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1、实验四实验四 产淀粉酶细菌的鉴产淀粉酶细菌的鉴定（续）定（续）电泳结果1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 利用NCBI数据库鉴定菌种http:/www.ncbi.nlm.nih.gov/Bacillusthuringiensis苏云金芽孢杆菌实验结果与分析利用NCBI数据库对测序结果进行BLAST，分析筛选的微生物属于什么种属。进化树实验结果与分析根据上述进化树，分析本班级分离到的产淀粉酶细菌的种属特征有什么规律实验五 淀粉酶产生菌的 紫外诱变育种第二模块产淀粉酶微生物的筛选和选育1.观察紫外线
2、对产生淀粉酶细菌的诱变效应；2.学习并掌握紫外线诱变育种的方法；3.熟悉有关微生物突变体的筛选方法以及筛选培养基的设计思路。实验目的实验原理（一）诱变诱变（mutagenesis）是指用物理、化学或生物因素诱导生物体的遗传特性发生变异的方法。对微生物而言，采用物理或化学诱变剂处理均匀分散的微生物细胞群，促进其突变频率大幅度提高，然后用简便、快速、高效的筛选方法，从中挑选符合育种要求的突变株，供生产或科研用。（二）常用的各类诱变剂物理诱变剂紫外线、快中子、x射线、射线、射线、激光、离子束化学诱变剂碱基类似物2氨基嘌呤、5溴尿嘧啶、8氮鸟嘌呤与碱基反应的物质硫酸二乙酯、甲基硫酸乙酯、亚硝基胍、亚硝
3、基甲基脲、亚硝基乙基脲、亚硝酸、氮芥、四硝基喹啉、乙烯亚胺、羟胺等在DNA分子中插入或缺失一个或几个碱基吖啶类染料生物诱变剂噬菌体、转座子（三）紫外线诱变机理DNA对紫外线有强烈的吸收作用，尤其是碱基中的嘧啶，它比嘌呤更为敏感。紫外线引起DNA结构变化的形式很多，如DNA链的断裂、碱基破坏。其最主要的作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成胸腺嘧啶二聚体，阻碍碱基间的正常配对，从而引起微生物突变或死亡。（三）紫外线诱变机理紫外线具有致死和诱变的双重效应，现代育种理论认为，当诱变的微生物致死率在75%-80%时，产量性状正突变率较高。因此需要测定微生物经紫外线照射后的致死率，确定最佳的照射时间。紫外线
4、虽然对生物体构成杀伤力，但是穿透能力很弱，不能穿透玻璃、衣物和纸张等。（四）光修复现象经紫外线损伤的DNA，能被可见光修复！因此为了避免细菌光复活，用紫外线照射处理时以及处理后的操作应该在红光下进行，并且将照射处理后的微生物置于暗处培养。实验器材1.菌种 诱变出发菌株：自土壤分离的淀粉酶产生菌菌株2.培养基 牛肉膏蛋白胨固体培养基、淀粉培养基3.主要试剂 无菌水、碘液4.主要器皿 紫外交联仪、离心管、移液器、离心机、玻璃涂布棒等实验步骤（一）实验准备各组挑选一株产淀粉酶的细菌，用无菌的接种环，从菌种斜面保存管挑取少量菌落，接种到试管液体培养基。每组接种一支。置于30、220rpm的摇床上培养8
5、小时。（二）平板制作融化淀粉培养基，每组倒6块平板，在平板上做好标识。1.处理 + 10-62.处理 + 10-73.处理 + 10-84.未处理 + 10-65.未处理 + 10-76.未处理 + 10-8（三）细菌悬液制备1.取液体培养物（培养了8h）0.5mL于dorf管中，每组2管，8000rpm，离心5min，弃上清；2.每管菌体用1mL无菌水洗涤一次， 8000rpm，离心5min，弃上清；3.每管再各加1mL无菌水制成菌悬液。（四）稀释涂布1.稀释菌液：将菌悬液用无菌水按10倍稀释法依次稀释（在dorf管中进行），得到；2.涂布平板：分别取10-6、10-7、10-8三个浓度的菌
6、悬液0.1ml涂布平板，每个稀释度涂布2块平板。注意无菌操作、涂布均匀，静置5min。（五）紫外诱变以下操作需在避光条件下进行1.将紫外交联仪打开预热20分钟；2.将10-6、10-7、10-8平板置于紫外诱变箱中，打开皿盖，照射200102J/cm2（单号排）或者100102J/cm2 （双号排），然后迅速盖上皿盖；3.将上述平板和未处理的平板置于筐中，30避光倒置培养24小时。 （六）试管转接将试管斜面进行二次转接。转接方法如下图所示。（七）观察、分析结果（七）观察、分析结果观察诱变效应：分别对处理和未处理的10-6、10-7、10-8平板上铺碘液，测量淀粉水解圈直径与菌落直径并计算其比值（H/C比值），比较处理和未处理组的数值，说明诱变效应。实验记录1.计算并记录经紫外照射后的细菌存活率和致死率。2.拍照记录并描述出菌株经紫外照射后的平板水解圈的变化情况并记录H/C比值。完成本模块实验论文的写作（两周）。实验思考1.紫外线诱变的机制是什么？2.为确保诱变效果，实验操作中应该注意哪些问题？
