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1、生物：1.2基因工程的基本操作程序课件(新人教版选修3)(4)Stillwatersrundeep.流静水深流静水深,人静心深人静心深Wherethereislife,thereishope。有生命必有希望。有生命必有希望基因工程的基本操作程序1 1、目的基因的获取、目的基因的获取2 2、基因表达载体的构建、基因表达载体的构建3 3、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞4 4、目的基因的检测与鉴定、目的基因的检测与鉴定1.基因工程的操作步骤正确的操作顺序基因工程的操作步骤正确的操作顺序是是 使目的基因与运载体相结合使目的基因与运载体相结合将目的基因将目的基因导入受体细胞导入受体细胞检
2、测目的基因的表达是否符检测目的基因的表达是否符合特定性状要求合特定性状要求提取目的基因提取目的基因A B C D C步骤一：步骤一：目的基因的获取目的基因的获取 目的基因是人们所目的基因是人们所需要转移需要转移或或改造改造的基因的基因,获取目的基因是实施基因工程的第一步获取目的基因是实施基因工程的第一步 。 如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植如苏云金芽孢杆菌的抗虫基因，还有植物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮物的抗病（抗病毒、抗细菌）基因、种子贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因、干扰素基因等。素基因等。目的基因的提取方法目的基因的提取方法人工合成基因人
3、工合成基因反转录法反转录法根据已知的氨基酸序列根据已知的氨基酸序列合成合成DNA：鸟枪法：鸟枪法直接分离基因直接分离基因从基因文库中获取基因组文库 cDNA文库 1 . 鸟枪法（散弹射击法）鸟枪法（散弹射击法） 用限制酶将供体细胞中的用限制酶将供体细胞中的用限制酶将供体细胞中的用限制酶将供体细胞中的DNADNA切成许多片段，从中找出切成许多片段，从中找出切成许多片段，从中找出切成许多片段，从中找出含有目的基因含有目的基因含有目的基因含有目的基因. .用限制酶切断成用限制酶切断成许多片段许多片段1）反转录法反转录法： 以目的基因转录成的信使以目的基因转录成的信使RNA为模板为模板 反转录成互补的
4、单链反转录成互补的单链DNA在酶的作用下合成双链在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基，从而获得所需的基因因目的基因的目的基因的mRNA单链单链DNA(cDNA)双链双链DNA(即目的基因即目的基因)反转录反转录反转录反转录合成合成合成合成2.2.人工合成基因法人工合成基因法2）根据已知的氨基酸序列合成根据已知的氨基酸序列合成DNA法法 ： 根据已知蛋白质根据已知蛋白质的氨基酸序列，推测的氨基酸序列，推测出相应的信使出相应的信使RNA序序列，然后按照碱基互列，然后按照碱基互补配对原则，推测出补配对原则，推测出它的结构基因的核苷它的结构基因的核苷酸序列，再通过化学酸序列，再通过化学方法，以
5、单核苷酸为方法，以单核苷酸为原料合成目的基因。原料合成目的基因。蛋白质的氨基酸序列蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列推测推测推测推测推测推测推测推测目的基因目的基因化学合成化学合成化学合成化学合成上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？上述三种目的基因提取的方法有何优缺点？优点缺点鸟枪法反转录法根据已知氨基酸合成DNA法操作简便操作简便广泛使用广泛使用工作量大，盲目，分工作量大，盲目，分离出来的有时并非一离出来的有时并非一个基因个基因专一性强专一性强操作过程麻烦，操作过程麻烦，mRNAmRNA很不稳定，要求的技很不稳定，要求的技术条件较高术
6、条件较高专一性最强专一性最强仅限于合成核苷酸对仅限于合成核苷酸对较少的简单基因较少的简单基因哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？1）DNA序列自动测序仪：序列自动测序仪：2）PCR技术：技术： 对提取出来的基因进对提取出来的基因进行核苷酸序列分析。行核苷酸序列分析。 使目的基因的片段使目的基因的片段在短时间内成百万倍在短时间内成百万倍地扩增。地扩增。3 3）从基因文库中获取目的基因：）从基因文库中获取目的基因：基因文库基因文库: : 将含有某种生物不同基因的许多将含有某种生物不同基因的许多DNADNA片段片段, ,导导入受体菌的群体中储存入受体菌的群
7、体中储存, ,各个受体菌分别含有这种生各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因物的不同的基因, ,称为基因文库称为基因文库(gene library)(gene library)基因组文库基因组文库: : 基因文库中包含了一种生物所有的基因基因文库中包含了一种生物所有的基因, ,这种这种基因文库叫做基因组文库基因文库叫做基因组文库. .部分基因文库部分基因文库: : 基因文库中包含了一种生物的一部分基因基因文库中包含了一种生物的一部分基因, ,这这种基因文库叫做部分基因文库种基因文库叫做部分基因文库. . 用DNA重组技术将某种生物的总DNA用特定的限制性内切酶切割成一个个片段，然后将这些片段随
8、机地连接在某些质粒或其他载体上，再将它们转移到适当的宿主细胞中，通过细胞的增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆），当这些克隆多到可以包括某种生物的全部基因时，这一批克隆的总体就称为该种生物的基因文库。这一定义也适用于线粒体DNA和叶绿体DNA，分别称为某种生物的线粒体基因文库或叶绿体基因文库。为了有效地保存基因文库，可通过细菌在固体培养基上繁殖而使包含各个特定DNA片段的细菌增多。通过分子杂交的方法，可以筛选出包含有所需基因的DNA片段的细菌（或噬菌体）。经过扩增得到大量这样的细菌（或噬菌体），从中便可分离出所需基因的DNA片段。建立和使用基因文库是分离高等真核生物基因的有效手段，对于基因定位
9、和基因工程的研究都很有用。步骤二：步骤二：基因表达载体的构建基因表达载体的构建 1）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一）用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个切口，露出黏性末端。个切口，露出黏性末端。 2）用同一种限制酶切断目的基因，使其产）用同一种限制酶切断目的基因，使其产生相同的黏性末端。生相同的黏性末端。 3）将切下的目的基因片段插入质粒的切口）将切下的目的基因片段插入质粒的切口处，再加入适量处，再加入适量DNA连接酶，形成了一个重连接酶，形成了一个重组组DNA分子（重组质粒）分子（重组质粒） 目的基因与运载体的结合过程，实际目的基因与运载体的结合过程，实际上是不同来源的上是不同来源的基因
10、重组的过程基因重组的过程。常用的受体细胞：常用的受体细胞： 有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。酵母菌和动植物细胞等。将目的基因导入受体细胞的原理将目的基因导入受体细胞的原理借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。步骤三：目的基因导入受体细胞步骤三：目的基因导入受体细胞直接导入法有电击、显微注射、直接吸收、基因枪等直接导入法有电击、显微注射、直接吸收、基因枪等方法。方法。（1 1）电击法：借助电击仪高压脉冲把目的基因打入宿主细胞。）电击法：借助电击仪高压脉冲把目的基因打入宿主细胞。（2 2）显微注射法：利用微量注射器在显
11、微镜下直接把目的基因注）显微注射法：利用微量注射器在显微镜下直接把目的基因注入宿主细胞。入宿主细胞。（3 3）直接吸收法：把目的基因和宿主细胞混在一起，让其吸收。）直接吸收法：把目的基因和宿主细胞混在一起，让其吸收。（4 4）基因枪法：在金属微粒上涂一层目的基因，然后发射到宿主）基因枪法：在金属微粒上涂一层目的基因，然后发射到宿主细胞中。细胞中。间接导入法常用的载体是质粒、间接导入法常用的载体是质粒、噬菌体、科斯质粒。噬菌体、科斯质粒。（1 1）质粒是细菌染色体）质粒是细菌染色体DNADNA以外的环状双链以外的环状双链DNADNA分子，它能自我复分子，它能自我复制，也可整合到细胞染色体制，也可
12、整合到细胞染色体DNADNA中与其一起表达。质粒通常还含有中与其一起表达。质粒通常还含有标记基因，这可以从细胞的表型特征来识别。标记基因，这可以从细胞的表型特征来识别。（2 2）噬菌体是一种细菌病毒，其环状双链噬菌体是一种细菌病毒，其环状双链DNADNA可以作为目的基可以作为目的基因的载体。因的载体。（3 3）科斯质粒是一种杂种质粒，含有质粒和）科斯质粒是一种杂种质粒，含有质粒和噬菌体的部分顺序，噬菌体的部分顺序，很适合用作真核生物基因的载体。很适合用作真核生物基因的载体。1.1.将目的基因导入植物细胞将目的基因导入植物细胞2.2.将目的基因导入动物细胞将目的基因导入动物细胞3.3.将目的基因
13、导入微生物细胞将目的基因导入微生物细胞 大肠杆菌细胞最常用的转化方法是大肠杆菌细胞最常用的转化方法是: : 首先用首先用CaCa2+ 2+ 处理细胞处理细胞, ,以增大细菌细胞壁的通以增大细菌细胞壁的通以增大细菌细胞壁的通以增大细菌细胞壁的通透性透性透性透性, , , ,使细胞处于一种能吸收周围环境中使细胞处于一种能吸收周围环境中DNADNA分子分子的生理状态的生理状态, ,这种细胞称为感受态细胞这种细胞称为感受态细胞. . 第二步是将重组表达载体第二步是将重组表达载体DNADNA分子溶于缓冲液分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合中与感受态细胞混合, ,在一定的温度下促进感受态在一定的温度下促进感
14、受态细胞吸收细胞吸收DNADNA分子分子, ,完成转化过程完成转化过程. . 第二步第二步目的基因在受体细胞内，随其繁殖而目的基因在受体细胞内，随其繁殖而目的基因在受体细胞内，随其繁殖而目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。间内就能获得大量的目的基因。间内就能获得大量的目的基因。间内就能获得大量的目的基因。 1）将细菌用）将细菌用CaCl2处理，以增大细菌细处理，以增大细菌细胞壁的通透性。胞壁的通透性。 2
15、）使含有目的基因的重组质粒进入受体）使含有目的基因的重组质粒进入受体细胞。细胞。 3）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而）目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。短的时间内就能获得大量的目的基因。步骤四：目的基因的检测与鉴定步骤四：目的基因的检测与鉴定四环素四环素抗性基因抗性基因氨苄青霉氨苄青霉素抗性基因素抗性基因 不能，受体细胞必须表现出特定的性状，不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了才能说明目的基因完成了表达表达。受体细胞摄入受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因分子后就说
16、明目的基因完成了表达吗？完成了表达吗？若不能表达，若不能表达，要对抗虫基因要对抗虫基因再进行再进行修饰修饰。前三步的处理十分繁锁，为保证目的基因得到有效前三步的处理十分繁锁，为保证目的基因得到有效利用，通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。利用，通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。这样，处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，这样，处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。必须将它从中检测出来。无表达产物无表达产物无表达产物无表达产物有表达产物有表达产物无表达产物无表达产物细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，
17、检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出入目的基因，摄入的基因是否表达（是否表现出相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应相应的性状）。淘汰无变化的个体，保留有相应变化的个体进一步培养、研究。变化的个体进一步培养、研究。例：用棉铃饲喂棉例：用棉铃饲喂棉
18、铃虫，如虫吃后不出现铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。抗虫基因并得到表达。基因工程的基本操作程序目的基因的获取目的基因的获取基因表达载体的构建基因表达载体的构建将目的基因导入受体细胞将目的基因导入受体细胞目的基因的检测与鉴定目的基因的检测与鉴定1、从基因文库中获取目的基因2、利用PCR技术扩增目的基因3、化学方法人工合成复制原点复制原点 + + 目的基因目的基因 + + 启动子启动子 + + 终止子终止子 + + 标记基因标记基因
19、农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法、显微注射法、CaCa2+2+处理法处理法DNADNA分子杂交技术、分子杂交技术、抗原分子杂交技术、分子杂交技术、抗原抗体杂交技术抗体杂交技术分子检测外的个体水平鉴定分子检测外的个体水平鉴定1）以下说法正确的是）以下说法正确的是 （ ） A、所所有有的的限限制制酶酶只只能能识识别别一一种种特特定定的的核核苷苷酸序列酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运运载载体体必必须须具具备备的的条条件件之之一一是是：具具有有多多个限制酶切点，以便与外源基因连接个限制酶切点，以便与外源
20、基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来、基因控制的性状都能在后代表现出来C练习练习2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能能复复制制 （ ） B、有多个限制酶切点、有多个限制酶切点 C、具有标记基因、具有标记基因 D、它是环状、它是环状DNAD练习练习3）有关基因工程的叙述中，错误的是（）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工
21、合成目的基因不用限制性内切酶人工合成目的基因不用限制性内切酶A练习练习4）有有关关基基因因工工程程的的叙叙述述正正确确的的是是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体、质粒都可作为运载体 D、蛋蛋白白质质的的结结构构可可为为合合成成目目的的基基因因提提供供资料资料D练习练习5）基基因因工工程程是是在在DNA分分子子水水平平上上进进行行设设计计施施工工的的。在在基基因因操操作作的的基基本本步步骤骤中中，不不进进行行碱碱基基互互补补配配对对的的步步骤骤是是 （ ） A、人工合成目的基
22、因、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达、目的基因的检测和表达C练习练习执业医师考试 执业医师考试 wpe36xrz 是在这里蹲点吧！”“你就不能配合点吗。”“你又没让我配合。”被人遗忘的慕容凌娢终于从地上站了起来，但感觉自己的脑细胞正急速死亡，智商再次跌入谷底。韩哲轩怎么会知道我的真名？百蝶好像也知道他去找过夏桦。“呃”慕容凌娢强壮镇定的笑了笑，“韩哲轩你怎么会在这里？”“百蝶不是说了吗，我就是在这里专门等你们的。”韩哲轩极其爽快的承认了自己的行为，“我看见你们两个出来，就跟上了。刚想
23、叫住你就看见你往后摔了幸好我闪的快”这剧情跟我想的怎么不一样？按照言情小说的正常套路，我不是应该被人准确无误的接住吗？然后不就顺理成章的慕容凌娢居然做起了花痴的白日梦。慕容凌娢把自己的幻想和现实仔细对照了一下，又看了看面前这个笑得漫不经心的人，悲痛的捂住了脸童话里的故事果真都是骗人的自己怎么能指望这种人呢？“凌娢你怎么了？”百蝶看着一直发呆的慕容凌娢，稍许有些担忧，“不会真的摔傻了吧！”“没没事。”慕容凌娢紧张的摇了摇头，生怕百蝶看出什么端倪。“不过韩哲轩，你怎么会知道我的真名？”既然韩哲轩知道了自己的名字，也就是知道了自己一开始就说了谎，真的好尴尬啊！“像我这种开挂玩家，怎么能连这种东西都不
24、知道呢。”韩哲轩居然没有再提起“白绫”这个化名，这让慕容凌娢很是欣慰。“是夏先生告诉你的吧！”慕容凌娢绝对不会相信这是可以猜到的东西。“如果你乐意这样想，我不介意。”(古风一言)那时，谁绣芙蓉鸳鸯戏。而今，谁惹青丝千里外。第016章 原来不是青楼“是夏先生告诉你的吧！我的真名。”慕容凌娢绝对不会相信这是可以猜到的东西。“如果你乐意这样想，我不介意。”韩哲轩摊开双手，还是一副漫不经心的样子。“那看来是我想错了，你是怎么知道的？”“猜得。”“哦，原来是这样啊”慕容凌娢表面上笑着说，心里却在告诫自己，冷静一定要冷静，不能着急，不能生气这算是答复吗？太敷衍了吧！不想告诉我就直说吗，真是烦人。韩哲轩最终也没有告诉慕容凌娢他是怎么知道她的真实姓名的，因为这个话题很快就被百蝶机智的转移了，她可不想看着两个人如此尴尬的僵持在大街上，毕竟这样太引人注意了。“凌娢，你不是觉得饿了吗？赶快走吧。”百蝶拉着慕容凌娢的胳膊便将她向前拖去，强行拉开了她和韩哲轩的距离。“就是，如果为了那种小事而饿死在大街上可就划不来了。”要不是被百蝶拉着，慕容凌娢早就扑上去把韩哲轩暴打一顿了，尤其是他那张好看但欠揍的脸，总是笑得让人很不爽。不过话说回来，那个高度对她来说可能不太好触碰。“要不是害怕胳膊疼，我早就把你的脸打成猪头了！”就算打不成，气势
