载体片段载体片段(pin(pindun)dun)亮度亮度/ /碱基数碱基数（2700bp2700bp）n n基因摩尔数基因摩尔数/ /载体摩尔数载体摩尔数 最佳最佳比例是比例是3 3：1 1第15页/共24页第十六页，共25页。连接反应连接反应连接反应连接反应在灭菌的离心管（在灭菌的离心管（P
13、CR管）管）中进行中进行20L体积反应体系中：体积反应体系中：10快速快速(kuis)连接连接缓冲液缓冲液2LrhIL-18双酶切产物双酶切产物XL质粒质粒pUC18双酶切产物双酶切产物YLT4-DNA连接酶连接酶1L201h，4过夜过夜第16页/共24页第十七页，共25页。感受态菌的制备感受态菌的制备(zhbi)（1 1）E.coliE.coliDH5DH5菌菌菌菌株株株株3737过过过过夜夜夜夜培培培培养养养养以以以以复复复复苏苏苏苏菌菌菌菌种种种种，取取取取过过过过夜夜夜夜培培培培养养养养的的的的菌菌菌菌液液液液加加加加入入入入到到到到3030mLmLLBLB培培培培养养养养基基基基中中
14、中中，3737，230230r/minr/min振振振振荡荡荡荡培培培培养养养养3 3h h，至至至至OD600OD600约约约约为为为为左右。左右。左右。左右。（2 2）无无无无菌菌菌菌条条条条件件件件(tiojin)(tiojin)下下下下，将将将将50mL50mL菌菌菌菌液液液液转转转转移移移移至至至至离离离离心心心心管管管管中中中中，冰冰冰冰上上上上放放放放置置置置1010minmin，使培养物冷却至，使培养物冷却至，使培养物冷却至，使培养物冷却至00。（3 3）在在在在预预预预冷冷冷冷44的的的的离离离离心心心心机机机机上上上上以以以以4000r/min4000r/min离离离离心心
15、心心10min10min，弃弃弃弃去去去去上上上上清清清清，加加加加入入入入30mL30mL预冷的预冷的预冷的预冷的2 2溶液重悬沉淀，冰浴上放置溶液重悬沉淀，冰浴上放置溶液重悬沉淀，冰浴上放置溶液重悬沉淀，冰浴上放置10min10min。（4 4）以以以以4000r/min4000r/min在在在在44离离离离心心心心10min10min，弃弃弃弃去去去去上上上上清清清清，每每每每30mL30mL初初初初始始始始培培培培养养养养物物物物用用用用预预预预冷的冷的冷的冷的2 2溶液重悬细胞沉淀，溶液重悬细胞沉淀，溶液重悬细胞沉淀，溶液重悬细胞沉淀，200L/200L/管分装。管分装。管分装。管分
16、装。第17页/共24页第十八页，共25页。pUC18-hIL-18pUC18-hIL-18重组重组(zhnz)(zhnz)质粒的转化质粒的转化（1 1）向分装有）向分装有）向分装有）向分装有200LE.coliDH5200LE.coliDH5菌株感受态细胞的菌株感受态细胞的菌株感受态细胞的菌株感受态细胞的EPEP管中加入管中加入管中加入管中加入(jir)10L(jir)10L的上步中得到的连接混合物，轻轻旋转以混合的上步中得到的连接混合物，轻轻旋转以混合的上步中得到的连接混合物，轻轻旋转以混合的上步中得到的连接混合物，轻轻旋转以混合内容物，冰浴上放置内容物，冰浴上放置内容物，冰浴上放置内容物，
17、冰浴上放置30min30min。（2 2）将该）将该）将该）将该EPEP管放入预加温至管放入预加温至管放入预加温至管放入预加温至4242的水浴中，放置的水浴中，放置的水浴中，放置的水浴中，放置90s90s，快速转，快速转，快速转，快速转移到冰浴中，使细胞冷却移到冰浴中，使细胞冷却移到冰浴中，使细胞冷却移到冰浴中，使细胞冷却12min12min。 （3 3）向）向）向）向EPEP管加入管加入管加入管加入(jir)800LLB(jir)800LLB培养基，转移至培养基，转移至培养基，转移至培养基，转移至3737摇床摇床摇床摇床上，上，上，上，150r/min150r/min，温育，温育，温育，温育
18、45min45min以复苏菌株。以复苏菌株。以复苏菌株。以复苏菌株。第18页/共24页第十九页，共25页。（4 4）将）将）将）将200L200L上述培养物加到含上述培养物加到含上述培养物加到含上述培养物加到含100g/mL100g/mL氨卞青霉氨卞青霉氨卞青霉氨卞青霉素的素的素的素的LBLB平板上，以玻璃涂布棒轻轻地将转化细胞平板上，以玻璃涂布棒轻轻地将转化细胞平板上，以玻璃涂布棒轻轻地将转化细胞平板上，以玻璃涂布棒轻轻地将转化细胞平铺平铺平铺平铺(pnp)(pnp)于琼脂平板表面。于琼脂平板表面。于琼脂平板表面。于琼脂平板表面。（5 5）将平板置于室温下至液体被完全吸收，倒置平）将平板置于
19、室温下至液体被完全吸收，倒置平）将平板置于室温下至液体被完全吸收，倒置平）将平板置于室温下至液体被完全吸收，倒置平皿，皿，皿，皿，3737过夜培养，筛选鉴定。过夜培养，筛选鉴定。过夜培养，筛选鉴定。过夜培养，筛选鉴定。第19页/共24页第二十页，共25页。UNIQ-10UNIQ-10柱式质粒小量柱式质粒小量(xioling)(xioling)抽抽提提1 1 将过夜培养的将过夜培养的1 12ml2ml细菌细菌12,000rpm12,000rpm离心离心1min1min，彻底去除上清。，彻底去除上清。2 2 加入加入250250 lSolutionIlSolutionI，用枪头或振荡器充分悬浮细菌
20、。，用枪头或振荡器充分悬浮细菌。3 3 加加入入250250 l lSolutionSolutionII II，立立即即温温和和混混匀匀（倾倾斜斜4545度度角角，顺顺一一个个方方向向(fngxing)(fngxing)，慢慢慢慢旋旋转离心管），使细菌裂解，室温放置转离心管），使细菌裂解，室温放置2 2分钟。分钟。4 4 加入加入350350 lSolutionIIIlSolutionIII，立即上下颠倒，立即上下颠倒5 51010次，使之充分中和，室温放置次，使之充分中和，室温放置5 5分钟。分钟。5 512,000rpm12,000rpm，离心，离心1010分钟。分钟。6 6 将将步步骤骤
21、5 5中中上上清清转转移移到到套套放放于于收收集集管管内内的的UNIQ-10UNIQ-10柱柱中中，室室温温放放置置2 2minmin后后，8,000rpm8,000rpm室室温离心温离心1min1min。7 7 弃弃收收集集管管中中的的废废液液，将将UNIQ-10UNIQ-10柱柱放放入入同同一一支支收收集集管管中中，吸吸取取500500 l lWashWashSolutionSolution到到UNIQ-10UNIQ-10柱，柱，10,000rpm10,000rpm室温离心室温离心1min1min。8 8 重复步骤重复步骤7 7。9 9 弃弃收收集集管管中中的的废废液液，将将UNIQ-10
22、UNIQ-10柱柱放放入入同同一一支支收收集集管管中中，12,000rpm12,000rpm室室温温离离心心2 2minmin以以彻彻底去除底去除WashSolutionWashSolution。1010 将将UNIQ-10UNIQ-10柱柱放放入入新新的的洁洁净净离离心心管管中中，加加3030 l lElutionElutionBufferBuffer，6060放放置置1010minmin后后，10,000rpm10,000rpm室温离心室温离心1 1分钟。离心管中的溶液即为所抽提的质粒分钟。离心管中的溶液即为所抽提的质粒DNADNA。第20页/共24页第二十一页，共25页。PCRPCR鉴定
23、阳性鉴定阳性(yngxng)(yngxng)克隆原理克隆原理第21页/共24页第二十二页，共25页。PCRPCR鉴定鉴定(jindng)(jindng)1 1、调整模板（、调整模板（、调整模板（、调整模板（ 待鉴定质粒）浓度至待鉴定质粒）浓度至待鉴定质粒）浓度至待鉴定质粒）浓度至5ng/L5ng/L2 2、按下列、按下列、按下列、按下列(xili)(xili)体系配制反应混合液，混匀，体系配制反应混合液，混匀，体系配制反应混合液，混匀，体系配制反应混合液，混匀， TemplateDNA1.0LTemplateDNA1.0L10PCRbuffer2.0L10PCRbuffer2.0LMgCl2M
24、gCl2（25mmol/L25mmol/L）1.5L1.5LM13PrimerM4(10mol/L)0.5LM13PrimerM4(10mol/L)0.5LM13PrimerRV(10mol/L)0.5LM13PrimerRV(10mol/L)0.5LdNTPsdNTPs（2mmol/L2mmol/L）2.0L2.0LTaqTaq酶酶酶酶 （5U/L5U/L）加加加加ddH2OddH2O至至至至20L20L外源基因外源基因(jyn)的特异引物：的特异引物：引物引物M13PrimerM4:（5-GTTTTCCCAGTCACGAC-3）引物引物M13PrimerRV:（5-CAGGAAACAGCT
25、AAC-3）第22页/共24页第二十三页，共25页。3 3PCRPCR反应循环条件设置反应循环条件设置9494变性反应变性反应30s30s；4545退火反应退火反应30s30s；7272延伸反应延伸反应30s30s。进行进行2020个循环后，最后一个循环个循环后，最后一个循环7272延长至延长至10min10min。4 4、检测、检测加加0.6L6LoadingBuffer0.6L6LoadingBuffer和和3L3L反应产物，混匀，点反应产物，混匀，点样电泳。样电泳。5 5、成像分析、成像分析(fnx)(fnx)在在1%1%的琼脂糖凝胶上点样电泳的琼脂糖凝胶上点样电泳0.51h0.51h，电泳结束凝胶，电泳结束凝胶成像分析成像分析(fnx)(fnx)结果。结果。第23页/共24页第二十四页，共25页。内容(nirng)总结会计学。分子生物学实验实验操作。基因、载体(zit)、受体菌株。BamH和Pst双酶切。目的基因片段（片段）溶液回收。基因摩尔数/载体(zit)摩尔数 最佳比例是3：1。pUC18-hIL-18重组质粒的转化。（4）将200L上述培养物加到含100g/mL氨卞青霉素的LB平板上，以玻璃涂布棒轻轻地将转化细胞平铺于琼脂平板表面。进行20个循环后，最后一个循环72延长至10min。5、成像分析第二十五页，共25页。
