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1、HPLCHPLC方法开发方法开发有关样品组分和性质的重要信息有关样品组分和性质的重要信息l现有组分的数目l组分的结构以及具有的官能团l组分的分子量l组分的pKa 值l样品基质的性质：溶剂, 填充物等l要检测组分在样品中的浓度范围l样品溶解度2分离目的分离目的l是分析还是回收样品组分？l是否以知样品所有成分的化学特性，即是否需要定性分析？l是否需要解析出样品的所有成分 (例如, 对映异构体, 非对映异构体, 同系物, 低聚物, 痕量杂物)?l如需定量分析，需要多高的精密度？3分离目的分离目的l本法需用于几种样品剂型(如原料,制剂, 环保样品等) ？l未来使用该方法分析的样品数的多少？l未来使用该
2、方法的实验室拥有的HPLC设备 和技术能力？4样品的性质以及是否要进行预处理样品的性质以及是否要进行预处理l来自不同形态的样品:v可以直接进样的溶液v需要稀释，缓冲，或者加入第二种溶剂的溶液v能溶解在流动相中的固体物 配制样品前应称重v含有能引起柱效损失的物质的样品- 要求萃取或过滤v被分析物中含有不溶物- 要求萃取或过滤5检测方式检测方式l根据不同的分离目的需要不同的检测器.v测量单个或少量的化合物时, 理想的检测器应该仅仅对目标物有响应而对其他物质没有响应 高选择性和高灵敏度v对于定性分析和制备色谱, 理想的检测器是通用型的检测器, 这样混合物中的每一种物质都能被检测出来. 并且不需要特别
3、高的灵敏度6检测器检测器检测器化合物类型UV/PDA最常用的检测器 不适用于烷烃和糖类 RID 通用型检测器荧光检测器 适用于能产生荧光的物质具有高选择性和灵敏度电化学检测器适用于易氧化和降解的化合物 具有高灵敏度和选择性电导检测器适用于可电离的化合物，如有机酸和无机酸柱前或柱后衍生化7选择一种选择一种 HPLC模式模式l对于大多数的样品，开发方法经常是从反相模式开始的.l离子对反相模式和 正相模式 是第二选择.l具有以下任何性质的样品经常要求一些特殊的条件.v大分子量的样品, 如聚合物, 碳水化合物或蛋白质v含有光学异构体的混合物 (对映体)v含有其他异构体的混合物v含有无机盐的样品8影响影
4、响 HPLC 分离的反相条件分离的反相条件不同分离条件不同分离条件 优先选择优先选择柱 尺寸(长度, I.d.) 15 , 25 cmL x 2 - 6 mmID, 粒径 3-5 um 固定相 C-8 or C-18流动相 溶剂A/B Water/ACN %-B 不定的 缓冲液 (化合物, pH, 浓度) 10-100 mM磷酸盐, pH 2-7 添加剂 (eg., 离子对试剂, 氨) 阳离子中加 1-20 mM 高氯酸钠阴离子中加1-20mMTBA(四丁基铵） 流速 0.1-2 ml/min温度 10-60 oC样品 体积 100 ul 质量 100 ug9主要主要主要主要HPLC HPLC
5、 方法的特性方法的特性方法的特性方法的特性方法方法/特点特点/色谱柱色谱柱反相模式反相模式流动相：水/有机溶剂色谱柱: C-18(ODS),C-8, 苯基, 三甲基硅烷(TMS), 氰基反相离子对模式反相离子对模式流动相：水/有机溶剂, 加一种缓冲液控制PH值 离子对试剂色谱柱: C-18(ODS),C-8, 氰基正相模式正相模式流动相：有机溶剂混合液色谱柱: 硅胶, 氨基, 氰基, 二醇基何时应用此方法何时应用此方法对于能溶解于水/有机体系中的中性或非离子化合物，首选该模式离子或可电离的化合物, 特别是 碱性或阳离子化合物当反相或离子对HPLC无效时的第二个较好选择:首选为不溶解于水/有机混
6、合液的亲脂样品、异构体混合物和制备HPLC ( 硅胶最好)10离子交换模式离子交换模式流动相：水相，另以缓冲液控制pH 值色谱柱: 阳离子或阴离子交换柱尺寸排阻色谱尺寸排阻色谱流动相：水 相(凝胶过滤) 有机相 (凝胶渗透) 色谱柱: 二醇基（凝胶过滤用） 聚苯乙烯或硅胶（凝胶渗 透用） 分离无机离子 混合物的首选(离子色谱法)，分离核酸和蛋白质以及有关的化合物的良好的选择. 分离高分子量样品，如蛋白质和聚合物的良好首选，也可用作测量G分子量的分布次要次要次要次要 HPLC HPLC 方法的特性方法的特性方法的特性方法的特性方法方法/特点特点/色谱柱色谱柱何时应用此方法何时应用此方法11改善分
7、离改善分离l两个相邻的峰达到基线分离，其分离度Rs1.5.l对简单混合物，应使分离度Rs2 l对含10个或更多成分的样品, 分离度的要求可降到Rs112开发开发HPLC方法的分离目的方法的分离目的目的目的 内容内容分离度分离度 精密和抗干扰的定量分析要求 Rs 1.5分离时间分离时间 小于5-10 min时，日常工作较理想定量定量 含量测定：RSD1%; 要求不高或痕量分 析, RSD5%压力压力 最好150 kgf/cm2， 1.5.78完全分离时的分离度完全分离时的分离度 Rs = 1.0Rs = 1.50峰形不是三角形峰形不是三角形 而是高斯分布而是高斯分布.79峰面积重叠率峰面积重叠率
8、80峰重叠百分率是分离度和峰面积比的函数峰重叠百分率是分离度和峰面积比的函数峰面积比峰面积比Rs1:11:31:101:301:1000.85.9%5.0%(*)%(*)%(*)%1.02.32.622.72.9(*)1.20.831.11.41.61.81.40.260.410.490.710.921.60.0690.10.160.220.331.80.0160.0220.0320.0500.0862.00.0030.0050.0090.0130.0212.20.0010.0010.0010.0030.003(*) 小峰仅仅以肩峰出现小峰仅仅以肩峰出现81分离度分离度, RsN : N1和N
9、2的平均值 k : k1和k2的平均值 是 选择性 柱效 容量因子的函数82容量因子容量因子, kt1 = 溶剂峰的保留时间t0 = 溶剂峰的柱死时间 (非保留时间)t0t1k = t0 t1 - t083理论塔板数理论塔板数, N方程方程 : N = 16 x ( Rt / W )2实际修饰方程实际修饰方程 :N = 5.54 x ( Rt / W 1/2 )2综合修饰方程综合修饰方程 :N = 6.28 x (Rt x H / Area)2 WW1/2H1/2HRtArea84分离因子分离因子 a a分离因子是两个峰分离度的一个体现t0t1t2a = k2 k1 t2 - t0 t1 -
10、t0=85选择因子对分离度的贡献选择因子对分离度的贡献86柱效对分离度的贡献柱效对分离度的贡献87容量因子对分离度的贡献容量因子对分离度的贡献88影响分离度的因素影响分离度的因素89怎样提高怎样提高 N- 第一步第一步 -lHETP = 柱长 / N范范 德米特方程德米特方程HETP线速率线速率最佳流速最佳流速最佳流速最佳流速每个柱子都有每个柱子都有最佳流速最佳流速90HETP (或或N) 和和 流速流速 l要获得好的柱效 ,4.0 mmID 0.6 mL/min4.6 mmID 0.8 mL/min6.0 mmID 1.0 mL/min以上设置是最佳的.91增加柱子数目增加柱子数目 1 2
11、3 4 5 6 7 82.01.0柱子数量柱子数量分离度分离度虽然增加柱子数量能提虽然增加柱子数量能提高高N, 但是分离度仅仅但是分离度仅仅能增加能增加40. 同时柱压会剧烈增加同时柱压会剧烈增加.增加柱子数量并不实用增加柱子数量并不实用924.0 mmID 0.6 mL/min4.6 mmID 0.8 mL/min6.0 mmID 1.0 mL/minNFlow rate3 m mm10 m mm5 m mm降低填料粒径并且降低填料粒径并且选择每根柱子的最选择每根柱子的最佳流速佳流速.如果改变了粒径如果改变了粒径, 必必须使用相同的填充须使用相同的填充物物. 否则会改变选择否则会改变选择性性
12、怎样提高怎样提高 N- 第二步第二步 -93降低有机溶剂的比例降低有机溶剂的比例.尽量使k= 1 10，最好使k= 2 10，k值小于2，分离度不够k值大于10，会扩展运行时间 峰加宽 (1) 灵敏度变小 (2) 定量准确性变差0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 200 2 4 6 8 10kRs1- 202- 10怎样改善怎样改善 k94甲醇 / 乙腈/ THF1) 与水易于混和2) UV 可以透过 3) 低粘度 4) 极性有差异 与甲醇相比，乙腈有以下优点1) 操作压力更低2) 洗脱能力稍高3) 在低波长范围内可以应用 (185-205nm)选择乙腈更好. 然而, 由于价格因
13、素和ANC的毒性，甲醇仍然是首选 溶剂的选择溶剂的选择95溶剂最优化溶剂最优化甲醇甲醇/水混合物做流动相水混合物做流动相样品组成: 硝基苯, 苯, 2,6-二硝基甲苯2-硝基甲苯, 4-硝基甲苯, 3-硝基甲苯,甲苯, 2-硝基-1,3-二甲苯4-硝基-1,3-二甲苯, m-二甲苯100% MeOH 0.1K0.380% MeOH0.6K1.796溶剂最优化溶剂最优化ODS 柱柱样品组分样品组分Peak 1: nitorbenzenePeak 2: benzene Peak 3: 2,6-dinitrotoluenePeak 4: 2-nitrotoluenePeak 5: 4-nitroto
14、luenePeak 6: 3-nitrotoluenePeak 7: toluenePeak 8: 2-nitro-1,3-xylenePeak 9: 4-nitro-1,3-xylenePeak 10: m-xylene60% MeOH60% MeOH1.8K8.555% MeOH55% MeOH1K2097k和有机溶剂百分率和有机溶剂百分率(B%)间的关系间的关系llog(k) = a(B%) + b (a, b 系数)对于小分子,a 有机溶剂每增加 10% (B%) ，每个波段的k d大约降低 3.0.40 0.45 0.50 0.55 0.60 0.65 0.70 0.75 1.0 0
15、.5 0.0-0.5log(k)(B%)Peak 3Peak 2Peak 198分离度图分离度图如果可以事前预测保留时间, 就可以计算出分离度(Rs).通过左边的有机溶剂浓度与分离度之间的关系示意图，可以对有机溶剂的浓度进行最优化99怎样改善怎样改善 a al改变 v有机溶剂类型 vpHv缓冲液浓度v柱温v柱类型（C8, 氰基和苯基）v柱基质v流动相中加入其他有机溶剂100a a 和溶剂类型之间的关系和溶剂类型之间的关系l由于选择性(a)不能被准确预测, 因此选择合适的溶剂组成是比较浪费时间的0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 1000 20 40 60 80 1000
16、10 20 30 40 50 60 70 80 90 100ACN / H2OMeOH / H2OTHF / H2O 溶剂极性和溶剂类型的关系溶剂极性和溶剂类型的关系 101改变溶剂类型改变溶剂类型l虽然使用某一种有机溶剂不能得到好的分离度, 但只要它们之间的关键峰对不一样，几种有机溶剂的组合却可能有好的分离度abcdabcd MeOH/H2O 注意注意 : c,d THF/H2O 注意注意 : a,babcd MeOH/THF/H2O 102离子强度和离子强度和pHl对于含有酸性和碱性化合物的样品, 保留时间随着离子强度和 pH的变化而变化l为了获得好的重现性，选择合适PH值的缓冲液浓度是非
17、常重要的l选择合适的缓冲液 R-COO- 和和 R-NH3+103k和和pH之间的关系之间的关系l在反相色谱中， k 和 pH之间的关系不是线性的或者是二次方程的，流动相的PH值对 有机酸和胺的 k 值有影响.pH 流动相流动相) pKak非解离状态非解离状态解离状态解离状态只有在只有在pKa+/- 1.5范围内范围内, 才会显示才会显示k 和和pH 的线性的线性关系关系R-COOH RCOO- + H+ (pKa=4.5)R-NH3+ R-NH2 + H+ (pKa=6.0)104流动相流动相pH值对化合物分离的影响值对化合物分离的影响1:苯甲酸2:山梨酸3:对羟基苯甲酸甲酯分析条件1mL/
18、minODS 柱 10mM 磷酸盐缓冲液75%乙腈 25%40oCUV-240 nm105样品样品pKa值是分子结构的函数值是分子结构的函数 官能团官能团pKa (Acids) pKa(Bases)aliphatic sufoxide1.5噻唑噻唑1 - 3芳香胺芳香胺4 - 7(苯胺苯胺, 嘧啶嘧啶)氨基酸氨基酸2 - 49 - 12羧酸羧酸3 - 5b-hydroxy aliphatic amines6 - 8aromatic thiols10 - 11phenols10 - 11aliphatic amines9 - 11carbazoles10 - 12106调整调整 pH值的注意点值
19、的注意点l当流动相的pH值与目标样品的pKa值 非常接近时, 应该仔细调整pH 值, 因为流动相的pH 值对k有影响.l一般, 应该选择对k没有影响的pH.pH (流动相流动相) k非解离状态非解离状态解离状态解离状态107k和缓冲液离子强度的关系和缓冲液离子强度的关系llog(k) 和 流动相缓冲离子强度之间的关系如下 log(k) = a(mM) 2 + b(mM) + gl一般不使用浓度高于 100 mM的缓冲液.因为高浓度的缓冲液会对LC的硬件造成麻烦，如降低柱塞杆密封圈的寿命、堵塞管路造成压力升高等.l10 - 20 mM (pH 3 - 4) 的缓冲液是最常用的108离子强度对离子
20、强度对PTH 衍生物的衍生物的保留特性的影响保留特性的影响H: 组氨酸组氨酸R: 精氨酸精氨酸苯基柱梯度15min内,甲醇5.3%-13.2%, THF 9.1%-25.8%, 磷酸盐缓冲液(pH3.2) 85.6%-61%，保持最终浓度 15min(a) 12 mM 缓冲盐缓冲盐(b) 8 mM 缓冲盐缓冲盐(c) 4mM 缓冲盐缓冲盐109缓冲液缓冲液 pH值和值和pKa值之间的关系值之间的关系 AH A- + H+log(K) = log ( A- H+ / AH ) = log ( A- / AH ) + log ( H+) pH = pKa + log ( A- / AH ) K =
21、 A- H+ / AH 110有机酸缓冲液的有机酸缓冲液的pKa值值conc. pKa1 pKa2conc.pKaconc. pKa1 pKa2 pKa31002.186.451004.641002.984.355.61902.196.77904.64902.984.355.63802.206.78804.64802.994.375.65702.236.80704.64702.994.385.68602.256.82604.64603.014.405.71502.296.84504.64503.024.425.75402.326.87404.65403.034.455.79302.386.91
22、304.65303.054.485.85202.466.95204.66203.084.515.91102.647.01104.68103.154.576.02磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液 醋酸盐缓冲液醋酸盐缓冲液 柠檬酸盐缓冲液柠檬酸盐缓冲液(conc. unit : mM )pH 缓冲作用范围缓冲作用范围 pKa +/- 1.0111pH值校正值校正l10 mM pH=7.01 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液vpH=7.01 的10 mM磷酸缓冲液 正好等于10 mM磷酸缓冲液的 pKa2值.v在这种情况下 A- 和 AH 的浓度是相同的. A- 指 Na2HPO4 ，AH 指 NaH2PO4.vN
23、a2HPO4 = 5.0 mmol, NaH2PO4 = 5.0 mmol per 1 Ll10 mM pH=6.01 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液vpH = pKa + log ( A- / AH )v6.01 = 7.01 + log(Na2HPO4 / NaH2PO4)v-1 = log(Na2HPO4 / NaH2PO4)v0.1 = Na2HPO4 / NaH2PO4vNa2HPO4 + NaH2PO4 = 10 mmol 每 1 LvNa2HPO4 = 9.09 mmol, NaH2PO4 = 0.91 mmol per 1 L112pH 值校正值校正(2)l如果仅仅用H3PO4 和
24、Na3PO4 来制备磷酸盐缓冲液.l10 mM pH=6.01 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液 Na2HPO4 = 9.09 mmol, NaH2PO4 = 0.91 mmol 每 1 Ll由上面的浓度计算对离子 Na+的浓度.vNa2HPO4 有两个 Na +, 因此9.09 x 2 = 18.18 mmolvNaH2PO4 有一个 Na +, 因此 0.91 x 1 = 0.91 mmolv全部 Na + 浓度 = 18.18 + 0.91 = 19.09 mmollNa+ 仅仅由 Na3PO4提供并且Na3PO4 有三个 Na +, Na3PO4 浓度为 19.09 / 3 = 6.36 mm
25、ol.l全部 PO4 3- 浓度 由H3PO4 和 Na3PO4提供, 因为 Na3PO4 浓度是 6.36 mmol, H3PO4 浓度为 10 6.36 = 3.64 mmol. l最后, H3PO4 是 3.64 mmol ， Na3PO4 is 6.36 mmol每 1 L.113pH值校正值校正(3)l如果仅仅用H3PO4 和 NaOH 来制备磷酸盐缓冲液.l10 mM pH=6.01 磷酸盐缓冲液磷酸盐缓冲液 Na2HPO4 = 9.09 mmol, NaH2PO4 = 0.91 mmol 每 1 Ll由上面的浓度计算对离子 Na+的浓度.vNa2HPO4 有两个 Na +, 因此
26、 9.09 x 2 = 18.18 mmolvNaH2PO4 有一个 Na +, 因此 0.91 x 1 = 0.91 mmolv全部 Na 浓度 = 18.18 + 0.91 = 19.09 mmollNa+ 仅仅由 NaOH 提供, 因此 NaOH 浓度必须是19.09 mol.lPO4 3- 仅仅由 H3PO4 提供, 因此 H3PO4 浓度必须是 10 mmol. l最后, H3PO4 是 10 mmol每1L ， NaOH 是19.09 mmol 每 1 L.114怎样调整缓冲液的怎样调整缓冲液的pH值值l如果配置低浓度缓冲液，可使用pH 计算l使用PH计配置缓冲溶液时，第一次必须记
27、录使用化合物的体积或重量.l第二次制备缓冲液，所用的化合物的体积或者质量可使用标准记录，而不需PH计. lpH 计用于测定 pH.115k 和柱温之间的关系和柱温之间的关系llog(k) 和柱温之间的关系如下. log(k) = a/T + bl通常温度每改变一度， (k) 改变1%-2%. 当不使用温度改变保留值和灵敏度时，也应该控制温度以保持重现性.l虽然温度高时柱压低, 但是会降低柱子寿命. 一般使用温度为20 - 60 oC.116温度对化合物分离度的影响温度对化合物分离度的影响1:benzoic acid2:sorbic acid3:methylparaben分析条件1mL/minO
28、DS 柱 10mM 磷酸盐缓冲液 (pH2.6) 75%乙腈 25%UV-240 nm117温度的影响温度的影响如果升高温度,1) 样品的保留时间变短2) 流动相的粘度降低3) 柱压降低4) 理论塔板数升高以下情况时应改变柱温 1) 两个化合物的分子量显著不同时 2) 组分洗脱慢时 3) 使用离子交换色谱和离子对色谱时118更换为其他类型的柱子更换为其他类型的柱子将柱填充物由C-18(ODS)改变为 苯基或氰基对灵敏度(a)可能有影响.柱子极性对 20 PTH-amino acids的分离度的影响C-8CNPhenyl119填充物对分离效果的影响填充物对分离效果的影响ODS column Ph
29、enyl column1:benzoic acid2:sorbic acid3:methylparaben分析条件1mL/min40oC10mM 磷酸盐 (pH2.6) 75%乙腈 25%UV-240 nm120改为其他类型的填充物改为其他类型的填充物不同的柱填充物的性质也不同， 象l 吸附力l 极性硅胶特性1)球形或无定型2) 粒子大小3) 微孔或无孔4) 孔径5) 表面积6)碳含量7)残留硅烷醇8)残余的重金属121硅胶特性硅胶特性球形和无定型球形和无定型 无定型无定型无定型无定型 球形球形球形球形 制备用 分析用122硅胶性质硅胶性质粒径粒径粒径 5 um5 um 的粒子是最常用的. 然
30、而, 这是指平均粒径为 5 um，也存在 3um 和d 10 um 的粒子.对于好的柱子，窄范围的粒径分布是重要的.123硅胶性质硅胶性质有孔和无孔有孔和无孔粒径粒径 : 80-120 A 正常的硅胶表面有微孔.分析用的柱子, 微孔大小为80A-120A 是最常用的. 对于蛋白质和聚合物等大分子, 300A, 500A and 1000A (甚至更大) 常被使用.在大量分析时无孔的硅胶也常使用.124硅胶性质硅胶性质表面积和碳百分率表面积和碳百分率 l表面积v如果孔径增加, 表面积降低.100A : 450 m2/g150A : 330 m2/g300A : 100 m2/gl炭含量v碳含量高
31、, 填充物保留能力强. 碳含量为12% -20% 是最常用的125硅胶性质硅胶性质硅羟基硅羟基SiSiO2SiSiSiSiSiOOOOOOOOOHOHOHOH硅羟基硅羟基容易和硅烷化合物发生反应. Cl-Si(CH3)2-RR = C18, C8, C4, Phenyl, C3H7CN, C3H7NH2, DiolSiSiO2SiSiSiSiSiOOOOOOOOOSi(CH3)2-ROSi(CH3)2-ROSi(CH3)2-ROSi(CH3)2-R126硅胶性质硅胶性质硅烷偶合试剂硅烷偶合试剂l单一功能的硅烷偶合试剂vX-Si(CH3)2-R (X=Cl, OC2H5)l多功能的硅烷偶合试剂v
32、X2-Si(CH3)-R (X=Cl, OC2H5) vX3-Si-R (X=Cl, OC2H5)l保留时间和灵敏度的不同是由于键合相的不同硅烷的选择: 单一功能或多功能键合完全: 部分或完全反应是否有封端键合物本身l考虑到重复性，单一功能的硅烷偶合试剂是最常用的127硅胶性质硅胶性质残留硅羟基残留硅羟基l残留的硅羟基v甚至对于改良的硅胶 (e.g. ODS, C8), 仍旧有硅羟基保留在表面.v硅羟基对 胺类化合物有强的吸引力, 因而会造成此类物质的拖尾.C18C18C18C18silica gelOHOH残留的硅羟基128硅胶性质硅胶性质 封尾封尾l为了降低硅羟基的影响, 选择 封尾 的柱
33、子C18C18C18silica gelOHOHC18C18C18silica gelO-TMSO-TMSTMS处理处理TMS : 三甲基硅烷三甲基硅烷封尾封尾无封尾无封尾C18C18129封尾和未完全封尾的比较封尾和未完全封尾的比较Peaks1. Propranolol2. Acenaphthene3. Ammitriptyline130拖尾的解决拖尾的解决流动相中加入辅助剂三乙胺高氯酸钠 (NaClO4)在流动相中加入胺修饰剂和高氯酸钠有助于减少拖尾 ，因为这些添加物将硅羟基屏蔽了起来.131NaClO4l如果在流动相中填加了胺修饰剂或 TBA 离子对试剂，分析结束后必须清洗柱子 l高氯酸
34、钠可以较好的去除胺修饰剂或 TBA 离子，因为高氯酸钠与胺化合物有很强的吸引力.l下面的溶液经常被用来清洗柱子v（含有100 mM 高氯酸钠）0.1%的磷酸水溶液/甲醇= 1 : 1132硅羟基的应用硅羟基的应用不同的C-18 柱对植物激素混合物分离的影响Hypersil ODSSpherisorb ODS133硅胶性质硅胶性质残留的重金属残留的重金属l重金属残留 v通常硅胶中含有重金属. 这些重金属和螯合物之间有吸引力, .因而会产生拖尾C18C18C18硅核硅核O-TMSO-TMSM+M+C18OO可以使用高纯的硅胶类型134纯硅胶型和不纯硅胶型的比较纯硅胶型和不纯硅胶型的比较峰1. 1,
35、2,3,4-萘四酮Shim-pack VP-ODS其他柱135Shim-pack VP-ODSlShim-pack VP-ODS柱的填充物性质柱的填充物性质1)硅粒子 高纯度全多孔, 球形的硅胶粒子 2) 粒径 5 um3) 孔径120 A4) 孔容量 1.25 mL/g5) 表面积 410 m2/g6)碳含量 20% 7)封尾 使用8)痕量金属含量最大30 ppm 9)ODS 官能团 单一功能Peaks1. N-acetylprocainamide2. PhenolShim-packVP-ODSOthers136Shim-pack VP-ODS的质量认证的质量认证137加入其他有机溶剂加入其
36、他有机溶剂在 甲醇, 乙腈 和 THF之外加入其他溶剂在某些情况下可以改善分离度 乙醚异丙醚二氧杂环乙烷二甲氧基乙烷cyclohexne oxide反相分析中，可以加入约10%的上述物质ACN/H20 10% Ethyl ether ACN/H20雌激素的分离雌激素的分离138摘要摘要- - 分离度的改善分离度的改善分离度的改善分离度的改善 - -开始时 增加增加增加增加 k k增加增加增加增加 N N改变改变改变改变 a a a a降低有机溶剂含量. 改变 pH, 缓冲液浓度, 柱温和有机溶剂类型使用更长的柱子或性能更好的柱子.139HPLC 系统系统l等浓度洗脱系统v单一溶剂，浓度恒定 l
37、梯度洗脱系统v多种溶剂，浓度改变高压梯度系统低压梯度系统140 等浓度洗脱系统等浓度洗脱系统泵泵进样器进样器柱柱柱温柱温箱箱检测器检测器单一溶剂单一溶剂141梯度洗脱系统梯度洗脱系统泵泵进样器进样器柱子柱子柱温柱温箱箱检测器检测器泵泵AB时间时间B 浓浓度度142等浓度洗脱模式的优化等浓度洗脱模式的优化分析时间长分析时间长分离差分离差MeOH / H2O = 6 / 4MeOH / H2O = 8 / 2( 柱柱 : ODS 型型 )143梯度洗脱模式的优化梯度洗脱模式的优化95%30%甲甲醇醇浓浓度度144什么情况下选择梯度洗脱什么情况下选择梯度洗脱?l如果两个相邻的峰在等浓度洗脱模式下，无
38、论条件如何改变都不能得到好的分离l当选择梯度洗脱时，必须确认在等浓度模式两个峰可以分离l梯度洗脱可以在不损失分离度的前提下减少分离时间145梯度洗脱中的平均梯度洗脱中的平均 k 值值 (K)l由于梯度洗脱和等浓度洗脱技术都基于HPLC保持和分离过程，因此梯度洗脱程序的设计和等浓度洗脱条件的设计是相似的. 一旦流动相的组成固定, 由其决定的k值也就固定了，那么就可以对梯度洗脱或等浓度洗脱的保留力进行预测.l因而, 分离度可以由下式来描述. Rs = (1/4)(a-1)/aN0.5K/(K+1)146梯度曲线保留时间溶质在柱中的位置在梯度洗脱中，对于在柱中移动的溶质分子，k 的平均值 (K) 指
39、其瞬时的k值.瞬时 k 值147平均平均 k值值 (K) K= tG F / 1.15 Vm DF S tG : 梯度时间F : 流速Vm : 柱的死体积DF : 梯度变化率S : Isocratic parameterVm = toFS=100a (log(k) = a(B%) + b20800 30 (min) (%)tG = 30DF = (80 -20) /100 = 0.6梯度曲线梯度曲线梯度曲线梯度曲线148等浓度 梯度梯度洗脱中每个峰都有相似的半峰宽. 这一点和等浓度 洗脱是完全不同的。虽然 对分离度来说Rs 是非常重要的参数， 在梯度洗脱中，平均 k (K) 实际上是更有意义的
40、。149梯度分离的改善梯度分离的改善为了改善分离, 根据下式，a, N 和K 应该被提高Rs = (1/4)(a-1)/aN0.5K/(K+1)实际上由于K是最主要的影响因子, K 值应该被增加(1) 梯度时间 (2) 流速(3) 梯度改变率以上因素的改变基于下面的最优化方程K= tG F / 1.15 Vm DF S 150K的初始值的初始值l增加流速会使 K值变得更大.然而，由于流速增加会引起高压，所以其增加是有限度的. l开始时，固定流速可能会更好.l梯度时间和 梯度改变率 需要优化.l最初 : K=5 因为 k应该在1 至 20 ， 2-10更好, k平均值 (K)开始应该固定在 5
41、151开始梯度比开始梯度比(DFDF) 和其他参数和其他参数l由于开始 B的浓度梯度范围应该是从 0%到100% c. 因此，开始的 梯度改变率(DF) 应该是 1.DF = (最后 %-B)-(开始l %-B)/100 = (100%-0%)/100 = 1l柱死体积 (Vm) 4.6 mmID x 15cmL : 1.5 mL 4.6 mmID x 25cmL : 2.5 mL 6.0 mmID x 15cmL : 2.5 mLl流速 (F) : 0.8 - 2 mL/minl等度参数 (S) 分子量 S 100 4 1,000 10 10,000 30 100,000 100152开始梯
42、度洗脱时间开始梯度洗脱时间 (tG)l如果梯度范围 0% -100% : DF = 1柱尺寸 4.6mmID x 15cmL : Vm = 1.5流速 : 1.0 mL/min样品分子量小于100 : S = 4K 值 (开始时) : 5l开始的梯度时间应为 23 min.K= tG F / 1.15 Vm DF S 5= tG x 1 / (1.15 x 1.5 x 1 x 4)tG= 5 x 1.15 x 1 x 4 / 1 = 23 min153梯度洗脱时间的优化梯度洗脱时间的优化 (tG)DF = 0.9 (5% -95%) Vm = 1.5 1.0 mL/min S = 4K =5t
43、G = 5x1.15x0.9x4/1 = 20(min)0 10 20 (min)95%5%to4 min16 min12 min延迟时间延迟时间延迟时间延迟时间23%77%154梯度洗脱浓度范围和时间的优化梯度洗脱浓度范围和时间的优化 (tG)5% -95% (20min)25% -77% (12min)155梯度洗脱方法的进一步优化梯度洗脱方法的进一步优化如果需要进一步的优化,(1) 梯度时间更长(tG)(2) 流速更快(3) 使用更长或更好的柱子(4) 改变有机溶剂 (甲醇- 乙腈 - THF)156梯度洗脱中的问题梯度洗脱中的问题 - 1l重复性差重复性差v柱子平衡时间不够通常，柱子再
44、生的时间应该大致等于梯度时间tG.如果开始的流动相是水或缓冲液，平衡时间要更长. 因此，在开始梯度洗脱时用 5或者更高浓度的有机溶剂比较好使用自动进样器缩小平衡时间的差异157l鬼峰鬼峰v水的级别低 水中的一些不纯物引起鬼峰. 使用了不纯的水.降低检测波长可能会检测不到不纯物.在开始梯度洗脱时用 5或者更高浓度的有机溶剂比较好梯度洗脱中的问题梯度洗脱中的问题 - 2158方法认证方法认证准确度精确度v重复性v中间重复性v重现性检出限检测限线性 回收率范围稳定性判断分析能力的典型参数判断分析能力的典型参数159范围范围l定义: 能够给出适当的准确度，精确度和线性的被分析物的高低浓度之间的间隔.
45、从LOQ 到 线性水平之上160准确度准确度l定义: 试验值和实际值之间的差 评价方法 应该在所有范围内评价准确度. 可以用回收率来进行判定. 要求有3 个以上不同浓度的样品 三次以上的进样.161置信度置信度l置信度意味着我们能用信心指数来进行判定, 也就是置信度范围包括真实值(m)的可能性,.置信度范围的大小 在很大程度上我们对真实值的确信程度，确信程度越高，置信度范围越大下面的方程给出了置信度为下面的方程给出了置信度为 95%, 99% 时的真实值时的真实值 ( c c )范围范围 c c - 1.96s s/(n)1/2 m m c c + 1.96s s/(n)1/2 - 95%c
46、c - 2.58s s/(n)1/2 m m c c + 2.58s s/(n)1/2 - 99%162乙酰水杨酸的准确度测试乙酰水杨酸的准确度测试 平均值 (每个级别) dj = S(yji (100/xj)/m - 100 dj -0.04167 0.18519 -0.16667 -0.33333 0.08333平均值 (所有级别) d =SS(yij (100/xj)/mn - 100置信区间 d - 1.96s/(mn)1/2 , d + 1.96s/(mn)1/2 平均值 (d) : -0.03278置信区间 : -0.14022, 0.074664m=level(5), n=rep
47、eat(5)163 线性线性l定义: 所测样品浓度以及准确度测定的样品浓度应该在线性范围内. 评价方法 应该在所有范围内对线性进行评价 . 可以用回归系数来进行判定. 截距和斜率应该被显示 进行线性确认，应该有5个以上不同浓度的样品被检测164乙酰水杨酸的线性测试乙酰水杨酸的线性测试165乙酰水杨酸的线性评价乙酰水杨酸的线性评价相关系数 : r = S(xi - Sxi/n) (yi - Syi/n) S(xi - Sxi/n)S(yi - Syi/n) 21/2斜率 : b =S(xi - Sxi/n) (yi - Syi/n) S(xi - Sxi/n) 2截距 : a = Syi/n -
48、 bSxi/nr = 0.999034, a = 0.124, b = 0.9984相关系数大于0.999166精确度精确度l定义: 相同分析条件下多次测量的数据之间的相近度l三个组分 重复性 中间精密度 重现性167重复性重复性 通过对相同样品的多次进样来测量表达HPLC系统的性能 评价方法 用 RSD来表达, 由一种样品在相同条件下多次测定组成. 重复性应该在所有范围内进行评价 w最少进样5次 168乙酰水杨酸的重复性测试乙酰水杨酸的重复性测试标准偏差 (每个级别) sj = S(yji - S yji/m)2/(m-1)1/2相对标准偏差 (每个级别) RSDj =sj / (Syji/
49、m)m=level(5)RSD(%) 0.73 0.67 0.72 0.69 0.63169中间精密度中间精密度w估算方法的可靠性不同于方法的开发。 在日间，不同的实验者之间，不同仪器间的测试等w当方法开发结束后，确认对于相似的样品方法能提供相同的结果 w 评价方法 用 RSD来表达， 最少两个不同场合的数据来确认方法的精密度170乙酰水杨酸的中间精密度测试乙酰水杨酸的中间精密度测试Test 1Test 21st run99.3%99.6%2nd run100.8%98.9%3rd run100.4%100.5%4th run99.1%99.7%5th run99.9%99.2%SD 0.717635 0.605805RSD 0.72(%) 0.61(%)F(F-test) = s12 / s22 = 0.7176352 / 0.6058052 = 1.1846自由度 = 41.1846 2F精确度/进样重复性 n 5u RSD 2F拖尾因子 ( T ) T = Wx / 2fu T 2000溶剂峰溶剂峰溶剂拖尾溶剂拖尾进样进样tW1tW2tR1t0tR2Wxfh0.05h空空气气峰峰194结束结束
