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1、1第十三章第十三章 基因治疗原理与研基因治疗原理与研究进展究进展2根据靶细胞不同，基因治疗分为：根据靶细胞不同，基因治疗分为：体细胞体细胞( (somatic somatic cell)cell)基因治疗基因治疗生殖细胞生殖细胞( (germline)germline)基因治疗基因治疗v只限于某一体细胞的只限于某一体细胞的基因的改变基因的改变v只限于某个体的当代只限于某个体的当代v对缺陷的生殖细胞进对缺陷的生殖细胞进行矫正行矫正v当代及子代当代及子代3基因治疗的概念基因治疗的概念n将将某某个个遗遗传传物物质质转转移移到到患患者者细细胞胞内内，使使其其在在体体内内发发挥挥作作用用，以达到治疗疾病
2、目的方法。以达到治疗疾病目的方法。41. 基因治疗的策略基因治疗的策略 内容提要内容提要2. 基因转移技术基因转移技术 4. 治疗基因的受控表达治疗基因的受控表达3. 基因干预基因干预5. 基因治疗的应用研究基因治疗的应用研究6 基因治疗的问题与展望基因治疗的问题与展望5 第一节第一节 基因治疗的策略基因治疗的策略6一、基因置换（一、基因置换（genereplacement） 定义：定义：将特定的目的基因导入特定细胞，将特定的目的基因导入特定细胞，通过通过定位重组定位重组，导入的正常基因置换基因组，导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因。内原有的缺陷基因。 目的：目的：将缺陷基因的异常序列进
3、行校正。将缺陷基因的异常序列进行校正。 对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原对缺陷基因的缺陷部位进行精确的原位修复，不涉及基因组的任何改变。位修复，不涉及基因组的任何改变。 7n定定向向整整合合的的条条件件: :转转导导基基因因的的载载体体与与基基因因组组DNA具具有有相相同同的的序序列列。带带有有目目的的基基因因的的载载体体就就能能找找到到同同源源重重组组的的位位点点，进进行行部部分分基基因因序序列列的的交交换换，使使基基因因置置换换这这一治疗策略得以实现。一治疗策略得以实现。n又称又称基因打靶基因打靶( (gene targeting）基因同源重组技术基因同源重组技术8缺陷基因缺陷基因正常基因
4、正常基因重组载体重组载体正常基因正常基因定位重组技术定位重组技术染色体染色体9二、基因添加二、基因添加 (geneaugmentation)定义：定义：通过导入外源基因使靶细胞表达其本通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。身不表达的基因。类型：类型：A.在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基在有缺陷基因的细胞中导入相应的正常基因，细胞内的缺陷基因并未除去，通过导因，细胞内的缺陷基因并未除去，通过导入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的入正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；功能；B.向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的
5、目的。利用其表达产物达到治疗疾病的目的。10定义：定义：采用特定的方式抑制某个基因的表采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。之不能表达，以达到治疗疾病的目的。例如例如反义核酸反义核酸、核酶核酶或或干扰干扰RNARNA技术等。技术等。三、基因干预三、基因干预（geneinterference）11 为恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。为恶性肿瘤基因治疗的主要方法之一。n原原理理: :将将“自自杀杀”基基因因导导入入宿宿主主细细胞胞中中，这这种种基基因因编编码码的的酶酶能能使使无无毒毒性性的的药药物物前前体
6、体转转化化为为细细胞胞毒毒性性代代谢谢物物，诱诱导导靶靶细细胞胞产产生生“自自杀杀”效效应应，从从而而达达到到清清除除肿肿瘤瘤细胞的目的。细胞的目的。四、自杀基因治疗四、自杀基因治疗12自杀基因的作用机制自杀基因的作用机制 13A.A.TK/GCVTK/GCV： 单单 纯纯 疱疱 疹疹 病病 毒毒 （ herps herps simplex simplex virus, virus, HSVHSV）型型胸胸苷苷激激酶酶（thymidine thymidine kinase, kinase, tktk）基基因因编编码码胸胸苷苷激激酶酶，特特异异性性地地将将无无毒毒的的核核苷苷类类似似物物丙丙氧氧
7、鸟鸟苷苷（ganciclovir, ganciclovir, GCVGCV）转转变变成成毒毒性性GCVGCV三三磷磷酸酸核核苷苷，抑抑制制DNADNA聚聚合合酶酶活活性，导致细胞死亡。性，导致细胞死亡。（一）自杀基因系统（一）自杀基因系统14B.B.CD/5-FCCD/5-FC： 大大 肠肠 杆杆 菌菌 胞胞 嘧嘧 啶啶 脱脱 氨氨 酶酶（cytosine cytosine deaminase, deaminase, CDCD）基基因因，在在细细胞胞内内将将无无毒毒性性5-5-氟氟胞胞嘧嘧啶啶（5-5-FCFC）转转变成毒性产物变成毒性产物5-5-氟尿嘧啶（氟尿嘧啶（5-5-FUFU）。）。（
8、一）自杀基因系统（一）自杀基因系统15 旁旁观观者者效效应应：“自自杀杀基基因因”导导入入后后，不不仅仅使使导导入入了了“自自杀杀基基因因”的的肿肿瘤瘤细细胞胞在在用用药药后后被被杀杀死死，而而且且与与其其相相邻邻或或远远处处的的未未转转导导“自自杀基因杀基因”的肿瘤细胞也被杀死。的肿瘤细胞也被杀死。增强了自杀基因的肿瘤杀伤作用。增强了自杀基因的肿瘤杀伤作用。（二）旁观者效应（二）旁观者效应16五、基因免疫治疗五、基因免疫治疗 通过将抗癌免疫增强的通过将抗癌免疫增强的细胞因子细胞因子或或MHCMHC基基因因导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗导入肿瘤组织，以增强肿瘤微环境中的抗癌免疫反应。癌免
9、疫反应。 17第二节第二节 基因转移技术基因转移技术 18基因基因转移转移的两种方式的两种方式载体载体目的基因目的基因invivoexvivo靶细胞靶细胞将目的基因直将目的基因直接输入体内接输入体内将目的基因导入患者将目的基因导入患者靶细胞靶细胞, ,体外培养体外培养将重组靶细将重组靶细胞回输体内胞回输体内19基因治疗基因治疗转移转移的方式的方式1. 1. 直接体内疗法（直接体内疗法（in vivoin vivo） 是是指指将将目目的的基基因因直直接接导导入入体体内内有有关关的的组组织织器官，使其进入相应的细胞并进行表达。器官，使其进入相应的细胞并进行表达。2. 2. 间接体内疗法（间接体内疗
10、法（ex vivoex vivo） 在在体体外外将将目目的的基基因因导导入入靶靶细细胞胞，经经过过筛筛选选和和增增殖殖后后将将细细胞胞回回输输给给患患者者，使使该该基基因因在在体体内内有有效效地地表表达达相相应应产产物物，以以达达到到治治疗疗的的目的。目的。 20 一、病毒介导的基因转移系统一、病毒介导的基因转移系统 病病毒毒载载体体介介导导的的基基因因转转移移效效率率较较高高，是是使使用用最最多多的的基基因因治治疗疗载载体体。其其中中用用得得最多的是逆转录病毒载体最多的是逆转录病毒载体。21（一）逆转录病毒（一）逆转录病毒（Retrovirus）载体载体+ssRNA逆转录酶逆转录酶核心蛋白核
11、心蛋白膜蛋白膜蛋白人类免疫缺陷病毒人类免疫缺陷病毒 （HIV） 22逆转录病毒的生活周期逆转录病毒的生活周期23逆转录病毒的生活周期逆转录病毒的生活周期24逆转录病毒的生活周期逆转录病毒的生活周期2526（1 1）两端各有一长末端重复序列）两端各有一长末端重复序列LTRLTR。 1. 1. 逆转录病毒前病毒的结构特点逆转录病毒前病毒的结构特点（2 2）LTRLTR由由U3U3、R R和和U5U5三部分组成。三部分组成。A.A.U3U3内有增强子和启动子；内有增强子和启动子； B.B.U3U3和和U5U5两端分别有病毒整合序列两端分别有病毒整合序列( (IS)IS) ； C.C.在在R R内还有
12、内还有poly(A)poly(A)加尾信号。加尾信号。 27 1. 1. 逆转录病毒前病毒的结构特点逆转录病毒前病毒的结构特点 （3 3）病毒有三个结构基因：）病毒有三个结构基因： gaggag、polpol和和envenv基因基因（4 4）55端端LTRLTR下下游游有有一一段段病病毒毒包包装装所所必必需需的的序序列列（）及剪接供体位点及剪接供体位点( (SD)SD)和剪接受体位点和剪接受体位点( (SA)SA)。282.2.逆转录病毒介导的基因转移系统逆转录病毒介导的基因转移系统 (1) (1) 逆转录病毒载体逆转录病毒载体 保保留留病病毒毒颗颗粒粒的的包包装装信信号号，而而缺缺失失病病毒
13、毒颗颗粒粒包包装装蛋蛋白白基基因因；它它可可以以克克隆隆并并表表达达外外源源基基因因，但不能自我包装成有增殖能力的病毒颗粒。但不能自我包装成有增殖能力的病毒颗粒。LTR therapeutic gene LTR292.2.逆转录病毒介导的基因转移系统逆转录病毒介导的基因转移系统 (2) (2) 辅助细胞株辅助细胞株 它由另一种缺陷型逆转录病毒感染构建它由另一种缺陷型逆转录病毒感染构建而成。该细胞株能合成包装蛋白，用于逆转而成。该细胞株能合成包装蛋白，用于逆转录病毒载体包装。由于缺乏包装型号，本身录病毒载体包装。由于缺乏包装型号，本身不能被包装成病毒颗粒。不能被包装成病毒颗粒。gag pol e
14、nv30Retroviral packaging system31逆逆转转录录病病毒毒结结构构基基因因gag、env和和pol的的缺缺失不影响其他部分的活性。失不影响其他部分的活性。包装好的假病毒颗粒易于分离制备。包装好的假病毒颗粒易于分离制备。逆逆转转录录病病毒毒携携带带的的遗遗传传物物质质高高效效地地进进入入靶细胞。靶细胞。前前病病毒毒通通过过LTR高高效效整整合合至至靶靶细细胞胞基基因因组组中中，有有利利于于外外源源基基因因在在靶靶细细胞胞中中的的永永久表达久表达。 3.逆转录病毒载体的特点逆转录病毒载体的特点 32 4. 逆转录病毒载体的主要缺点逆转录病毒载体的主要缺点 随机整合随机整
15、合，有插入突变、激活癌基，有插入突变、激活癌基因的因的潜在危险潜在危险； 逆转录病毒载体的容量较小，只能逆转录病毒载体的容量较小，只能容纳容纳7 7 kbkb以下以下的外源基因。的外源基因。33 （二）腺病毒（二）腺病毒( (adenovirus，AV) )载体载体34 （二）腺病毒（二）腺病毒( (adenovirus，AV) )载体载体 腺腺病病毒毒是是一一种种大大分分子子(36 kb)双双链链无无包包膜膜DNA病病毒毒。它它通通过过受受体体介介导导的的内内吞吞作作用用进进入入细细胞胞内内，然然后后腺腺病病毒毒基基因因组组转转移移至至细细胞胞核核内内，保保持持在在染染色色体体外外，不不整整
16、合合进进入入宿主细胞基因组中。宿主细胞基因组中。 35腺病毒的优点腺病毒的优点1.1.基因导入效率高；基因导入效率高；2.2.宿主范围广；宿主范围广；3.3.基因转导与细胞分裂无关基因转导与细胞分裂无关；4.4.重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注；入或气管内滴注；5.5.腺病毒载体腺病毒载体容量较大容量较大，可插入，可插入7.5 7.5 kbkb外源基因。外源基因。36 腺病毒载体缺点腺病毒载体缺点2.2.宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。3.3.有两个环节可能产生复制型腺病毒：载体与辅有两个
17、环节可能产生复制型腺病毒：载体与辅助细胞或患者体内野生型病毒发生重组。助细胞或患者体内野生型病毒发生重组。4.4.靶向性差。靶向性差。 1.1.不能整合不能整合到靶细胞的基因组到靶细胞的基因组DNADNA中。中。治疗基因表治疗基因表达时间相对较短达时间相对较短。37 （三）腺病毒相关病毒载体（三）腺病毒相关病毒载体AAV Virus Particle 腺病毒相关病毒腺病毒相关病毒(adenovirus associated virus，AAV)是一类单链线状是一类单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组缺陷型病毒。其基因组DNA小于小于5 kb，无包膜，外形为裸露的无包膜，外形为裸露的20面体颗粒。
18、面体颗粒。AAV不能独立不能独立复制，只有在辅助病毒存在时，才能进行复制和溶细胞复制，只有在辅助病毒存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染潜伏感染。38Structure of AAV Virus Genomic DNAREP:病毒复制基因病毒复制基因, CAP:编码衣壳蛋白的基因编码衣壳蛋白的基因ITR：反向末端重复序列：反向末端重复序列39AAVAAV的特点的特点 以潜伏感染为主；以潜伏感染为主； AAVAAV可以高效可以高效定点整合定点整合至人染色至人染色体中：可以避免随机整合可能带体中：可以避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激
19、来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性，而且外源基因活的潜在危险性，而且外源基因可以持续稳定表达。可以持续稳定表达。40 AAVAAV载体的缺陷：载体的缺陷： AAVAAV载体载体容量小容量小，目前最多只能容，目前最多只能容纳纳5 5 kbkb外源外源DNADNA片段；片段；感染效率比逆转录病毒载体低。感染效率比逆转录病毒载体低。在在40%-80%40%-80%的成人中存在过感染，的成人中存在过感染，可能会引起免疫排斥。可能会引起免疫排斥。41常用基因治疗载体常用基因治疗载体整合特点整合特点安全性安全性感染细胞感染细胞克隆容量克隆容量逆逆转转录录病病毒载体毒载体随随机机整整合合，效率高效率
20、高可能致病可能致病分裂细胞分裂细胞7kb腺腺病病毒毒载载体体不不整整合合，可可能丢失能丢失安安全全性性较较高高分分裂裂细细胞胞、非非分分裂裂细细胞胞腺腺相相关关病病毒载体毒载体定点整合定点整合安安全全性性较较高高分分裂裂细细胞胞、非非分分裂裂细细胞胞5kb7.5kb42二、非病毒载体介导的基因转移系统二、非病毒载体介导的基因转移系统 （一）脂质体介导的基因转移技术（一）脂质体介导的基因转移技术 基基本本原原理理：利利用用阳阳离离子子脂脂质质体体单单体体与与DNA混混合合后后，可可以以自自动动形形成成包包埋埋外外源源DNA的的脂脂质质体体，然然后后与与细细胞胞一一起起孵孵育育，即即可可通通过过细
21、细胞胞内内吞吞作作用用将将外外源源DNA（即即目目的的基因）转移至细胞内，并进行表达。基因）转移至细胞内，并进行表达。 43 脂质体介导的基因转移示意图脂质体介导的基因转移示意图44 （二）受体介导转移技术（二）受体介导转移技术 将将DNADNA与与细细胞胞或或组组织织亲亲和和性性的配体偶联，可使的配体偶联，可使DNADNA具有靶向性。具有靶向性。45受体介导转移技术示意图46 （三）基因直接注射技术（三）基因直接注射技术 如：肌内注射凝血因子如：肌内注射凝血因子基因，可基因，可产生血友病所需的凝血因子产生血友病所需的凝血因子 。47第三节第三节 基因干预基因干预一、反义一、反义RNA二、二、
22、RNA干扰干扰三、核酶三、核酶48 一、反义一、反义RNARNA （一）（一） 反义反义RNARNA与基因表达调控与基因表达调控 主要指能与特定基因主要指能与特定基因mRNAmRNA互补结互补结合的一类合的一类RNA,RNA,可抑制一些有害基因可抑制一些有害基因的翻译。的翻译。49 反义反义RNARNA的关键技术问题：的关键技术问题：反义反义RNARNA进入靶细胞前的降解问题进入靶细胞前的降解问题专一性转移问题：专一性转移问题： 举例举例: : 将将脱唾液酸血清类粘蛋白脱唾液酸血清类粘蛋白（ASGPASGP）与多聚赖）与多聚赖氨酸（氨酸（PLPL）共价连接，得到共价连接，得到ASGP-PLAS
23、GP-PL复合物，成为复合物，成为运载核酸的工具。可以专一性地使反义运载核酸的工具。可以专一性地使反义RNARNA特异进特异进入肝细胞。入肝细胞。 50（二）受体介导反义（二）受体介导反义RNARNA技转移术技转移术 受体介导的受体介导的RNARNA转移十分专一，而且效率转移十分专一，而且效率高；高；被转移的被转移的RNARNA是被保护的，与周围环境之是被保护的，与周围环境之间存在多聚赖氨酸的保护层间存在多聚赖氨酸的保护层, , 可以抵抗可以抵抗环境中的核酸酶的降解作用。环境中的核酸酶的降解作用。 借借助助前前述述的的受受体体介介导导基基因因转转移移方方法法，可以实现受体介导的反义可以实现受体
24、介导的反义RNARNA转移。转移。51 （三）（三） 反义反义RNARNA的应用前景的应用前景 （l l）安全性高）安全性高 （2 2）反义）反义RNARNA设计和制备方便设计和制备方便 （3 3）具有剂量调节效应）具有剂量调节效应 （4 4）能直接作用于一些）能直接作用于一些RNARNA病毒病毒52二、二、RNA干扰干扰（RNA interference，RNAi）n由双链由双链RNA介导的细胞内特异性介导的细胞内特异性mRNA降降解过程，导致靶基因的表达沉默。解过程，导致靶基因的表达沉默。53（一）（一）RNARNA干扰机制示意图干扰机制示意图54（二）（二）RNARNA干扰的应用前景干扰
25、的应用前景 1. 1. 研究基因功能的新工具研究基因功能的新工具 2. 2. 肿瘤的基因治疗肿瘤的基因治疗3. 3. 病毒性疾病的基因治疗病毒性疾病的基因治疗55三、核酶三、核酶(ribozyme) 具有酶活性的具有酶活性的RNARNA，可降解特，可降解特异的异的mRNAmRNA序列。序列。l与靶序列互补的区域与靶序列互补的区域l保守区域（构成酶活性的结构域）保守区域（构成酶活性的结构域）56核酶的作用机制 57 （二）核酶的应用（二）核酶的应用 与一般的反义与一般的反义RNARNA相比，核酶具有较稳相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到定的空间结构，不易受到RNARNA酶的攻击。更酶的攻击
26、。更重要的是，核酶在切断重要的是，核酶在切断mRNAmRNA后，又可从杂后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其它的交链上解脱下来，重新结合和切割其它的mRNAmRNA分子。分子。 58 第四节第四节 治疗基因的受控表达治疗基因的受控表达 治治疗疗基基因因的的受受控控表表达达包包括括控控制制治治疗疗基基因因表表达达的的时时间间、空空间间和和水水平平三三个个方面。方面。 其其策策略略大大致致有有以以下下几几种种：基基因因内内部部调调节节机机制制、基基因因外外部部调调节节机机制制、利利用用病病灶灶微微环环境境使使治治疗疗基基因因特特异异性性表表达达以及以及治疗基因的诱导表达治疗基因的诱导表达等
27、。等。 59使用正常细胞的组织特异性启动子、增强使用正常细胞的组织特异性启动子、增强子元件，例如酪氨酸酶基因。子元件，例如酪氨酸酶基因。 使用病变细胞的组织特异性启动子、增强使用病变细胞的组织特异性启动子、增强子元件，如甲胎蛋白子元件，如甲胎蛋白( (AFP)AFP)基因。基因。一、基因内部的调节机制一、基因内部的调节机制60二、基因外部的调节机制二、基因外部的调节机制 除利用基因内部的调节机制以外，除利用基因内部的调节机制以外，还可通过施加外部刺激，比如对病灶局还可通过施加外部刺激，比如对病灶局部进行热处理或电离辐射等，促进治疗部进行热处理或电离辐射等，促进治疗基因在特定细胞或组织中表达。基
28、因在特定细胞或组织中表达。61三、利用病灶微环境使治疗基因特异性表达三、利用病灶微环境使治疗基因特异性表达 病灶微环境与正常时往往不同，因此可病灶微环境与正常时往往不同，因此可利用这些变化控制治疗基因的表达。利用这些变化控制治疗基因的表达。比如：比如：肿瘤组织往往会出现葡萄糖缺乏或缺氧等肿瘤组织往往会出现葡萄糖缺乏或缺氧等微环境；微环境；炎症组织特殊微环境等。炎症组织特殊微环境等。62四、治疗基因的诱导表达四、治疗基因的诱导表达 为为了了防防止止其其表表达达不不再再受受外外界界控控制制，所所以以有有必必要要开开发发和和完完善善一一些些可可诱诱导导性性基基因因表表达达系系统统。 成成分分：一一种
29、种是是转转录录激激活活剂剂，它它与与DNADNA结结合合的的活性受某种诱导药物控制；活性受某种诱导药物控制； 另另一一种种则则是是特特异异性性基基因因表表达达调调控控元元件件，仅对这种转录激活剂有所响应。仅对这种转录激活剂有所响应。 63四环素抗性操纵子系统四环素抗性操纵子系统原理原理n四环素抗性基因的转录受四环素抗性基因的转录受TetTet阻遏蛋白的负调控。阻遏蛋白的负调控。n无四环素存在时，阻遏蛋白与四环素抗性操纵子无四环素存在时，阻遏蛋白与四环素抗性操纵子序列结合阻断四环素抗性基因的表达。序列结合阻断四环素抗性基因的表达。n四环素存在时，阻遏蛋白与四环素具有极高的亲四环素存在时，阻遏蛋白
30、与四环素具有极高的亲和性，造成阻遏蛋白对四环素抗性操纵子阻遏解和性，造成阻遏蛋白对四环素抗性操纵子阻遏解除，使四环素抗性基因的转录得以进行。除，使四环素抗性基因的转录得以进行。 64Tet-Off 系统中，系统中，Tet控制的转录活化子（控制的转录活化子（tTA）是野生型是野生型Tet阻遏蛋白（阻遏蛋白（TetR）与一活化蛋白）与一活化蛋白（AD）的融合体。）的融合体。65Tet-On 系统中，系统中，TetR中四个氨基酸变化使其结中四个氨基酸变化使其结合特性变为方向（合特性变为方向（rTetR)。66 第五节第五节 基因治疗的应用研究基因治疗的应用研究671 1腺苷脱氨酶腺苷脱氨酶( (AD
31、A)ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶和嘌呤核苷磷酸化酶 ( (PNP)PNP)缺乏症缺乏症 2 2珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病珠蛋白生成障碍性贫血和血红蛋白病 3 3血友病和其他血浆蛋白缺乏症血友病和其他血浆蛋白缺乏症 4 4苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢缺陷病 5 5莱莱- -纳纳( (Lesch-Nyhan)Lesch-Nyhan)综合征综合征 6 6家族性高胆固醇血症家族性高胆固醇血症 7 7囊性纤维化病囊性纤维化病 一、遗传病的基因治疗研究一、遗传病的基因治疗研究 68第一例基因治疗 腺苷脱氨酶缺乏症n生理：腺苷脱氨酶是一种细胞内酶，在核酸代生理：腺苷脱氨
32、酶是一种细胞内酶，在核酸代谢中起重要作用，使淋巴细胞中的脱氧腺苷脱谢中起重要作用，使淋巴细胞中的脱氧腺苷脱氨成为脱氧肌苷，最后代谢为尿酸，排出体外。氨成为脱氧肌苷，最后代谢为尿酸，排出体外。n病理：腺苷脱氨酶缺乏脱氧腺苷不能脱氨病理：腺苷脱氨酶缺乏脱氧腺苷不能脱氨脱氧腺细胞内堆积淋巴细胞死亡机体免疫脱氧腺细胞内堆积淋巴细胞死亡机体免疫功能缺乏。功能缺乏。69治疗基础治疗基础n腺苷脱氨酶基因位于腺苷脱氨酶基因位于2020号染色体长臂号染色体长臂n19831983年腺苷脱氨酶基因被克隆年腺苷脱氨酶基因被克隆n应用逆转录病毒可将该基因送入缺乏腺苷脱氨应用逆转录病毒可将该基因送入缺乏腺苷脱氨酶基因的淋
33、巴细胞酶基因的淋巴细胞n新输入的腺苷脱氨酶基因可在原来没有此基因新输入的腺苷脱氨酶基因可在原来没有此基因的淋巴细胞中表达的淋巴细胞中表达 70vvADAADA缺乏症缺乏症缺乏症缺乏症OOFrenchAnderson(NIH)FrenchAnderson(NIH)LTRADAOOSeptember14,1990September14,199071基因治疗的临床应用基因治疗的临床应用Ashanti de SilvaAshanti de SilvaAshantiAshantiwaswasthethefirstfirstpatientpatient toto bebe treatedtreated w
34、ithwithgenetherapy.genetherapy.vvInjectionsrepeated7timesinfirst10.5monthsInjectionsrepeated7timesinfirst10.5monthsvvADA:1%25%ADA:1%25%72 治疗步骤治疗步骤n抽取病人骨髓，分离淋巴细胞抽取病人骨髓，分离淋巴细胞n将病人淋巴细胞与携带腺苷脱氨酶基因的逆转将病人淋巴细胞与携带腺苷脱氨酶基因的逆转录病毒载体混合培养，使腺苷脱氨酶进入淋巴录病毒载体混合培养，使腺苷脱氨酶进入淋巴细胞细胞n清洗淋巴细胞，去除多余病毒载体。应用抗性清洗淋巴细胞，去除多余病毒载体。应用抗性基
35、因等方法选择阳性细胞，检测细胞内外腺苷基因等方法选择阳性细胞，检测细胞内外腺苷脱氨酶含量脱氨酶含量73 治疗步骤治疗步骤n确定腺苷脱氨酶在淋巴细胞有满意表达后，将确定腺苷脱氨酶在淋巴细胞有满意表达后，将带有此基因的淋巴细胞输回患者体内带有此基因的淋巴细胞输回患者体内。n密切观察病人各项免疫指标的变化，必要时加密切观察病人各项免疫指标的变化，必要时加以调整和重复以调整和重复。 经如上治疗后，患病女童免疫功能基本恢复。经如上治疗后，患病女童免疫功能基本恢复。以后又连续进行了多次输入以后又连续进行了多次输入。74v乙型血友病乙型血友病OO薛京伦薛京伦薛京伦薛京伦 ( (复旦大学复旦大学复旦大学复旦大
36、学) )OO1991,1991,OO皮肤成纤维细胞皮肤成纤维细胞皮肤成纤维细胞皮肤成纤维细胞OOFactorIX:5%FactorIX:5%75n逆转录病毒载体逆转录病毒载体 +FcDNA +FcDNA 重组体重组体 5 LTR F neo SV PSO LTR 3n导入仓鼠细胞（导入仓鼠细胞（CHO CHO ）FF表达；表达；n导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）FF表达；表达；n9191年，导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体年，导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）外培养）回植病人皮下回植病人皮下FF基因表达，基因表达，FF基表基
37、表达水平达正常人的达水平达正常人的5%5%。n是我国基因治疗成功的例子。是我国基因治疗成功的例子。76二、恶性肿瘤基因治疗研究二、恶性肿瘤基因治疗研究 常用基因治疗策略：常用基因治疗策略：基因增补基因增补基因干预技术基因干预技术自杀基因治疗自杀基因治疗分子化疗分子化疗肿瘤的免疫基因治疗。肿瘤的免疫基因治疗。提高化疗效果的辅助基因治疗：药物增敏基提高化疗效果的辅助基因治疗：药物增敏基因治疗；耐药基因治疗。因治疗；耐药基因治疗。77（三）病毒性疾病的基因治疗研究（三）病毒性疾病的基因治疗研究 可用基因治疗的策略可用基因治疗的策略 1 1调节机体免疫应答调节机体免疫应答 2. 2. 基因干预，抑制病
38、毒复制基因干预，抑制病毒复制 78 第六节第六节 基因治疗的问题与展望基因治疗的问题与展望1.1.安全性问题安全性问题 19991999年首例基因治疗失败事件年首例基因治疗失败事件 只限于体细胞，提倡间接体内法、主只限于体细胞，提倡间接体内法、主要用于单基因遗传病治疗、疗效显著要用于单基因遗传病治疗、疗效显著并经过动物实验验证等。并经过动物实验验证等。792.2.社会伦理问题社会伦理问题 禁止用于生殖细胞禁止用于生殖细胞 防止不当应用（如体育上）防止不当应用（如体育上）803.3.技术问题技术问题a.a.目的基因及调控元件选择目的基因及调控元件选择b.b.安全高效载体构建及转移技术安全高效载体
39、构建及转移技术c.c.靶细胞选择靶细胞选择 81重组载体重组载体pRevTRE/HSVtk构建流程构建流程 基因治疗应用实例基因治疗应用实例-乳腺癌的自杀基因治疗研究乳腺癌的自杀基因治疗研究82MCF/TRE/tk/Tet-On细胞株的建立83BALB/c裸鼠乳腺癌移植瘤动物模型的建立裸鼠乳腺癌移植瘤动物模型的建立 84BALB/c裸鼠移植瘤的抑瘤实验A：DMEM组；组；B：GCV+Dox组；组；C：GCV+病毒组；病毒组；D：Dox+GCV+病毒组病毒组 85BALB/c裸鼠移植瘤治疗结束后的肿瘤体积 86M: 100 bp MarkerM: 100 bp Marker；1 1： DMEM
40、DMEM 组荷瘤裸鼠肿瘤；组荷瘤裸鼠肿瘤；2 2： GCV+Dox GCV+Dox 组荷瘤裸鼠肿瘤；组荷瘤裸鼠肿瘤；3 3： GCV+GCV+病毒组荷瘤裸鼠肿瘤；病毒组荷瘤裸鼠肿瘤；4 4： Dox+GCV+Dox+GCV+病毒组荷瘤裸鼠肿瘤病毒组荷瘤裸鼠肿瘤 RT-PCR RT-PCR 检测肿瘤组织检测肿瘤组织 HSVHSVtktk 的表达水平的表达水平 87目的要求：n掌握：基因治疗的基本策略及常用载体。掌握：基因治疗的基本策略及常用载体。 n熟悉：基因转移的基本技术；基因干预熟悉：基因转移的基本技术；基因干预的常用方法；治疗基因的受控表达原理的常用方法；治疗基因的受控表达原理与方法与方法 。88
