十三章生物技术在植物育种中的应用

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1、十三章生物技术在植物育种中的应用Stillwatersrundeep.流静水深流静水深,人静心深人静心深Wherethereislife,thereishope。有生命必有希望。有生命必有希望1、教学的基本要求、教学的基本要求（1）了解细胞工程与作物育种的原理）了解细胞工程与作物育种的原理和基本方法；和基本方法；（2）了解作物的转基因技术的原理和）了解作物的转基因技术的原理和基本方法；基本方法；（3）了解分子标记的主要类型和分子）了解分子标记的主要类型和分子标记辅助选择育种的原理和基本方法。标记辅助选择育种的原理和基本方法。2、教学基本内容、教学基本内容第一节第一节细胞工程与作物育种细胞工程与

2、作物育种一、细胞和组织培养与作物育种一、细胞和组织培养与作物育种二、植物原生质体培养和体细胞杂交二、植物原生质体培养和体细胞杂交第二节第二节作物育种的转基因技术作物育种的转基因技术一、转基因技术的发展现状一、转基因技术的发展现状二、二、*转基因育种的程序转基因育种的程序三、转基因作物品种的选育三、转基因作物品种的选育四、转基因作物的生物安全性四、转基因作物的生物安全性第三节第三节分子标记辅助选择育种分子标记辅助选择育种一、一、*分子标记的类型和特点分子标记的类型和特点二、常用分子标记的原理和遗传特性二、常用分子标记的原理和遗传特性三、三、MAS育种方法育种方法第十三章第十三章生物技术在作物育种

3、生物技术在作物育种中的应用中的应用第一节第一节 细胞工程与作物育种细胞工程与作物育种 植物细胞工程植物细胞工程（plant cell plant cell engineeringengineering）是以植物组织和细胞培养技是以植物组织和细胞培养技术为基础发展起来的一门学科。它以细胞术为基础发展起来的一门学科。它以细胞为基本单位，在体外（为基本单位，在体外（in vitroin vitro）条件下）条件下进行培养、繁殖或人为地使细胞某些生物进行培养、繁殖或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿生产某种物质的过程。学特性按人们的意愿生产某种物质的过程。 细胞工程与作物遗传改良有着密细胞工程与作

4、物遗传改良有着密切关系，利用细胞工程技术已培育出切关系，利用细胞工程技术已培育出一些大面积推广的品种。一些大面积推广的品种。 早期，哈布兰特在前人细胞学说的早期，哈布兰特在前人细胞学说的影响下，提出影响下，提出高等植物的组织和器官高等植物的组织和器官可以不断分割可以不断分割，并进一步提出了，并进一步提出了植物植物细胞全能性（细胞全能性（celltotipotency）理论。）理论。植物细胞全能性是植物细胞工植物细胞全能性是植物细胞工程的理论基础程的理论基础。细胞全能性是指细细胞全能性是指细胞所具有的形成各种细胞类型的潜胞所具有的形成各种细胞类型的潜在能力，也包括植物细胞经脱分化在能力，也包括植

5、物细胞经脱分化再形成植株的能力。再形成植株的能力。1904年，年，Hanning用萝卜的胚培用萝卜的胚培养，获得小植株，为组织培养的工作奠养，获得小植株，为组织培养的工作奠定了基础。定了基础。1934年，年，White对番茄切段进行培对番茄切段进行培养，建立了第一个活跃生长的无性繁殖养，建立了第一个活跃生长的无性繁殖系，获得了离体培养的真正成功。系，获得了离体培养的真正成功。三年后，三年后，White又发现又发现B族维生素对族维生素对培养物的生长有重要作用。培养物的生长有重要作用。经过几年的努力，以经过几年的努力，以White为主为主的几位科学家建立了植物组织培养的几位科学家建立了植物组织培养

6、（plainttissueculture）的综合培）的综合培养基，成为以后各种培养基的基础。养基，成为以后各种培养基的基础。1948年，年，Skoog等发现腺嘌呤等发现腺嘌呤/生长素生长素的比例是控制芽和根分化的决定因素之一，的比例是控制芽和根分化的决定因素之一，这一发现成为植物组织培养中控制器官形成这一发现成为植物组织培养中控制器官形成的激素模式。的激素模式。Miller（1956）发现激动素比腺嘌呤更）发现激动素比腺嘌呤更能促进芽的形成。能促进芽的形成。1958年，年，Stewart&Shautz从胡萝卜从胡萝卜根的根的悬浮细胞悬浮细胞诱导分化成完整小植株，使诱导分化成完整小植株，使50多

7、年前哈布兰特提出的细胞全能性假说首次得多年前哈布兰特提出的细胞全能性假说首次得到科学验证，这一成果大大加速了植物组织培到科学验证，这一成果大大加速了植物组织培养研究的发展。养研究的发展。1964年，年，Guha等从曼佗罗等从曼佗罗花药花药培养出培养出单倍体植株。单倍体植株。1970年，年，Kameya等利用等利用花粉花粉培养获培养获得单倍体植株。得单倍体植株。1971年，年，Takebe等首次从烟草等首次从烟草原生质原生质体体获得再生植株；获得再生植株；1972年，年，Carlson等获得第一个烟草等获得第一个烟草种种间体细胞杂种间体细胞杂种植株。植株。至此，在愈伤组织水平、单个细胞至此，在愈

8、伤组织水平、单个细胞水平、单个生殖细胞水平、原生质体水水平、单个生殖细胞水平、原生质体水平和体细胞杂种水平都获得了完整植株，平和体细胞杂种水平都获得了完整植株，充分证实了植物细胞的全能性。充分证实了植物细胞的全能性。植物组织培养流程示意图如下。植物组织培养流程示意图如下。外植体来源外植体来源外植体培养外植体培养愈伤组愈伤组织织再生小植株再生小植株再生植株再生植株植物细胞工程的应用在植物细胞工程的应用在20世纪世纪60年代就已受到重视，但真正的应用研究年代就已受到重视，但真正的应用研究在在70年代才进入高潮。我国第一个用花年代才进入高潮。我国第一个用花药培养育成烟草品种，随后又育成了一药培养育成

9、烟草品种，随后又育成了一些水稻、小麦新品种。些水稻、小麦新品种。经济植物的经济植物的快繁与脱毒快繁与脱毒、体细胞变异的、体细胞变异的筛选、新种质的创造、细胞器的移植、筛选、新种质的创造、细胞器的移植、DNA的导入等均对作物改良和农业生产起到了促的导入等均对作物改良和农业生产起到了促进作用。进作用。一、一、植物的细胞和组织培养技术植物的细胞和组织培养技术（一）培养基及其组成（一）培养基及其组成 1 1、培养基（、培养基（MediumMedium）的种类和）的种类和特点特点常用的培养基有常用的培养基有MS、B5、White、N6、KM-8p、SH等。等。2、培养基的成分、培养基的成分培养基中都应包

10、括植物生长必需的培养基中都应包括植物生长必需的16种种营养元素和某些生理活性物质，通常将这些营养元素和某些生理活性物质，通常将这些物质分为三大类，即无机营养物、有机物质物质分为三大类，即无机营养物、有机物质和植物生长调节物质（表）。和植物生长调节物质（表）。表表植物组织培养所需的养分和激素植物组织培养所需的养分和激素水水有机物有机物大量元素大量元素微量元素微量元素PH糖糖NFeCo氨基酸氨基酸PZnNi维生素维生素KBAl生长素生长素CaMnMo细胞分裂素细胞分裂素MgCuI调节物质调节物质赤霉素赤霉素S脱落酸脱落酸乙烯乙烯酵母提取物酵母提取物椰子汁椰子汁成分不定物质成分不定物质植物提取物植物

11、提取物水解酪蛋白水解酪蛋白蛋白胨蛋白胨（二）培养基的配制（二）培养基的配制1、母液的配制、母液的配制为了为了减少配制培养基时每次称量药减少配制培养基时每次称量药品的麻烦，减少极微量药品在每次称重品的麻烦，减少极微量药品在每次称重时误差时误差，一般先配制，一般先配制高浓度的储备液，高浓度的储备液，即即母液母液。大量元素可配成大量元素可配成10倍母液倍母液，使用，使用时每配制时每配制1000ml培养基需要从母液培养基需要从母液中取中取100ml。配制母液时应做到分别。配制母液时应做到分别称量，充分溶解，在混合次序上应最称量，充分溶解，在混合次序上应最后加入后加入Ca2+，混合时要边加边，混合时要边

12、加边混合。混合。微量元素因为使用量低，一般配微量元素因为使用量低，一般配成成100倍甚至倍甚至1000倍母液倍母液，使用时每配，使用时每配制制1L培养基从母液中取培养基从母液中取10ml或或1ml，配制时应注意充分溶解后再依次混合。配制时应注意充分溶解后再依次混合。 第三种母液即铁盐，第三种母液即铁盐，铁盐必须单铁盐必须单独配制，独配制，若与其它元素混合易造成沉若与其它元素混合易造成沉淀。淀。一般采用鳌合铁一般采用鳌合铁，即，即FeSO4与与EDTA钠盐的混合物，一般扩大钠盐的混合物，一般扩大200倍。倍。 EDTA钠盐须用温水溶解，然钠盐须用温水溶解，然后与后与FeSO4液混合，在液混合，在

13、7580之间让其鳌合之间让其鳌合1h。使用鳌合铁的使用鳌合铁的目的是避免沉淀，并使培养基能缓目的是避免沉淀，并使培养基能缓慢不断地供应慢不断地供应Fe+。 第四种母液为有机化合物母液，主要是第四种母液为有机化合物母液，主要是维生素和氨基酸类物质，维生素和氨基酸类物质，这类物质不能配成这类物质不能配成混合母液，混合母液，一定要分别配成单独的母液，一定要分别配成单独的母液，浓浓度为每毫升含度为每毫升含0.1、1、10mg，使用时根，使用时根据需要量取。据需要量取。最后一种母液是激素，最后一种母液是激素，每种激素每种激素应单独配制母液应单独配制母液，其浓度为，其浓度为0.1、0.5或或1.0mg/m

14、l。多种激素难溶于水，。多种激素难溶于水，配制时应注意溶解次序。配制时应注意溶解次序。IAA、NAA、GA3、玉米素先溶于少、玉米素先溶于少量量95%酒精，再加水定容；酒精，再加水定容；NAA可溶于热可溶于热水或少量酒精后，再加水定容；水或少量酒精后，再加水定容；2，4-D不不溶于水，可用溶于水，可用1mol的的NaOH溶解后再定容；溶解后再定容；KT和和BA应先溶于少量应先溶于少量1molHCl中，然后中，然后定容。定容。表表一些植物组织培养基的成分（一些植物组织培养基的成分（mg/L）-成分成分MSB5ORWhiteNitschSHHellerLSER-大量元素大量元素NH4NO31650

15、-1650-720-16501200KNO319002527.51900809502500-19001900CaCl2 2H2O440150-20075440440CaCl2-440-166-MgSO4 7H2O370246.5370750185400250370370KH2PO4170-170-68-170340NH4H2PO4-340-（NH4）2SO4-134-Ca（NO3）2 4H2O-300-NaNO3-600-NaH2PO4 H2O-150-19-125-KCl-65-750-成分成分MSB5ORWhiteNitschSHHellerLSER-微量元素微量元素KI 0.83 0.7

16、5 3.32 0.75 - 1 0.01 0.83 -KI 0.83 0.75 3.32 0.75 - 1 0.01 0.83 -H H3 3BOBO3 3 6.2 3 24.8 1.5 10 5 1 6.2 0.63 6.2 3 24.8 1.5 10 5 1 6.2 0.63MnSOMnSO4 44H4H2 2O 22.3 - 89.2 5 25 - 0.1 22.3 2.23O 22.3 - 89.2 5 25 - 0.1 22.3 2.23MnSOMnSO4 4HH2 2O - 10 - - - 10 - - -O - 10 - - - 10 - - -Zn SOZn SO4 47H7

17、H2 2O 8.6 2 34.4 3 10 1 1 8.6 -O 8.6 2 34.4 3 10 1 1 8.6 -Zn SOZn SO4 44H4H2 2O - - - - - - - - -O - - - - - - - - -Zn NaZn Na2 2EDTA - - - - - - - - 15EDTA - - - - - - - - 15NaNa2 2MoOMoO4 42H2H2 2O 0.25 0.25 1.0 - 0.25 0.1 - 0.25 0.025O 0.25 0.25 1.0 - 0.25 0.1 - 0.25 0.025MoOMoO3 3 - - - 0.001 -

18、- - - - - - - 0.001 - - - - -Cu SOCu SO4 4 - - - - - 0.2 - - - - - - - - 0.2 - - -Cu SOCu SO4 45H5H2 2O 0.025 0.025 0.1 0.01 0.025 - 0.03 0.025 0.0025O 0.025 0.025 0.1 0.01 0.025 - 0.03 0.025 0.0025CoClCoCl2 26H6H2 2O 0.025 0.025 0.1 - - 0.1 - 0.025 0.0025O 0.025 0.025 0.1 - - 0.1 - 0.025 0.0025CoSO

19、CoSO4 47H7H2 2O - - - - - - 0.03 - -O - - - - - - 0.03 - -AlClAlCl3 3 - - - - - - - - - - - - - - - - - -NiClNiCl2 26H6H2 2O - - - - - - 0.03 - -O - - - - - - 0.03 - - -铁盐成分铁盐成分MSB5ORWhiteNitschSHHellerLSER-FeCl366H2O-1-Fe2(SO4)3-2.5-FeSO477H2O27.8-27.8-27.815-27.827.8Na2EDTA2HEDTA2H2 2O O37.3-37.3-

20、37.320-37.337.3NaFe EDTA-28-1-成分成分MSB5ORWhiteNitschSHHellerLSER有机物有机物盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇0.5110.010.50.5-0.5盐酸硫胺素盐酸硫胺素0.110130.010.55-0.40.5烟酸烟酸0.5110.0555-0.5肌醇肌醇100100100-1001000-100-甘氨酸甘氨酸2-32-2脯氨酸脯氨酸-1381-叶酸叶酸-0.5-生物素生物素-0.05-蔗糖蔗糖3%2%3%2%2%3%-3%4%2、培养基的配制、培养基的配制以配制以配制1L培养基为例，培养基配制方法培养基为例，培养基配制方法如下：如下：混合各成

21、分母液。取大量元素混合各成分母液。取大量元素母液母液100ml、微量元素母液、微量元素母液10ml、铁、铁盐母液盐母液5ml于一个于一个1L烧杯中，依次加烧杯中，依次加入有机成分和激素，并加水至入有机成分和激素，并加水至500ml。熔化琼脂：称熔化琼脂：称78g琼脂和所需琼脂和所需蔗糖于另一蔗糖于另一1L烧杯中，加水至烧杯中，加水至500ml，待糖溶解后，加热使琼脂充分熔化。，待糖溶解后，加热使琼脂充分熔化。将（将（1）和（）和（2）混合，搅拌均匀，）混合，搅拌均匀，补水至补水至1000ml。调调PH。一般用。一般用0.1molNaOH或或1NHCl调调PH至所需至所需PH。一般。一般PH调至

22、调至5.8，但，但也有也有PH调到调到7.0的，不同材料的最适的，不同材料的最适PH不一不一样。对培养基的凝固来说，样。对培养基的凝固来说，PH较高时，培养较高时，培养基过硬，不便于培养材料吸收营养；基过硬，不便于培养材料吸收营养；PH过低，过低，低到低到4.0以下时，培养基很难凝固。以下时，培养基很难凝固。分装：将培养基分装于分装：将培养基分装于100ml或或50ml三角瓶中，每瓶三角瓶中，每瓶50或或30ml左左右，封口包装。右，封口包装。灭菌：一般用灭菌：一般用1.1kg/cm2压力，压力，在在121下灭菌下灭菌1520min。灭菌时间。灭菌时间应根据材料掌握。时间短，灭菌不彻底；应根据

23、材料掌握。时间短，灭菌不彻底；时间长，会引起培养基成分降解。时间长，会引起培养基成分降解。放置备用。灭菌后取出培养瓶放置备用。灭菌后取出培养瓶放置在培养台上，使之冷却凝固。培放置在培养台上，使之冷却凝固。培养瓶应平放，以免形成斜面。养瓶应平放，以免形成斜面。（三）无菌操作方法（三）无菌操作方法1、消毒剂、消毒剂在接种前，必须使材料完全无菌，这是在接种前，必须使材料完全无菌，这是取得植物组织培养成功的基本保证。要保证取得植物组织培养成功的基本保证。要保证这一点，取材时应选取植物组织内部无菌的这一点，取材时应选取植物组织内部无菌的材料。从健壮植株上取材，不要有伤口；严材料。从健壮植株上取材，不要有

24、伤口；严格防止病虫。格防止病虫。应在晴天取材，最好中午或下午取材。应在晴天取材，最好中午或下午取材。最好避免选用田间材料，选用无菌苗较好。最好避免选用田间材料，选用无菌苗较好。非要用田间材料时，为避免消毒困难，可将非要用田间材料时，为避免消毒困难，可将材料种在大棚或生长箱里。常用的消毒剂见材料种在大棚或生长箱里。常用的消毒剂见表。表。表表植物材料消毒常用的消毒剂及使用方法植物材料消毒常用的消毒剂及使用方法-消毒剂消毒剂使用浓度使用浓度消除难易消除难易消毒时间消毒时间消毒效果消毒效果（%）（min）-次氯酸钠次氯酸钠2易易530很好很好次氯酸钙次氯酸钙910易易530很好很好漂白粉漂白粉饱和溶液

25、饱和溶液易易530很好很好氯化汞氯化汞0.11.0较难较难210最好最好酒精酒精7075易易0.22好好H2O21012最易最易515好好溴水溴水12 易易210很好很好AgNO31较难较难530好好抗生素抗生素450mg/L中中3060较好较好对于难消毒的材料，如有茸毛的、粗糙对于难消毒的材料，如有茸毛的、粗糙不平的材料等，在消毒前，一般先用肥皂水不平的材料等，在消毒前，一般先用肥皂水洗，自来水冲净，在洗，自来水冲净，在70%酒精或酒精或1LHCl中中浸浸30s，再加入消毒剂。不同的材料消毒的，再加入消毒剂。不同的材料消毒的方式和所需时间不一样，研究者应根据不同方式和所需时间不一样，研究者应

26、根据不同材料确定具体消毒方案。材料确定具体消毒方案。2、无菌操作、无菌操作准备好接种材料用的培养基、待消毒的材准备好接种材料用的培养基、待消毒的材料、无菌水、无菌烧杯及其它必需玻璃器皿、料、无菌水、无菌烧杯及其它必需玻璃器皿、无菌操作工具（如剪刀、镊子、解剖刀等，这无菌操作工具（如剪刀、镊子、解剖刀等，这些工具可用高温消毒，也可用高压高温灭菌，些工具可用高温消毒，也可用高压高温灭菌，也可随用随消毒）、也可随用随消毒）、70%酒精等。酒精等。将超净工作台打开，让其运行将超净工作台打开，让其运行10min左左右，在超净工作台上打开烧杯和无菌水瓶盖，右，在超净工作台上打开烧杯和无菌水瓶盖，将将HgC

27、l2（0.1%）倒入有待消毒材料的烧杯）倒入有待消毒材料的烧杯中，中，510min后取出另一盛有无菌水的烧杯后取出另一盛有无菌水的烧杯中，无菌水冲洗中，无菌水冲洗34次，然后将材料取出接种次，然后将材料取出接种在培养基中，封口，放入培养室培养。在培养基中，封口，放入培养室培养。无菌操作时应注意下面几个问题：整过无菌操作时应注意下面几个问题：整过操作过程一切用具必须始终保持无菌状态；操作过程一切用具必须始终保持无菌状态；无菌操作前必须用肥皂洗手，然后用无菌操作前必须用肥皂洗手，然后用70%酒酒精洗手；操作时无菌器皿一旦打开，应尽量精洗手；操作时无菌器皿一旦打开，应尽量避免手再从其上横过；避免强呼

28、吸，呼吸时避免手再从其上横过；避免强呼吸，呼吸时应将脸移开超净台；每次重新操作都要把工应将脸移开超净台；每次重新操作都要把工具在火焰上消毒，避免交叉污染。具在火焰上消毒，避免交叉污染。3、无菌培养、无菌培养材料接种后移入培养室培养，一般材料接种后移入培养室培养，一般培养室要求非常卫生，恒温，有理想的培养室要求非常卫生，恒温，有理想的光照控制系统，一般材料要求光照控制系统，一般材料要求25左左右，晚上一般不低于右，晚上一般不低于20。二、二、细胞和组织培养与作物育种细胞和组织培养与作物育种（一）（一）体细胞克隆变异及其育种利用体细胞克隆变异及其育种利用在近在近50年中，以植物组织培养年中，以植物

29、组织培养为基础的生物技术的研究与发展为植为基础的生物技术的研究与发展为植物育种提供了一些新的实验方法和手物育种提供了一些新的实验方法和手段，并且培养出一些在生产上有利用段，并且培养出一些在生产上有利用价值的品种。价值的品种。体细胞克隆变异指植物组织和体细体细胞克隆变异指植物组织和体细胞培养物在培养过程中产生的变异胞培养物在培养过程中产生的变异。Larkin等（等（1981）在其综述文章中开始）在其综述文章中开始使用使用“体细胞克隆变异体细胞克隆变异”（somaclonalvariation）这一概念。）这一概念。为了区分来源于体细胞和单倍体细为了区分来源于体细胞和单倍体细胞的变异，胞的变异，E

30、vans将将来自配子体组织的来自配子体组织的变异称为变异称为“配子体克隆变异配子体克隆变异”（gametoclonalvariation），以），以与体细胞克隆变异区分开。与体细胞克隆变异区分开。对于遗传变异的分析而言，对于遗传变异的分析而言，Orton为了为了统一术语，引进了统一术语，引进了R0、R1、R2等，分别表示等，分别表示再生再生当代、自交第一代、第二代等，至今这当代、自交第一代、第二代等，至今这一概念还在广泛应用。一概念还在广泛应用。1、体细胞克隆变异的遗传基础、体细胞克隆变异的遗传基础（1）染色体数目变异）染色体数目变异最多最多见的是多倍体，主要是培养基中使见的是多倍体，主要是培

31、养基中使用了细胞分裂素。用了细胞分裂素。变异的大小与培养状态、年龄、变异的大小与培养状态、年龄、原始材料的倍性及培养时期有关。研原始材料的倍性及培养时期有关。研究发现：二倍体变异的频率随培养时究发现：二倍体变异的频率随培养时间的延长而降低，四倍体变异的频率间的延长而降低，四倍体变异的频率却随培养时间的延长而增加。却随培养时间的延长而增加。（2）染色体结构变异）染色体结构变异染色体结构变染色体结构变异似乎是体细胞克隆变异的主要来源，最重要异似乎是体细胞克隆变异的主要来源，最重要的是染色体缺失、倒位、重复和异位。很多体的是染色体缺失、倒位、重复和异位。很多体细胞再生株减数分裂时形成多价体、染色体桥

32、、细胞再生株减数分裂时形成多价体、染色体桥、小片段、环等，充分说明了染色体结构变异的小片段、环等，充分说明了染色体结构变异的存在。存在。（3）点突变）点突变这类突变可分为多种类这类突变可分为多种类型，一种类型是型，一种类型是自发突变自发突变，最早证实点突变，最早证实点突变存在的是从烟草中利用体外筛选获得抗存在的是从烟草中利用体外筛选获得抗chlorsulfuron的突变体。很多通过细胞筛选的突变体。很多通过细胞筛选获得的抗病、抗除草剂等突变体属于此类。获得的抗病、抗除草剂等突变体属于此类。另一种点突变是诱发突变，培养另一种点突变是诱发突变，培养基中加入化学诱变剂或进行诱变处理。基中加入化学诱变

33、剂或进行诱变处理。由于培养过程中，培养物一直处于诱由于培养过程中，培养物一直处于诱变的环境条件下，所以突变究竟是变的环境条件下，所以突变究竟是自自发发还是还是诱发诱发很难搞清楚。很难搞清楚。第三种点突变是第三种点突变是基因的表达及基因放大基因的表达及基因放大或衰减。或衰减。高等植物的某些基因在发育过程中高等植物的某些基因在发育过程中受到某一环境刺激，可以受到某一环境刺激，可以放大自己，即基因放大自己，即基因的拷贝数大量增加的拷贝数大量增加，这意味着该基因转录的，这意味着该基因转录的mRNA及蛋白质增加。最初在动物细胞培养及蛋白质增加。最初在动物细胞培养中发现这一现象，后来在植物中发现也存在。中

34、发现这一现象，后来在植物中发现也存在。比如，对某一物质的抗性，可以通过逐比如，对某一物质的抗性，可以通过逐步增加浓度的办法而使细胞对该物质的抗性步增加浓度的办法而使细胞对该物质的抗性提高很多倍，这就是基因放大系统存在的很提高很多倍，这就是基因放大系统存在的很好例证。同样，也发现植物细胞好例证。同样，也发现植物细胞DNA的丢失的丢失（衰减），（衰减），如大豆悬浮系经过较长时间的培如大豆悬浮系经过较长时间的培养，其核糖体基因丢失了养，其核糖体基因丢失了1/3。第四种点突变是有丝分裂交换。这种交第四种点突变是有丝分裂交换。这种交换尽管很微弱地改变了基因的顺序，但仍影换尽管很微弱地改变了基因的顺序，但

35、仍影响基因的表达。这种变化包括：某一基因拷响基因的表达。这种变化包括：某一基因拷贝的丢失，某一基因拷贝的重复或修复过程贝的丢失，某一基因拷贝的重复或修复过程中基因的转变。中基因的转变。转座因子也是造成体细胞突变的原因之转座因子也是造成体细胞突变的原因之一，转座子通过插入与解离使某些基因的表一，转座子通过插入与解离使某些基因的表达受到调控。达受到调控。最后细胞质基因叶绿体和线粒体基因也最后细胞质基因叶绿体和线粒体基因也能发生突变。能发生突变。Gengenbachetal（1975）利用玉米利用玉米T小种毒素筛选获得了抗小种毒素筛选获得了抗T小种的细小种的细胞系，这个基因已知位于胞质中。胞系，这个

36、基因已知位于胞质中。离体培养细胞会产生各种类型的突离体培养细胞会产生各种类型的突变体，除抗性突变体外，还有形态性状变体，除抗性突变体外，还有形态性状突变体、不育性、产量和品质性状的改突变体、不育性、产量和品质性状的改变等。形态变异如矮化性、叶型等，利变等。形态变异如矮化性、叶型等，利用这些变异可以进行高光效育种。用这些变异可以进行高光效育种。培养再生植株中出现不育性的频率较高，培养再生植株中出现不育性的频率较高，但大多为核基因的突变，可以用来培育不育但大多为核基因的突变，可以用来培育不育系。产量和品质的突变必须在田间通过适当系。产量和品质的突变必须在田间通过适当的分析才能确定。实验室内细胞水平

37、的突变的分析才能确定。实验室内细胞水平的突变体筛选多数在抗性突变体方面开展工作，如体筛选多数在抗性突变体方面开展工作，如抗病、耐盐、抗重金属等。抗病、耐盐、抗重金属等。2、突变体的筛选、突变体的筛选为了增加突变频率，需要进行诱变处理。为了增加突变频率，需要进行诱变处理。将外植体、愈伤或悬浮系用诱变剂处理，如将外植体、愈伤或悬浮系用诱变剂处理，如使用化学诱变剂，要充分洗涤后再进入下一使用化学诱变剂，要充分洗涤后再进入下一步的工作。使用多大剂量和处理多长时间才步的工作。使用多大剂量和处理多长时间才能达到较好诱变效果，应根据具体试验确定。能达到较好诱变效果，应根据具体试验确定。在突变体筛选中常采用两

38、种选择法，即在突变体筛选中常采用两种选择法，即一步筛选法和多步筛选法。一步筛选法和多步筛选法。一步筛选法是一步筛选法是将培养物接种在含有最低将培养物接种在含有最低全部致死剂量的培养基上全部致死剂量的培养基上，表现出生长的培，表现出生长的培养物再转移到含有抑制剂的新鲜培养基上。养物再转移到含有抑制剂的新鲜培养基上。可以看出，这种方法是一次就把可以看出，这种方法是一次就把筛选压设定很高筛选压设定很高，使不抗细胞（野生，使不抗细胞（野生细胞）完全不可能生长，筛选出的能细胞）完全不可能生长，筛选出的能生长的细胞即为耐（抗）性细胞系。生长的细胞即为耐（抗）性细胞系。但在有些情况下这种方法不一定实用，但在

39、有些情况下这种方法不一定实用，有的细胞在超过最低全部致死浓度时，细胞有的细胞在超过最低全部致死浓度时，细胞均死亡，或单个细胞不能生存。多步筛选法均死亡，或单个细胞不能生存。多步筛选法是首先使用半致死剂量对细胞进行筛选，每是首先使用半致死剂量对细胞进行筛选，每次继代将上代能生长的细胞系继代到筛选剂次继代将上代能生长的细胞系继代到筛选剂浓度提高的新鲜培养基上。浓度提高的新鲜培养基上。在这种筛选体制下，抗性细胞应在这种筛选体制下，抗性细胞应该比野生细胞长的快，通过逐步增加该比野生细胞长的快，通过逐步增加筛选剂水平，最终会筛选出在抑制剂筛选剂水平，最终会筛选出在抑制剂超过最低全部致死浓度时也能旺盛生超

40、过最低全部致死浓度时也能旺盛生长的细胞系。长的细胞系。但是，去除抑制剂后，抗性培养物的稳但是，去除抑制剂后，抗性培养物的稳定性是常出现的一个问题，抗性丢失来自很定性是常出现的一个问题，抗性丢失来自很多原因，包括细胞对抑制剂的生理适应。可多原因，包括细胞对抑制剂的生理适应。可见，多步筛选易获得在某一抑制剂水平下，见，多步筛选易获得在某一抑制剂水平下，细胞稳定生长的细胞系。细胞稳定生长的细胞系。筛选的材料对象可以是原生质体、愈筛选的材料对象可以是原生质体、愈伤块、悬浮培养物和花粉伤块、悬浮培养物和花粉/小孢子培养物。小孢子培养物。利用原生质体进行抗性筛选有一大优点：利用原生质体进行抗性筛选有一大优

41、点：筛选出的克隆极有可能来自单细胞，但是筛选出的克隆极有可能来自单细胞，但是操作困难。操作困难。利用愈伤块筛选是最简单的方法，但这利用愈伤块筛选是最简单的方法，但这种筛选存在一定缺陷，愈伤块里的各个细胞种筛选存在一定缺陷，愈伤块里的各个细胞不能均等地接触抑制剂，下部愈伤细胞比上不能均等地接触抑制剂，下部愈伤细胞比上部细胞吸收到较多的抑制剂，这样就使筛选部细胞吸收到较多的抑制剂，这样就使筛选结果在一定程度上失去可靠性。结果在一定程度上失去可靠性。悬浮细胞筛选也很常用，细胞接触选择悬浮细胞筛选也很常用，细胞接触选择剂较均匀，但存在一定的操作复杂性。花粉剂较均匀，但存在一定的操作复杂性。花粉/小孢子

42、培养物用于突变体筛选有一定优势，小孢子培养物用于突变体筛选有一定优势，突变体很容易表现出来，也很易纯合。突变体很容易表现出来，也很易纯合。3、在作物改良上的应用、在作物改良上的应用利用上述方法便可筛选体细胞克隆变利用上述方法便可筛选体细胞克隆变异，将这一技术应用于作物改良技术路线异，将这一技术应用于作物改良技术路线见图。见图。优良品种优良品种细胞培养细胞培养R0R1群体群体改良的体细胞克隆改良的体细胞克隆确定遗传方式确定遗传方式田间实验田间实验遗传稳定性测试遗传稳定性测试多点田间实验多点田间实验育成新品系育成新品系继续田间实验，种子富集继续田间实验，种子富集区域试验区域试验审审定定投入生产投入

43、生产图图利用体细胞克隆变异育种的技术路线利用体细胞克隆变异育种的技术路线（二）（二）单倍体细胞培养及育种利用单倍体细胞培养及育种利用1、单倍体细胞培养在遗传和育种中的应用价值、单倍体细胞培养在遗传和育种中的应用价值花药培养（花药培养（antherculture）是指在获得）是指在获得单倍体的一种技术，之后，花粉和小孢子培养单倍体的一种技术，之后，花粉和小孢子培养逐渐获得成功，从而使单倍体细胞培养体系更逐渐获得成功，从而使单倍体细胞培养体系更加完善。单倍体在遗传和育种研究中有如下优加完善。单倍体在遗传和育种研究中有如下优点：点：（1）后代的快速纯合）后代的快速纯合通过单倍体迅通过单倍体迅速产生纯

44、系。在异花授粉作物中，可用单倍速产生纯系。在异花授粉作物中，可用单倍体产生加倍单倍体（体产生加倍单倍体（DH系），从中筛选纯合系），从中筛选纯合自交系用于杂交制种。由于加速纯合，从而自交系用于杂交制种。由于加速纯合，从而就缩短了育种周期（图）。就缩短了育种周期（图）。母本母本父本父本F1花药培养花药培养F2花粉植株花粉植株加倍加倍品系比较试验品系比较试验选择鉴定选择鉴定区域试验区域试验图图杂交育种与单倍体育种的周期比较杂交育种与单倍体育种的周期比较（2）提高选择效率）提高选择效率如果某一性状受如果某一性状受一对基因控制，在一对基因控制，在AAaaF2中，纯合中，纯合AA个体只有个体只有1/4。

45、如。如F1采用花药或花粉培养，采用花药或花粉培养，产生的后代中产生的后代中AA个体占个体占1/2，比常规杂交，比常规杂交育种提高一倍。育种提高一倍。（3）排除杂种优势对后代选择的干扰）排除杂种优势对后代选择的干扰对于杂交育种来讲，由于低世代很多基因位对于杂交育种来讲，由于低世代很多基因位点尚处于杂合状态，会有不同程度的杂种优点尚处于杂合状态，会有不同程度的杂种优势表现，对个体的选择会造成一定误差。采势表现，对个体的选择会造成一定误差。采用用DH群体进行选择育种，由于各基因位点群体进行选择育种，由于各基因位点在理论上均处于纯合状态，选择到的变异能在理论上均处于纯合状态，选择到的变异能更大程度上代

46、表真实变异。更大程度上代表真实变异。（4）遗传研究的良好材料体系）遗传研究的良好材料体系单倍单倍体是基因互作检测、遗传变异估体是基因互作检测、遗传变异估计、连锁群计、连锁群构建、构建、QTL估计及定位等数量遗传学的良好估计及定位等数量遗传学的良好材料。尤其是近代分子生物学的发展，材料。尤其是近代分子生物学的发展，DH系成为分子标记作图的良好群体，它在一定系成为分子标记作图的良好群体，它在一定程度上成为一种永久程度上成为一种永久BC或或F2群体。群体。（5）突变体的筛选突变体的筛选由于单倍体的各由于单倍体的各基因均处于纯合状态，突变体很容易表现出基因均处于纯合状态，突变体很容易表现出来，从而大大

47、提高了抗性或其它突变体的筛来，从而大大提高了抗性或其它突变体的筛选效率，利用这一体系获得各种突变体的事选效率，利用这一体系获得各种突变体的事例已很多，这里就不一一赘述。例已很多，这里就不一一赘述。2、离体培养条件下的小孢子发育、离体培养条件下的小孢子发育小孢子母细胞经减数分裂形成四分体小孢小孢子母细胞经减数分裂形成四分体小孢子，然后经单核早期、单核靠边期、双核期子，然后经单核早期、单核靠边期、双核期（一个营养核和一个生殖核），最后到达三核（一个营养核和一个生殖核），最后到达三核期而成为成熟花粉粒。在离体培养条件下，花期而成为成熟花粉粒。在离体培养条件下，花粉的正常发育途径受到抑制。粉的正常发育

48、途径受到抑制。3、影响花药培养的因素、影响花药培养的因素（1）供体植株的生长条件）供体植株的生长条件供体植株供体植株的生长条件对培养效果有重要影响，有时只的生长条件对培养效果有重要影响，有时只有在控温、一定光周期和光强的条件下，其有在控温、一定光周期和光强的条件下，其花药才能有反应。环境条件对于不同的植物花药才能有反应。环境条件对于不同的植物种有很大不同，所以没有一个固定的环境控种有很大不同，所以没有一个固定的环境控制模式。制模式。（2）供体植株的年龄供体植株的年龄供体植株对培供体植株对培养效果也有一定影响，一般讲，开花初期植养效果也有一定影响，一般讲，开花初期植株的花蕾易于培养。株的花蕾易于

49、培养。（3）花粉发育时期）花粉发育时期用于培养的花蕾，用于培养的花蕾，其花药内小孢子发育时期对培养效果有较大其花药内小孢子发育时期对培养效果有较大影响，但因物种而异。在烟草中，处于第一影响，但因物种而异。在烟草中，处于第一次有丝分裂期的花粉效果最好，而在禾本科次有丝分裂期的花粉效果最好，而在禾本科和芸苔属中，单核早期最好。和芸苔属中，单核早期最好。（4）花蕾和花药的预处理花蕾和花药的预处理对于有些物种，对于有些物种，培养前对花药和花蕾进行预处理，能显著提高培养培养前对花药和花蕾进行预处理，能显著提高培养效果。如大麦花药，效果。如大麦花药，4处理处理28d，或，或7处理处理14d，能收到最好效果

50、。可对整穗、小穗、甚至分离的，能收到最好效果。可对整穗、小穗、甚至分离的花药施加预处理，只要注意处理期间不要与水接触。花药施加预处理，只要注意处理期间不要与水接触。也有人将花药接种后放在低温下预处理，不同材料也有人将花药接种后放在低温下预处理，不同材料需不同的预处理方式，没有一个固定模式。需不同的预处理方式，没有一个固定模式。（5）培养基）培养基究竟使用固体或液体培究竟使用固体或液体培养基应根据培养材料的要求定。多数情况下，养基应根据培养材料的要求定。多数情况下，MSMS、N N6 6及马铃薯提取液培养基在禾谷类作物及马铃薯提取液培养基在禾谷类作物中用的较多。花药培养时往往需要一定的渗中用的较

51、多。花药培养时往往需要一定的渗透压，有的要求低浓度的蔗糖（透压，有的要求低浓度的蔗糖（2%2%4%4%），有），有的要求高浓度的蔗糖（的要求高浓度的蔗糖（8%8%12%）。）。二细胞结构的成熟花粉往往需低浓度糖，二细胞结构的成熟花粉往往需低浓度糖，而三细胞结构的成熟花粉植物往往需高渗条而三细胞结构的成熟花粉植物往往需高渗条件，如油菜小孢子培养时，糖的浓度可用到件，如油菜小孢子培养时，糖的浓度可用到13%17%。培养基中所添加的维生素和激。培养基中所添加的维生素和激素对培养效果可产生重要影响。对于某些植素对培养效果可产生重要影响。对于某些植物种来讲，添加某种植物的提取物或椰汁可物种来讲，添加某种

52、植物的提取物或椰汁可以改善培养效果。以改善培养效果。（6）培养条件）培养条件多数植物在多数植物在25下培下培养能诱导愈伤组织，可某些植物，尤其是芸养能诱导愈伤组织，可某些植物，尤其是芸苔属，在高温苔属，在高温35下处理几天，然后进入下处理几天，然后进入25培养能收到最好效果。花药培养一般在培养能收到最好效果。花药培养一般在暗处进行，直到愈伤或胚状体形成再转到光暗处进行，直到愈伤或胚状体形成再转到光下培养。此外，接种花药的外植体置向、培下培养。此外，接种花药的外植体置向、培养密度等有时对培养效果也有影响。养密度等有时对培养效果也有影响。4、花粉（小孢子）培养、花粉（小孢子）培养花粉培养是指把花粉

53、从花药中分离出来，以单花粉培养是指把花粉从花药中分离出来，以单个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术。其优点个花粉粒作为外植体进行离体培养的技术。其优点在于花粉已是单倍体细胞，诱发后经愈伤组织或胚在于花粉已是单倍体细胞，诱发后经愈伤组织或胚状体发育成的小植株都是单倍体植株或双单倍体，状体发育成的小植株都是单倍体植株或双单倍体，不含药壁、花丝、药隔等体细胞组织的干扰而形成不含药壁、花丝、药隔等体细胞组织的干扰而形成的体细胞植株，但它的培养难度大。的体细胞植株，但它的培养难度大。5、单倍体诱导中存在的问题、单倍体诱导中存在的问题对于多数植物来讲，能形成有活对于多数植物来讲，能形成有活力胚的花药百分率

54、很低，除此之外，力胚的花药百分率很低，除此之外，还有很多问题存在。还有很多问题存在。通常花药或花粉离体培养时没有生长和发育迹通常花药或花粉离体培养时没有生长和发育迹象，或刚开始生长便导致胚败育；在产生单倍体的象，或刚开始生长便导致胚败育；在产生单倍体的同时产生二倍体或四倍体；培养中我们需要小孢子同时产生二倍体或四倍体；培养中我们需要小孢子分裂，而二倍体组织不分裂，但这种情况往往难以分裂，而二倍体组织不分裂，但这种情况往往难以办到；白化苗难以避免，尤其是在禾本科作物中；办到；白化苗难以避免，尤其是在禾本科作物中；在混倍性的材料中很难分离出单倍体，因为单倍体在混倍性的材料中很难分离出单倍体，因为单

55、倍体细胞的生长很易被生长旺盛的多倍体细胞所掩盖。细胞的生长很易被生长旺盛的多倍体细胞所掩盖。6、单倍体细胞培养与植物育种、单倍体细胞培养与植物育种单倍体是高度不育的，需要进行加倍处理单倍体是高度不育的，需要进行加倍处理才能应用。秋水仙素是常用的染色体加倍药才能应用。秋水仙素是常用的染色体加倍药剂，可以用剂，可以用1%的秋水仙素对正处于对数生的秋水仙素对正处于对数生长期的悬浮细胞进行处理，一般长期的悬浮细胞进行处理，一般24h左右。左右。也可在固体培养基中加适当浓度的秋水仙素。也可在固体培养基中加适当浓度的秋水仙素。花粉植株在培养过程中可以自然加倍，花粉植株在培养过程中可以自然加倍，但频率很低。

56、将单倍体植株的组织或器官用但频率很低。将单倍体植株的组织或器官用作外植体，重新诱导愈伤组织，让培养细胞作外植体，重新诱导愈伤组织，让培养细胞在培养过程中自然加倍也是一种方法。在培养过程中自然加倍也是一种方法。A品种品种B品种品种F1杂交种杂交种小孢子培养或花药培养小孢子培养或花药培养单倍体培养单倍体培养染色体加倍染色体加倍 重组纯合系重组纯合系 选择选择 重组了重组了A A和和B B品种优点的纯系品种优点的纯系 自交、田间测试自交、田间测试 遗传稳定性测试遗传稳定性测试 田间测试田间测试新品系新品系确定遗传基础确定遗传基础 品种品种 亲本亲本-杂交杂交 推广利用推广利用 杂种优势利用杂种优势利

57、用图图 单倍体细胞培养及育种技术单倍体细胞培养及育种技术（三）幼胚培养与远缘杂交育种（三）幼胚培养与远缘杂交育种 植物胚胎培养（植物胚胎培养（embryo cultureembryo culture）是指）是指使胚及具胚器官（如子房、胚珠）在离体无使胚及具胚器官（如子房、胚珠）在离体无菌培养条件下发育成幼苗的技术。植物幼胚菌培养条件下发育成幼苗的技术。植物幼胚和胚珠培养是植物远缘杂交育种的重要辅助和胚珠培养是植物远缘杂交育种的重要辅助手段。手段。（四）种质的长期保存（四）种质的长期保存 细胞培养和茎尖培养再生植株技术的实细胞培养和茎尖培养再生植株技术的实现为离体试管保存种质提供了条件，这种方现

58、为离体试管保存种质提供了条件，这种方法只需要较少的空间就能保存大量的无性系，法只需要较少的空间就能保存大量的无性系，而且保存过程中可避免病虫害的侵袭，在特而且保存过程中可避免病虫害的侵袭，在特定的条件下可以长期保存，需要的时候只需定的条件下可以长期保存，需要的时候只需将材料取出来迅速繁殖即可。将材料取出来迅速繁殖即可。 保存的材料可以是多种类型，依植物材保存的材料可以是多种类型，依植物材料的性质和需要定。材料可以是愈伤组织、料的性质和需要定。材料可以是愈伤组织、茎尖、幼胚、花粉形成的单倍体愈伤组织等。茎尖、幼胚、花粉形成的单倍体愈伤组织等。 保存的方法主要有缓慢生长保存法和保存的方法主要有缓慢

59、生长保存法和超低温保存法。对于生长缓慢的材料，在超低温保存法。对于生长缓慢的材料，在常规培养条件下就能保存很长时间，但大常规培养条件下就能保存很长时间，但大多数植物离体培养时需要频繁继代，需要多数植物离体培养时需要频繁继代，需要通过降低生长速度来延长继代间隔。通过降低生长速度来延长继代间隔。 缓慢生长法主要是基于改变培养环境和缓慢生长法主要是基于改变培养环境和修改培养基来实现对种质资源进行短期和中修改培养基来实现对种质资源进行短期和中期保存。缓慢生长法的保存技术包括降低培期保存。缓慢生长法的保存技术包括降低培养温度、减少氧气含量、将组培材料脱水干养温度、减少氧气含量、将组培材料脱水干燥等。燥等

60、。 超低温保存法可以长期保存植物材料，超低温保存法可以长期保存植物材料，不需要继代，其原理是在超低温情况下，不需要继代，其原理是在超低温情况下，使生物的代谢和衰老过程大大减慢甚至完使生物的代谢和衰老过程大大减慢甚至完全停止。全停止。 超低温通常指低于超低温通常指低于-80-80的低温，保的低温，保存介质或容器有干冰（存介质或容器有干冰（-79-79）、超低温）、超低温冰箱（冰箱（-80150-80150）、液氮（）、液氮（-196-196）和）和液氮蒸汽相（液氮蒸汽相（-140-140）等，其中液氮最常）等，其中液氮最常用。用。 超低温保存与缓慢生长保存法相比，具超低温保存与缓慢生长保存法相比

61、，具有一定的技术复杂性，使用时应根据具体的有一定的技术复杂性，使用时应根据具体的材料和相关文献确定技术方案。材料和相关文献确定技术方案。（五）脱毒及繁殖重要品种或材料（五）脱毒及繁殖重要品种或材料 多数作物，尤其是无性繁殖作物，由于多数作物，尤其是无性繁殖作物，由于病毒或其他病原菌的侵袭，有一个产量和品病毒或其他病原菌的侵袭，有一个产量和品质下降的过程，常常需要对受病毒侵染的材质下降的过程，常常需要对受病毒侵染的材料进行脱毒处理。病毒在植物体内的分布是料进行脱毒处理。病毒在植物体内的分布是不均匀的，在受侵染的植株中，顶端分生组不均匀的，在受侵染的植株中，顶端分生组织一般不带毒，或只携带浓度很低

62、的病毒。织一般不带毒，或只携带浓度很低的病毒。 由于存在这一规律，我们便可利用茎尖培由于存在这一规律，我们便可利用茎尖培养的方法使植物脱去病毒。植物茎尖脱毒在无养的方法使植物脱去病毒。植物茎尖脱毒在无性繁殖作物的提纯复壮中有很重要的应用价值，性繁殖作物的提纯复壮中有很重要的应用价值，如马铃薯、甘薯、果树、多年生花卉等。如马铃薯、甘薯、果树、多年生花卉等。 组织培养在植物快速繁殖中有很好的用组织培养在植物快速繁殖中有很好的用途。大多数果树和观赏植物是高度杂合的，途。大多数果树和观赏植物是高度杂合的，它们的种子后代无法与原品种相同，在这种它们的种子后代无法与原品种相同，在这种情况下，如要保持原种特

63、性，需利用茎尖培情况下，如要保持原种特性，需利用茎尖培养快速繁殖。此外，茎尖培养在保存稀有野养快速繁殖。此外，茎尖培养在保存稀有野生资源、繁殖不育远缘杂种等方面具有优势。生资源、繁殖不育远缘杂种等方面具有优势。 植物材料的快速繁殖主要是通过诱导茎植物材料的快速繁殖主要是通过诱导茎芽形成实现的，可以通过两种途径使茎芽增芽形成实现的，可以通过两种途径使茎芽增殖。一种是通过愈伤组织诱导丛生芽形成，殖。一种是通过愈伤组织诱导丛生芽形成，然后分株培养，便可获得大量遗传上基本一然后分株培养，便可获得大量遗传上基本一致的无性系。致的无性系。 另一种是诱导茎尖或不定芽萌发或形成另一种是诱导茎尖或不定芽萌发或形

64、成丛生芽也可达到快速繁殖的目的。一些腋芽、丛生芽也可达到快速繁殖的目的。一些腋芽、植物器官或节段起源的芽，一般处于休眠状植物器官或节段起源的芽，一般处于休眠状态，通过离体培养可解除休眠而萌发。植物态，通过离体培养可解除休眠而萌发。植物的脱毒与快速繁殖技术很易使某些作物，如的脱毒与快速繁殖技术很易使某些作物，如甘薯、果树、经济林木等形成产业化，创造甘薯、果树、经济林木等形成产业化，创造显著的经济价值。显著的经济价值。（六）人工种子的生产（六）人工种子的生产 人工种子（人工种子（artificial seedsartificial seeds）是指将）是指将细胞培养所产生的体细胞胚或其类似物，经细

65、胞培养所产生的体细胞胚或其类似物，经过有机化合物的包埋而形成的能在适宜条件过有机化合物的包埋而形成的能在适宜条件发芽的类似于天然植物种子的颗粒体。发芽的类似于天然植物种子的颗粒体。它通它通常由三部分组成：体细胞胚、人工胚乳、人常由三部分组成：体细胞胚、人工胚乳、人工种皮。工种皮。 人工种子的研究在农业生产上有重要意人工种子的研究在农业生产上有重要意义，它在固定杂种优势、快速繁殖良种和不义，它在固定杂种优势、快速繁殖良种和不育材料、节约用种、工厂化生产种子方面都育材料、节约用种、工厂化生产种子方面都有潜在价值。对木本植物来说，用人工种子有潜在价值。对木本植物来说，用人工种子可不必等待漫长的有性世

66、代，即可以快速繁可不必等待漫长的有性世代，即可以快速繁殖优良性状的转基因植物推广到生产上去。殖优良性状的转基因植物推广到生产上去。此外，人工种子体积小，便于运输。此外，人工种子体积小，便于运输。三、植物原生质体培养和体细胞杂交三、植物原生质体培养和体细胞杂交 植物原生质体（植物原生质体（protoplastprotoplast）是一个没）是一个没有壁的细胞，由于没有壁及质膜暴露在外界有壁的细胞，由于没有壁及质膜暴露在外界环境下，使原生质体的结构变得很脆弱，在环境下，使原生质体的结构变得很脆弱，在没有一定的渗透剂和稳定剂的情况下，很快没有一定的渗透剂和稳定剂的情况下，很快会破裂。由于上述特点，使

67、得原生质体的操会破裂。由于上述特点，使得原生质体的操作难度较大，可一旦再生了壁就恢复了细胞作难度较大，可一旦再生了壁就恢复了细胞的全能性，具有了同正常细胞一样的特性。的全能性，具有了同正常细胞一样的特性。（一）原生质体的分离（一）原生质体的分离 原生质体分离的最基本原则是保证原原生质体分离的最基本原则是保证原生质体不受伤害及不损害它的再生能力，生质体不受伤害及不损害它的再生能力，其先决条件是要有一个合适的渗透压。其先决条件是要有一个合适的渗透压。1、分离方法、分离方法分离原生质体的方法一般有机械分离分离原生质体的方法一般有机械分离和酶法分离两种。和酶法分离两种。机械法分离是早期采用的分离方法，

68、机械法分离是早期采用的分离方法，先对材料进行质壁分离处理，然后切割，先对材料进行质壁分离处理，然后切割，这一过程中会释放出少量的不受损伤的原这一过程中会释放出少量的不受损伤的原生质体。用这一方法生质体。用这一方法仅能从液泡很大的材仅能从液泡很大的材料中获得原生质体料中获得原生质体，而不能应用于分生细，而不能应用于分生细胞。胞。 酶法分离原生质体是目前常用的方法，酶法分离原生质体是目前常用的方法，可分为一步法和二步法。可分为一步法和二步法。 一步法是将果胶酶（一步法是将果胶酶（pectinasepectinase）和纤维）和纤维素酶（素酶（cellulusecelluluse）等混合处理材料，直

69、接分）等混合处理材料，直接分离获得原生质体。离获得原生质体。 二步法是先用果胶酶处理材料，降解二步法是先用果胶酶处理材料，降解细胞间层使细胞分离，再用纤维素酶水解细胞间层使细胞分离，再用纤维素酶水解胞壁释放原生质体。目前多用一步法。胞壁释放原生质体。目前多用一步法。 2 2、影响原生质体分离的因素、影响原生质体分离的因素（1）材料来源）材料来源 叶肉细胞是常用的材料叶肉细胞是常用的材料，因为叶片很容易获得而且能充分供应，其次因为叶片很容易获得而且能充分供应，其次为愈伤细胞或细胞悬浮培养物。从叶片来源为愈伤细胞或细胞悬浮培养物。从叶片来源的原生质体在遗传上较一致，而培养细胞来的原生质体在遗传上较

70、一致，而培养细胞来源的原生质体则不然，因为培养细胞在培养源的原生质体则不然，因为培养细胞在培养过程中易产生变异。过程中易产生变异。 但由愈伤或悬浮系来源的原生质体，但由愈伤或悬浮系来源的原生质体，可以避免植株生长环境的不良影响，还可可以避免植株生长环境的不良影响，还可以常年供应，易于控制新生细胞的年龄，以常年供应，易于控制新生细胞的年龄，处理时操作简便，无需消毒。此外，从根、处理时操作简便，无需消毒。此外，从根、茎、叶、花、果实、胚芽鞘、子叶、花粉、茎、叶、花、果实、胚芽鞘、子叶、花粉、四分体等均能分离原生质体。四分体等均能分离原生质体。（2）渗透压）渗透压 原生质体分离之前必须原生质体分离之

71、前必须确定一个适合的渗透压。在这种渗透压下，确定一个适合的渗透压。在这种渗透压下，原生质体的分离、纯化过程中都不致使原生原生质体的分离、纯化过程中都不致使原生质体受损伤。质体受损伤。（3）酶）酶 植物细胞壁是一个复杂结构，植物细胞壁是一个复杂结构，由纤维素和半纤维素组成，需要一定的酶由纤维素和半纤维素组成，需要一定的酶组成才能降解它。广泛使用的商品酶制剂组成才能降解它。广泛使用的商品酶制剂可以从很多公司购买。可以从很多公司购买。（4）分离培养基）分离培养基 Ca Ca2+2+对原生质体的产量对原生质体的产量和稳定性有很大影响，它是细胞壁的主要成和稳定性有很大影响，它是细胞壁的主要成分，同时能稳

72、定膜结构。另外，分，同时能稳定膜结构。另外，MgMg2+2+、POPO4 43-3-对对于原生质体活力的保持也有重要作用，所以于原生质体活力的保持也有重要作用，所以分离原生质体的培养基中除酶外，一般含这分离原生质体的培养基中除酶外，一般含这些离子。些离子。（5）培养条件）培养条件 酶处理时的温度和酶处理时的温度和pHpH最重要。最重要。PHPH使用范围为使用范围为4.8-7.24.8-7.2，可是，高，可是，高pHpH（大于（大于6.06.0）一）一般有利于原生质体的生存，可能是高般有利于原生质体的生存，可能是高pHpH降低了细胞降低了细胞壁降解时产生的有害酶活性和存在于分离培养基中壁降解时产

73、生的有害酶活性和存在于分离培养基中的毒性物质的活性。为了防止的毒性物质的活性。为了防止pHpH的变化，常加入的变化，常加入MES2MES2（N-morpholinoN-morpholino）-ethanesulfonic acid-ethanesulfonic acid。这是一种缓冲剂，一般使用量为这是一种缓冲剂，一般使用量为3mM3mM。分离原生质体的培养时间与温度成反比，分离原生质体的培养时间与温度成反比，可是，高温下短时间分离的原生质体不适于可是，高温下短时间分离的原生质体不适于培养，它们易发褐和破裂。常用温度为培养，它们易发褐和破裂。常用温度为23-23-3232。有的材料温度很低，。

74、有的材料温度很低，5-105-10。也有高、。也有高、低温结合使用的。酶处理时一般在暗处培养，低温结合使用的。酶处理时一般在暗处培养，但有些材料在光下有利。培养过程中，间断但有些材料在光下有利。培养过程中，间断低速震荡有利于酶渗透。低速震荡有利于酶渗透。（6）组织前处理）组织前处理 高渗前处理、激素处高渗前处理、激素处理、低温处理、激素与低温结合前处理等对理、低温处理、激素与低温结合前处理等对不同植物原生质体分离可能有较好的效果。不同植物原生质体分离可能有较好的效果。 3 3、原生质体的收集、纯化和活力测定、原生质体的收集、纯化和活力测定原生质体酶解完成后，将其用原生质体酶解完成后，将其用20

75、0200目筛过滤，目筛过滤，滤液再用滤液再用400400目过滤，收集滤液，低速离心，目过滤，收集滤液，低速离心，去上清液。用含有酶解液同样渗透剂的无酶去上清液。用含有酶解液同样渗透剂的无酶CPWCPW液将原生质体悬起，再离心，去上清，反液将原生质体悬起，再离心，去上清，反复几次，便完成原生质体的洗涤工作。复几次，便完成原生质体的洗涤工作。 原生质体的纯化可采用蔗糖悬浮法、原生质体的纯化可采用蔗糖悬浮法、梯度离心法或二相界面法，具体操作方梯度离心法或二相界面法，具体操作方法可参考专业书籍。用法可参考专业书籍。用Evans blueEvans blue或或FDAFDA测定原生质体活力，以确定原生质

76、测定原生质体活力，以确定原生质体的分离效果。体的分离效果。（二）原生质体培养（二）原生质体培养 原生质体培养前必须调到一定密度，一原生质体培养前必须调到一定密度，一般般103-105/ml的密度比较适合原生质体培养。的密度比较适合原生质体培养。原生质体的培养方法各种各样，依作物和材原生质体的培养方法各种各样，依作物和材料来源而异。平板培养、液体浅层培养、悬料来源而异。平板培养、液体浅层培养、悬浮培养、液浮培养、液- -固双层培养、琼脂糖包埋、看护固双层培养、琼脂糖包埋、看护培养等是原生质体培养常用的方法。培养等是原生质体培养常用的方法。 但不管哪种培养方法，在培养过程中，但不管哪种培养方法，在

77、培养过程中，都应根据细胞生长情况不断降低渗透压。都应根据细胞生长情况不断降低渗透压。待肉眼可见的细胞团形成后，便可转移到待肉眼可见的细胞团形成后，便可转移到普通细胞培养基上进行细胞繁殖和分化工普通细胞培养基上进行细胞繁殖和分化工作。作。 影响原生质体培养的因素很多，物理条影响原生质体培养的因素很多，物理条件如密度、光照和温度等都会影响培养效果。件如密度、光照和温度等都会影响培养效果。低于一定密度原生质体不能分裂，一般认为低于一定密度原生质体不能分裂，一般认为大群体的原生质体有利于将培养基中原生质大群体的原生质体有利于将培养基中原生质体在培养过程中释放的有害物质脱毒。体在培养过程中释放的有害物质

78、脱毒。 原生质体培养一般在暗处进行，有原生质体培养一般在暗处进行，有利于壁形成和细胞再生，有的物种一直利于壁形成和细胞再生，有的物种一直在暗处直到形成愈伤组织，有的一周后在暗处直到形成愈伤组织，有的一周后移到光下。移到光下。 原生质体培养一般在原生质体培养一般在22-2522-25进行，高、进行，高、低温都有害。但有的植物要求低温都有害。但有的植物要求27-3027-30，在，在2525时不能形成愈伤组织。时不能形成愈伤组织。 原生质体比细胞需要更复杂的培养条件，原生质体比细胞需要更复杂的培养条件，有时需要在有饲养层细胞的情况下原生质体有时需要在有饲养层细胞的情况下原生质体才能再生。培养基无机

79、营养和有机营养组成才能再生。培养基无机营养和有机营养组成都对培养效果有显著影响。都对培养效果有显著影响。 选择适当的渗透压对于获得大量原生质选择适当的渗透压对于获得大量原生质体并保持其活力均很重要，一般用甘露醇或体并保持其活力均很重要，一般用甘露醇或山梨醇调节渗透压。在培养过程中一般需降山梨醇调节渗透压。在培养过程中一般需降低渗透压以促进分裂。低渗透压以促进分裂。 对于琼脂糖包埋培养，可将其切成小块，对于琼脂糖包埋培养，可将其切成小块，转移到低渗的液体培养基中漂浮培养，液体培转移到低渗的液体培养基中漂浮培养，液体培养则可加入低渗的一定体积的培养基，但一般养则可加入低渗的一定体积的培养基，但一般

80、每一步降低程度不超过每一步降低程度不超过25%25%。现在一个趋势是。现在一个趋势是将蔗糖或葡萄糖单独使用或与甘露醇结合作为将蔗糖或葡萄糖单独使用或与甘露醇结合作为稳定剂，一旦糖被降解，培养基渗透压降低，稳定剂，一旦糖被降解，培养基渗透压降低，利于细胞分裂。利于细胞分裂。 生长素对于培养早期壁的形成是需要的，生长素对于培养早期壁的形成是需要的，最常用的是最常用的是2 2，4-D4-D，有时需要生长素与分裂，有时需要生长素与分裂素结合使用。生长素的使用量一定要小心确素结合使用。生长素的使用量一定要小心确定，因为它很容易使液泡长大或增加新液泡定，因为它很容易使液泡长大或增加新液泡而使细胞分裂。而使

81、细胞分裂。 实验证明，生长素通过调节一些特异实验证明，生长素通过调节一些特异mRNAmRNA的合成而起作用。分裂诱导后，需要的合成而起作用。分裂诱导后，需要转到低生长素的条件下才能促进细胞生长。转到低生长素的条件下才能促进细胞生长。此外，维生素、水解酪蛋白、椰汁等，对此外，维生素、水解酪蛋白、椰汁等，对原生质体的生长有促进作用。在培养过程原生质体的生长有促进作用。在培养过程中也需注意一些氨基酸的使用。中也需注意一些氨基酸的使用。 原生质体形成愈伤团后，便可采用原生质体形成愈伤团后，便可采用常规的愈伤组织培养方法使细胞扩大繁常规的愈伤组织培养方法使细胞扩大繁殖或分化形成植株。殖或分化形成植株。（

82、三）细胞融合（体细胞杂交）（三）细胞融合（体细胞杂交）物种间生殖隔离阻碍了物种间的基因交流，物种间生殖隔离阻碍了物种间的基因交流，从而给作物育种带来很大的局限性。原生质体融从而给作物育种带来很大的局限性。原生质体融合技术是实现基因重组的一条途径，目前利用细合技术是实现基因重组的一条途径，目前利用细胞融合已从很多作物种、属间，甚至科间获得杂胞融合已从很多作物种、属间，甚至科间获得杂种体细胞杂种，创造了一些自然界不存在的植物种体细胞杂种，创造了一些自然界不存在的植物类型，有效地拓宽了植物育种的资源。类型，有效地拓宽了植物育种的资源。1 1、融合方法、融合方法分离的原生质体不带电荷，它们相互排分离的

83、原生质体不带电荷，它们相互排斥，所以一般要在诱发条件下才能发生融合。斥，所以一般要在诱发条件下才能发生融合。异种原生质体首先发生膜接触，然后两个原异种原生质体首先发生膜接触，然后两个原生质体形成细胞质桥，最后两种细胞质将两生质体形成细胞质桥，最后两种细胞质将两个核包围起来而完成融合。常用的融合方法个核包围起来而完成融合。常用的融合方法简单介绍如下：简单介绍如下：（1）NaNO3处理诱发融合处理诱发融合 由由NaNONaNO3 3诱诱导的可重复、控制的离体原生质体融合是由导的可重复、控制的离体原生质体融合是由PowerPower等（等（19701970）报道的。利用这一融合剂，）报道的。利用这一

84、融合剂，CarlsonCarlson等等（19721972）虽然在植物中获得了第一个体细胞杂种，）虽然在植物中获得了第一个体细胞杂种，但这种方法存在的严重缺陷就是融合频率低，而但这种方法存在的严重缺陷就是融合频率低，而且对于来源于叶肉的高度液泡化的原生质体有害。且对于来源于叶肉的高度液泡化的原生质体有害。这种融合的机制一般认为是这种融合的机制一般认为是NaNa+ +造成了膜电位的改造成了膜电位的改变。变。（2）高）高pH高浓度钙离子处理高浓度钙离子处理 烟草烟草叶肉原生质体在高叶肉原生质体在高CaCa2+2+（0.05M CaCl0.05M CaCl2 2）和高）和高pHpH（10.510.5

85、）条件下能很快诱发融合（）条件下能很快诱发融合（3737），但融），但融合频率不很高，高合频率不很高，高pHpH也影响原生质体的存活率，且也影响原生质体的存活率，且易诱发多个原生质体融合。高易诱发多个原生质体融合。高CaCa2+2+高高pHpH诱发融合的诱发融合的机制尚不很清楚，一般认为是改变了膜位及膜的物机制尚不很清楚，一般认为是改变了膜位及膜的物理结构。理结构。 （3）PEG（聚乙二醇）处理（聚乙二醇）处理 PEGPEG诱导不诱导不仅融合频率高，而且使二核融合频率增加且无特异性。仅融合频率高，而且使二核融合频率增加且无特异性。PEGPEG是一个高分子量的多聚体（是一个高分子量的多聚体（15

86、00600015006000），），25%25%50%PEG50%PEG可立刻刺激原生质体引起收缩，随后发生聚集。可立刻刺激原生质体引起收缩，随后发生聚集。PEGPEG诱发融合后应逐步去除。影响原生质体聚集及随诱发融合后应逐步去除。影响原生质体聚集及随后融合的因子很多，如后融合的因子很多，如PEGPEG的分子量及浓度、原生质的分子量及浓度、原生质体的材料来源、分离原生质体时使用的酶制剂、离子体的材料来源、分离原生质体时使用的酶制剂、离子种类和浓度、融合温度等。种类和浓度、融合温度等。 （4）电融合）电融合 当两个原生质体处于接当两个原生质体处于接触状态时，给一个触状态时，给一个512amp51

87、2amp的电流持续的电流持续15s15s，原生质体首先受刺激，然后马上融，原生质体首先受刺激，然后马上融合。应用电融合时，原生质体轻微收缩，表合。应用电融合时，原生质体轻微收缩，表明其膜状态有一个短暂的变化。明其膜状态有一个短暂的变化。电融合包括两个步骤：电融合包括两个步骤： 电泳：在电极的作用下，原生质体泳电泳：在电极的作用下，原生质体泳到一起，建立一个膜接触状态，形成念珠链。到一起，建立一个膜接触状态，形成念珠链。 融合：由于膜的可逆性电激穿，使原融合：由于膜的可逆性电激穿，使原生质体发生融合。生质体发生融合。原生质体融合很受重视，因为它避免了原生质体融合很受重视，因为它避免了化学物质的潜

88、在毒害。融合率与原生质体来化学物质的潜在毒害。融合率与原生质体来源、体积、念珠链的长度、脉冲持续时间及源、体积、念珠链的长度、脉冲持续时间及电压等因素有关。在融合时应注意一个问题，电压等因素有关。在融合时应注意一个问题，即电刺激会造成液泡中一些毒性物质的渗漏，即电刺激会造成液泡中一些毒性物质的渗漏，影响原生质体活力。如果能用一种方法将液影响原生质体活力。如果能用一种方法将液泡分离出来，再诱导融合较好。泡分离出来，再诱导融合较好。2、融合方式、融合方式原生质体融合有两种融合方式，即对称原生质体融合有两种融合方式，即对称融合和非对称融合。这两种融合方式都能产融合和非对称融合。这两种融合方式都能产生

89、三种类型的杂种：生三种类型的杂种：综合了双亲全部遗传物综合了双亲全部遗传物质的对称杂种；质的对称杂种；部分遗传物质发生丢失的非部分遗传物质发生丢失的非对称杂种对称杂种；只具有融合双亲一方核遗传物质只具有融合双亲一方核遗传物质的胞质杂种。的胞质杂种。对称融合即双亲的核质组装在一起的对称融合即双亲的核质组装在一起的融合。融合。 非对称融合指在融合前对一方亲本原非对称融合指在融合前对一方亲本原生质体施加一定的处理，纯化其细胞质，生质体施加一定的处理，纯化其细胞质，再和另一方原生质体融合，从而得到非对再和另一方原生质体融合，从而得到非对称杂种或胞质杂种。称杂种或胞质杂种。对称融合也可获得这两种杂种，因

90、为一对称融合也可获得这两种杂种，因为一方的染色体会发生丢失。在进行非对称融合方的染色体会发生丢失。在进行非对称融合前，需要对供体和受体进行处理。对供体进前，需要对供体和受体进行处理。对供体进行处理的目的主要是造成染色体的断裂和片行处理的目的主要是造成染色体的断裂和片段化，从而使供体染色体进入受体后部分或段化，从而使供体染色体进入受体后部分或全部丢失，达到转移部分遗传物质或只转移全部丢失，达到转移部分遗传物质或只转移胞质基因组的目的。胞质基因组的目的。对供体进行处理的方法有多种：射线对供体进行处理的方法有多种：射线（X X、和紫外线）辐射原生质体；限制性和紫外线）辐射原生质体；限制性内切酶处理原

91、生质体；纺锤体毒素、染色内切酶处理原生质体；纺锤体毒素、染色体浓缩剂处理原生质体，其中射线的作用体浓缩剂处理原生质体，其中射线的作用最好。最好。 为了减少融合后再生后代的筛选工作，为了减少融合后再生后代的筛选工作，研究者利用一些代谢抑制剂处理受体原生质研究者利用一些代谢抑制剂处理受体原生质体以抑制其分裂。常用的抑制剂有碘乙酸体以抑制其分裂。常用的抑制剂有碘乙酸（IAIA）、碘乙酰氨（）、碘乙酰氨（IOAIOA）和罗丹明（）和罗丹明（R-6-R-6-G G）。）。 R-6-G R-6-G抑制线粒体氧化磷酸化，抑制线粒体氧化磷酸化，IAIA、IOAIOA可以抑制线粒体氧化磷酸化或糖酵解过程，可以抑

92、制线粒体氧化磷酸化或糖酵解过程，从而不能为细胞生长和发育提供能量。受从而不能为细胞生长和发育提供能量。受IAIA、R-6-GR-6-G和和IOAIOA处理的细胞和非代谢抑制剂处理处理的细胞和非代谢抑制剂处理的细胞（供体，核钝化，但线粒体正常）发的细胞（供体，核钝化，但线粒体正常）发生融合后，代谢上就会得到互补，从而能正生融合后，代谢上就会得到互补，从而能正常地生长。常地生长。3、杂种细胞的筛选、杂种细胞的筛选原生质体融合后，必须有一个可行的办法分离原生质体融合后，必须有一个可行的办法分离出融合的杂种，如果培养条件只允许杂种细胞生长，出融合的杂种，如果培养条件只允许杂种细胞生长，而不允许亲本细胞

93、生长当然最好。杂种细胞的筛选而不允许亲本细胞生长当然最好。杂种细胞的筛选很重要，因为原生质体密度很高，亲本原生质体的很重要，因为原生质体密度很高，亲本原生质体的生长很快掩盖杂种细胞的生长，除非杂种细胞了具生长很快掩盖杂种细胞的生长，除非杂种细胞了具有生长优势。常用的杂种细胞的筛选体系有如下几有生长优势。常用的杂种细胞的筛选体系有如下几种：种：（1）形态互补）形态互补 利用两种原生质体利用两种原生质体形态色泽上的差异，在融合处理后，分形态色泽上的差异，在融合处理后，分别接种在带有小格的培养皿中，每个小别接种在带有小格的培养皿中，每个小格中约有格中约有2323个原生质体。在显微镜下个原生质体。在显

94、微镜下可以找出异源融合体并标定位置。可以找出异源融合体并标定位置。（2）遗传互补）遗传互补 利用两个白化突变互补利用两个白化突变互补可以进行筛选。单个隐性突变性状（如白化）可可以进行筛选。单个隐性突变性状（如白化）可以与某一形态性状结合起来用于筛选。如以与某一形态性状结合起来用于筛选。如Daucus Daucus carotacarota是一白化突变，是一白化突变，D.capillifoliusD.capillifolius是正常体是正常体但再生率很低，将上述两种原生质体融合后，绿但再生率很低，将上述两种原生质体融合后，绿色愈伤组织多为杂种细胞形成。然后再结合形态色愈伤组织多为杂种细胞形成。然

95、后再结合形态及染色体数目的检查就可进一步证实。及染色体数目的检查就可进一步证实。（3）代谢互补）代谢互补 利用两种营养缺陷型利用两种营养缺陷型或两种抗性突变体的原生质体进行融合，在或两种抗性突变体的原生质体进行融合，在同时缺陷两种物质或同时含有两种有害物质同时缺陷两种物质或同时含有两种有害物质的培养基上筛选杂种细胞，能生长的细胞团的培养基上筛选杂种细胞，能生长的细胞团可以初步认为由杂种细胞形成。可以初步认为由杂种细胞形成。（4）生长互补）生长互补 Carlson Carlson等（等（19721972）发）发现，双亲原生质体的生长需要外源生长激素，现，双亲原生质体的生长需要外源生长激素，而由双

96、亲原生质体融合后形成对生长激素自而由双亲原生质体融合后形成对生长激素自主的杂种细胞，能在无外源生长激素的培养主的杂种细胞，能在无外源生长激素的培养基上生长。用这一特点选出了粉蓝烟草与郎基上生长。用这一特点选出了粉蓝烟草与郎氏烟草的体细胞杂种。氏烟草的体细胞杂种。 4 4、杂种的鉴定、杂种的鉴定通过杂种细胞筛选获得的再生植株不一定通过杂种细胞筛选获得的再生植株不一定是杂种植株，应经过进一步验证才能确定。有是杂种植株，应经过进一步验证才能确定。有多种鉴定杂种方法。根据形态性状判断是最简多种鉴定杂种方法。根据形态性状判断是最简单的方法，杂种植株的叶形通常介于双亲之间，单的方法，杂种植株的叶形通常介于

97、双亲之间，叶面积居中，花器官（花冠长度、颜色、形态叶面积居中，花器官（花冠长度、颜色、形态等）带有双亲性状。等）带有双亲性状。染色体计数是细胞学鉴定体细胞杂种的染色体计数是细胞学鉴定体细胞杂种的基本方法，但杂种染色体数目不一定正好是基本方法，但杂种染色体数目不一定正好是双亲染色体数目之和，常出现混倍体。染色双亲染色体数目之和，常出现混倍体。染色体数目的变化可能来自多细胞融合、培养过体数目的变化可能来自多细胞融合、培养过程中的细胞学变异和核与质基因融合后的不程中的细胞学变异和核与质基因融合后的不亲和。亲和。 常用的生化鉴定方法是同工酶，融合后常用的生化鉴定方法是同工酶，融合后形成的杂种应该表现出

98、双亲的同工酶带型。形成的杂种应该表现出双亲的同工酶带型。分子标记鉴定可以较准确地反映融合是否成分子标记鉴定可以较准确地反映融合是否成功，功，RAPDRAPD、RFLPRFLP、AFLPAFLP是常用的鉴定杂种的是常用的鉴定杂种的分子标记。分子标记。 5 5、细胞融合与作物育种、细胞融合与作物育种利用细胞融合可以克服远缘杂交的不亲利用细胞融合可以克服远缘杂交的不亲和性，创造种间、属间杂种，为作物育种提和性，创造种间、属间杂种，为作物育种提供新材料。供新材料。 但是，细胞融合获得的杂种一般在生产但是，细胞融合获得的杂种一般在生产上难以直接利用，但这一技术可以为作物育上难以直接利用，但这一技术可以为

99、作物育种创造自然界不存在的新资源，对作物育种种创造自然界不存在的新资源，对作物育种种质资源的拓展有十分重要的意义。种质资源的拓展有十分重要的意义。第二节第二节转基因技术与作物育种转基因技术与作物育种作物转基因育种就是根据育种目标，作物转基因育种就是根据育种目标，从供体生物中分离目的基因，经从供体生物中分离目的基因，经DNADNA重重组与遗传转化或直接运载进入受体作物，组与遗传转化或直接运载进入受体作物，经过筛选获得稳定表达的遗传工程体，经过筛选获得稳定表达的遗传工程体，并经过田间试验与大田选择育成转基因并经过田间试验与大田选择育成转基因新品种或种质资源。新品种或种质资源。作物转基因育种涉及作物

100、转基因育种涉及目的基因的分离与改造目的基因的分离与改造、载体的构建及其与目的基因的连接等载体的构建及其与目的基因的连接等DNADNA重组技术；重组技术；通过农杆菌介导、基因枪轰击等方法使重组体进入通过农杆菌介导、基因枪轰击等方法使重组体进入受体细胞或组织以及转化体的筛选、鉴定等遗传转受体细胞或组织以及转化体的筛选、鉴定等遗传转化技术和相配套的组织培养技术化技术和相配套的组织培养技术；获得携带目的基；获得携带目的基因的转基因植株（遗传工程体）；遗传工程体在有因的转基因植株（遗传工程体）；遗传工程体在有控条件下的安全评价以及大田研究直至育成品种。控条件下的安全评价以及大田研究直至育成品种。与常规育

101、种技术相比，转基因育种与常规育种技术相比，转基因育种在技术上较为复杂，要求也很高，但是在技术上较为复杂，要求也很高，但是具有常规育种所不具备的优势。主要体具有常规育种所不具备的优势。主要体现在：现在：转基因育种技术体系的建立转基因育种技术体系的建立使可使可利用的基因资源大大拓宽利用的基因资源大大拓宽。实践表明，。实践表明，从动物、植物、微生物中分离克隆的基从动物、植物、微生物中分离克隆的基因通过转基因的方法可使其在三者之间因通过转基因的方法可使其在三者之间相互转移利用。相互转移利用。转基因育种技术为培育高产、转基因育种技术为培育高产、优质优质、高抗高抗，适应各种不良环境条件适应各种不良环境条件

102、的优良品种的优良品种提供了崭新的育种途径。这既可大大减少提供了崭新的育种途径。这既可大大减少杀虫剂、杀菌剂的使用，有利于环境保护，杀虫剂、杀菌剂的使用，有利于环境保护，也可以提高作物的生产能力、扩大作物品也可以提高作物的生产能力、扩大作物品种的适应性和种植区域。种的适应性和种植区域。利用转基因育种技术利用转基因育种技术可以对植物的目可以对植物的目标性状进行定向变异和定向选择标性状进行定向变异和定向选择，同时随着，同时随着对基因认识的不断深入和转基因技术手段的对基因认识的不断深入和转基因技术手段的完善，对多个基因进行定向操作也将成为可完善，对多个基因进行定向操作也将成为可能，这在常规育种中是难以

103、想象的。能，这在常规育种中是难以想象的。利用转基因技术可以大大提高选择效利用转基因技术可以大大提高选择效率，加快育种进程。此外，通过转基因的方率，加快育种进程。此外，通过转基因的方法，还可将植物作为生物反应器生产药物等法，还可将植物作为生物反应器生产药物等生物制品。正是由于转基因技术育种具有上生物制品。正是由于转基因技术育种具有上述优势，使得转基因技术从发现到如今仅述优势，使得转基因技术从发现到如今仅30多多年的历史就得到了快速的发展。年的历史就得到了快速的发展。一、一、作物的转基因技术作物的转基因技术（一）转基因技术的发展现状（一）转基因技术的发展现状1、国际转基因植物研究与现状、国际转基因

104、植物研究与现状自从自从20世纪世纪70年代重组年代重组DNA技术创建到技术创建到1983年第一株转基因烟草获得以来，至今已年第一株转基因烟草获得以来，至今已有有35个科个科120种植物转基因获得成功。先后种植物转基因获得成功。先后有有30多个国家批准了多个国家批准了4000多例田间试验和多例田间试验和种植了商品化的转基因植物，涉及的植物种种植了商品化的转基因植物，涉及的植物种类有类有40多种。多种。表表世界各国转基因种植面积世界各国转基因种植面积转基因作物种植面积（百万转基因作物种植面积（百万hm2）国家国家200020012006美国美国30.335.7阿根廷阿根廷10.011.8加拿大加拿

105、大3.03.2中国中国0.51.5南非南非0.20.2澳大利亚澳大利亚0.20.2罗马尼亚罗马尼亚0.10.1墨西哥墨西哥0.10.1保加利亚保加利亚0.10.1西班牙西班牙0.10.1德国德国0.10.1法国法国0.1乌拉圭乌拉圭0.10.1总总44.252.690美国国际农业生物基金会发表一份报告说，美国国际农业生物基金会发表一份报告说，2005年全球转基因作物商业栽培面积达年全球转基因作物商业栽培面积达9000万公万公顷，比顷，比2004年增长年增长11%。据统计，自从。据统计，自从1996年年开始转基因作物商业栽培以来，开始转基因作物商业栽培以来，10年间栽培面积扩年间栽培面积扩大了大

106、了50倍以上。倍以上。2005年，法国、葡萄牙、伊朗等年，法国、葡萄牙、伊朗等国加入到栽培转基因作物国家的行列，使得全球转国加入到栽培转基因作物国家的行列，使得全球转基因作物栽培国家达到了基因作物栽培国家达到了21个。从栽培面积上看，个。从栽培面积上看，美国以美国以4980万公顷遥遥领先，其次是阿根廷、巴万公顷遥遥领先，其次是阿根廷、巴西和加拿大。西和加拿大。图图.转基因作物的全球种植面积转基因作物的全球种植面积转基因作物种植国家数量持续增加，从转基因作物种植国家数量持续增加，从1996年年的的6个，个，1998年的年的9个，个，2001年的年的13个，到个，到2003年由于巴西和菲律宾的加入

107、，种植转基因作物的国年由于巴西和菲律宾的加入，种植转基因作物的国家总数达到了家总数达到了18个。其中个。其中11个是发展中国家，个是发展中国家，7个个是发达国家。是发达国家。2003年转基因作物的主要种植国家的年转基因作物的主要种植国家的数目，从数目，从2002年的年的4个增加到了个增加到了6个，种植面积占个，种植面积占了全球转基因作物的了全球转基因作物的99%(占了转基因作物全球的占了转基因作物全球的种植面积的种植面积的99%)；这反映了水平领先的转基因作；这反映了水平领先的转基因作物种植国家的广泛参与，物种植国家的广泛参与，图图.2003年全球转基因作物的种植国家年全球转基因作物的种植国家

108、现在，现在，10个国家种植的转基因作物超过了个国家种植的转基因作物超过了50000公顷。其中，美国种植了公顷。其中，美国种植了4280万公顷（占全万公顷（占全球种植总面积的球种植总面积的63%），其次为阿根廷），其次为阿根廷1390万公万公顷（顷（21%），加拿大），加拿大440万公顷（万公顷（6%），巴西），巴西300万公顷（万公顷（4%），中国），中国280万公顷（万公顷（4%）和南）和南非非40万公顷（万公顷（1%）。在这）。在这6个领先的转基因作物种个领先的转基因作物种植国家里，中国和南非的年增长率最高（植国家里，中国和南非的年增长率最高（33%）（见图）。（见图）。在在2003年，转

109、基因大豆占全球大豆种植面积年，转基因大豆占全球大豆种植面积7600万公顷的万公顷的55%，比，比2002年的年的51%有所提有所提高。转基因棉花占棉花种植面积高。转基因棉花占棉花种植面积3400万公顷的万公顷的21%，比前一年的，比前一年的20%有所提高。有所提高。2003年，转年，转基因欧洲油菜的种植面积占到基因欧洲油菜的种植面积占到16%，比，比2002年年的的12%有所提高。最后，全球玉米的种植面积为有所提高。最后，全球玉米的种植面积为14000万公顷。万公顷。2003年，转基因玉米占到年，转基因玉米占到11%，相当于，相当于1550万公顷，比万公顷，比2002年的年的9%(1240万万

110、公顷公顷)有所提高。有所提高。四种主要转基因作物的全球（常规和转基因作物四种主要转基因作物的全球（常规和转基因作物的）种植总面积为的）种植总面积为27200万公顷；其中万公顷；其中2003年的转年的转基因作物占基因作物占25%，比，比2002年的年的22%有所提高。因有所提高。因此，转基因作物的种植面积第一次占到了这四种作物此，转基因作物的种植面积第一次占到了这四种作物种植总面积的四分之一，即，超过种植总面积的四分之一，即，超过2.5亿公顷。亿公顷。2003年增长最大的是转基因大豆，增加了年增长最大的是转基因大豆，增加了490万公万公顷，相当于顷，相当于13%的年增长率；其次是转基因玉米，的年

111、增长率；其次是转基因玉米，提高了提高了310万公顷，相当于万公顷，相当于25%的年增长率，而其的年增长率，而其2002年的年增长率为年的年增长率为27%。目前所种植的转基因作物主要为目前所种植的转基因作物主要为大豆、玉米和油菜等，其中以转基因大豆、玉米和油菜等，其中以转基因大豆的种植面积最大。大豆的种植面积最大。转基因作物的主要目标集中在培转基因作物的主要目标集中在培育具有抗除草剂特性的农作物优良品育具有抗除草剂特性的农作物优良品种，其次为培育抗虫和抗病毒病新品种，其次为培育抗虫和抗病毒病新品种上。种上。2、我国转基因作物研究与利用概况、我国转基因作物研究与利用概况我国是世界上第一个商品化种植

112、转基因我国是世界上第一个商品化种植转基因作物的国家。自行培育的双价转基因烟草的作物的国家。自行培育的双价转基因烟草的抗病虫性达到抗病虫性达到60%，产量比对照可增加，产量比对照可增加15%，产值可增加，产值可增加20%。据农业部资料，我国已批准进行中试的转据农业部资料，我国已批准进行中试的转基因作物包括水稻、小麦、玉米、番茄、白菜、基因作物包括水稻、小麦、玉米、番茄、白菜、番木瓜、甜瓜、花生、棉花、烟草、广藿香等番木瓜、甜瓜、花生、棉花、烟草、广藿香等作物；主要目标性状是抗虫、抗病、耐盐、抗作物；主要目标性状是抗虫、抗病、耐盐、抗冻、耐储藏和抗衰老等。已批准环境释放的有冻、耐储藏和抗衰老等。已

113、批准环境释放的有水稻、玉米、大豆、马铃薯、番茄、甜椒、线水稻、玉米、大豆、马铃薯、番茄、甜椒、线辣椒、棉花、杨树、烟草等辣椒、棉花、杨树、烟草等植物植物。目前经农业部审查并经全国基因工程安全委员目前经农业部审查并经全国基因工程安全委员会批准商品化生产的作物已有我国自行研制开发的会批准商品化生产的作物已有我国自行研制开发的抗虫转基因棉花（转抗虫转基因棉花（转Bt及及Bt+CpTI双价抗虫棉）、双价抗虫棉）、美国美国Monsanto公司开发的公司开发的Bt抗虫棉，延迟成熟期抗虫棉，延迟成熟期的转基因番茄，抗黄瓜花叶病毒（的转基因番茄，抗黄瓜花叶病毒（CMV）转基因番）转基因番茄，抗茄，抗CMV转基

114、因甜椒。转基因抗虫棉已在生产上转基因甜椒。转基因抗虫棉已在生产上大面积推广。大面积推广。转转BtBt基因抗虫棉对棉铃虫的抗性表现基因抗虫棉对棉铃虫的抗性表现（二）转基因育种的程序（二）转基因育种的程序利用转基因技术进行作物育种的基本过利用转基因技术进行作物育种的基本过程可分为：程可分为：目的基因或目的基因或DNA的获得；的获得；含有目含有目的基因或者的基因或者DNA的重组质粒的构建；的重组质粒的构建；受体材受体材料的选择和再生系统的建立；料的选择和再生系统的建立；转化体的筛选转化体的筛选和鉴定；和鉴定；转基因植株的育种利用转基因植株的育种利用。1、目的基因的获得、目的基因的获得目的基因的获得是

115、利用作物转基因育种目的基因的获得是利用作物转基因育种的第一步。根据获得基因的途径主要可以分的第一步。根据获得基因的途径主要可以分为两大类：根据基因表达的产物为两大类：根据基因表达的产物蛋白进行蛋白进行克隆；从基因组克隆；从基因组DNA或或mRNA序列克隆基序列克隆基因。因。（1）根据基因表达的产物）根据基因表达的产物蛋白进行基蛋白进行基因克隆因克隆根据基因表达的产物进行基因克隆的根据基因表达的产物进行基因克隆的主要步骤如下：首先，分离和纯化控制目的性状的主要步骤如下：首先，分离和纯化控制目的性状的蛋白质或者多肽，并进行氨基酸序列分析；然后，蛋白质或者多肽，并进行氨基酸序列分析；然后，根据所得氨

116、基酸序列推导相应的核苷酸序列；采用根据所得氨基酸序列推导相应的核苷酸序列；采用化学合成的方式合成该基因化学合成的方式合成该基因；最后，通过相应的功；最后，通过相应的功能鉴定来确定所推导的序列是否为目的基因。能鉴定来确定所推导的序列是否为目的基因。利用这种方法人类首次人工合成了胰岛利用这种方法人类首次人工合成了胰岛素基因，通过对表达产物与天然的胰岛素基素基因，通过对表达产物与天然的胰岛素基因产物进行比较得到了证实。虽然在早期采因产物进行比较得到了证实。虽然在早期采用这种方式已经成功地克隆了许多基因，但用这种方式已经成功地克隆了许多基因，但是由于根据基因产物采用化学合成方式克隆是由于根据基因产物采

117、用化学合成方式克隆基因具有很大的局限性，所以目前基因的克基因具有很大的局限性，所以目前基因的克隆主要是采用后一种途径。隆主要是采用后一种途径。（2）从基因组从基因组DNA或或mRNA序列克隆基序列克隆基因因随着分子生物学技术的发展，尤其是随着分子生物学技术的发展，尤其是PCR技技术的问世及其在基因工程中的广泛应用，已经大大地术的问世及其在基因工程中的广泛应用，已经大大地加快了基因克隆的步伐。此外，多种生物基因组序列加快了基因克隆的步伐。此外，多种生物基因组序列计划的相继实施和完成，大规模计划的相继实施和完成，大规模EST数据库的建立，数据库的建立，也使得大规模进行基因克隆成为可能。目前已经发展

118、也使得大规模进行基因克隆成为可能。目前已经发展了多种从基因组序列了多种从基因组序列DNA或者或者mRNA序列获得基因序列获得基因的方法。的方法。2、目的基因重组质粒的构建、目的基因重组质粒的构建通过上述方法克隆得到目的基因只是为通过上述方法克隆得到目的基因只是为利用外源基因提供了基础，要将外源基因转利用外源基因提供了基础，要将外源基因转移到受体植株还必须对目的基因进行体外重移到受体植株还必须对目的基因进行体外重组。组。质粒重组的基本步骤包括：从原核生质粒重组的基本步骤包括：从原核生物中获取物中获取目的基因的载体目的基因的载体并进行改造；利并进行改造；利用限制性内切酶将载体切开，并用连接酶用限制

119、性内切酶将载体切开，并用连接酶把目的基因连接到载体上，获得把目的基因连接到载体上，获得DNA重组重组体体。已经分离的目的基因一般都保存在大肠已经分离的目的基因一般都保存在大肠杆菌内的一类辅助质粒中，常用的有杆菌内的一类辅助质粒中，常用的有pBR322系列、系列、pUC以及以及pBluescriptK+（-）系列等。在进行外源基因转移前还必须）系列等。在进行外源基因转移前还必须将外源基因重组到合适的载体上，具体采用将外源基因重组到合适的载体上，具体采用哪种载体要根据转基因的方法和目的而定。哪种载体要根据转基因的方法和目的而定。3、受体材料的选择、受体材料的选择受体是指用于接受外源受体是指用于接受

120、外源DNA的转化材料的转化材料。能否建立稳定、高效、易于再生的受体系统能否建立稳定、高效、易于再生的受体系统是植物转基因操作的关键技术之一。是植物转基因操作的关键技术之一。良好的植物基因转化受体系统应满足如良好的植物基因转化受体系统应满足如下条件：下条件：高效稳定的再生能力；高效稳定的再生能力；受体材料要有较高的遗传稳定性；受体材料要有较高的遗传稳定性；具有稳定的外植体来源，即用于转具有稳定的外植体来源，即用于转化的受体要易于得到而且可以大量供应，如化的受体要易于得到而且可以大量供应，如胚和其它器官等；胚和其它器官等；对筛选剂敏感，即当转化体筛选培对筛选剂敏感，即当转化体筛选培养基中筛选剂达到

121、一定值时，能够抑制非转养基中筛选剂达到一定值时，能够抑制非转化植株细胞的生长、发育和分化，而转化细化植株细胞的生长、发育和分化，而转化细胞、植株能正常生长、发育和分化形成完整胞、植株能正常生长、发育和分化形成完整的植株。的植株。虽然对植物组织培养的研究已有几十虽然对植物组织培养的研究已有几十年的历史，对于许多重要的农作物已经建年的历史，对于许多重要的农作物已经建立起比较成熟的再生系统，但是一个良好立起比较成熟的再生系统，但是一个良好的基因转化受体系统与现有的组织培养获的基因转化受体系统与现有的组织培养获得再生植株水平之间还有很大的差距。得再生植株水平之间还有很大的差距。目前受体材料系统存在的主

122、要问题是：目前受体材料系统存在的主要问题是：再生率低，基因型依赖性强，再生细胞部位再生率低，基因型依赖性强，再生细胞部位与转化部位不一致等。与转化部位不一致等。目前主要从两个途径利用生殖细胞目前主要从两个途径利用生殖细胞进行基因转化：进行基因转化：一是利用组织培养技术进行小孢子一是利用组织培养技术进行小孢子和卵细胞的单倍体培养、转化受体系统。和卵细胞的单倍体培养、转化受体系统。二是直接利用花粉和卵细胞受精过二是直接利用花粉和卵细胞受精过程进行基因转化，如花粉管导入法，花程进行基因转化，如花粉管导入法，花粉粒浸泡法，子房微针注射法等。由于粉粒浸泡法，子房微针注射法等。由于该受体系统与上述其他受体

123、系统相比有该受体系统与上述其他受体系统相比有许多优点，因此近年来发展很快。许多优点，因此近年来发展很快。4、转基因方法的确定和外源基因的转化、转基因方法的确定和外源基因的转化选择适宜的遗传转化方法是提高遗传转选择适宜的遗传转化方法是提高遗传转化率的重要环节之一。尽管转基因的具体方化率的重要环节之一。尽管转基因的具体方法很多，但是概括起来说主要有两类。第一法很多，但是概括起来说主要有两类。第一类是类是以载体为媒介的遗传转化，也称为间接以载体为媒介的遗传转化，也称为间接转移系统法转移系统法。第二类是。第二类是外源目的的外源目的的DNA的直的直接转化接转化。（1）载体介导转移系统载体介导转移系统载体

124、法是目载体法是目前为止最常见的一类转基因方法。其基本前为止最常见的一类转基因方法。其基本原理是将外源基因重组进入适合的载体系原理是将外源基因重组进入适合的载体系统，通过载体携带将外源基因导入植物细统，通过载体携带将外源基因导入植物细胞并进行整合在核染色体中，并随着核染胞并进行整合在核染色体中，并随着核染色体一起复制和表达。色体一起复制和表达。农杆菌农杆菌Ti质粒（质粒（tumorinducingplasmid）或）或Ri质粒（质粒（rootinducingplasmid）介导法是迄今为止植物基因工程）介导法是迄今为止植物基因工程中应用最多、机理最清楚、最理想的载体转中应用最多、机理最清楚、最理

125、想的载体转移方法。采用载体介导进行基因转移的具体移方法。采用载体介导进行基因转移的具体方法包括：方法包括：叶盘法。叶盘法。叶盘法是双子叶植物较为常叶盘法是双子叶植物较为常用、简单有效的方法。选取健康的无菌苗，用、简单有效的方法。选取健康的无菌苗，用打孔器打出叶圆盘，将带有新鲜伤口的叶用打孔器打出叶圆盘，将带有新鲜伤口的叶圆盘与载有目的基因的农杆菌液进行短期共圆盘与载有目的基因的农杆菌液进行短期共培养，农杆菌通过伤口感染将外源目的基因培养，农杆菌通过伤口感染将外源目的基因导入细胞内并整合到植物基因组中。导入细胞内并整合到植物基因组中。真空渗入法。真空渗入法。将适宜转化的健壮植株倒将适宜转化的健壮

126、植株倒置浸于装有携带外源目的基因的农杆菌渗入培养置浸于装有携带外源目的基因的农杆菌渗入培养基的容器中，经真空处理，造伤，使农杆菌通过基的容器中，经真空处理，造伤，使农杆菌通过伤口感染植株，在农杆菌的介导下，发生遗传转伤口感染植株，在农杆菌的介导下，发生遗传转化。这是一种简便、快速、可靠而且不需要经过化。这是一种简便、快速、可靠而且不需要经过组织培养阶段即可获得大量转化植株的基因转移组织培养阶段即可获得大量转化植株的基因转移方法，具有良好的研究与应用前景。方法，具有良好的研究与应用前景。原生质体共培养法。原生质体共培养法原生质体共培养法。原生质体共培养法是指在原生质培养的早期，将携带外源目的是指

127、在原生质培养的早期，将携带外源目的基因的农杆菌与原生质体共同培养，农杆菌基因的农杆菌与原生质体共同培养，农杆菌的的Ti或或Ri上携带有目的基因的上携带有目的基因的TDNA区段区段就会随着外源信号分子的诱导而导入原生质就会随着外源信号分子的诱导而导入原生质体的核内，并整合到受体基因组上。体的核内，并整合到受体基因组上。（2）外源基因直接导入法外源基因直接导入法外源基因外源基因直接导入技术是一种不需要借助载体介导，直直接导入技术是一种不需要借助载体介导，直接利用理化因素进行外源遗传物质转移的方法，接利用理化因素进行外源遗传物质转移的方法，主要包括化学刺激法、基因枪袭击法等。主要包括化学刺激法、基因

128、枪袭击法等。化学刺激法。化学刺激法是借助聚乙化学刺激法。化学刺激法是借助聚乙二醇（二醇（PEG）或者多聚）或者多聚-L-鸟苷酸（鸟苷酸（PLO）等等细胞融合剂细胞融合剂的作用，使细胞表面电荷发生的作用，使细胞表面电荷发生紊乱，干扰细胞间的识别，使细胞膜之间、紊乱，干扰细胞间的识别，使细胞膜之间、DNA/RNA之间形成分子桥，促使细胞膜间之间形成分子桥，促使细胞膜间的相互融合（接触和粘连）和外源的相互融合（接触和粘连）和外源DNA/RNA进入原生质体。进入原生质体。基因枪袭击法。基因枪袭击法也称为微基因枪袭击法。基因枪袭击法也称为微弹轰击技术弹轰击技术（microprojectilebombar

129、dment）和粒子枪法，其基本原理是和粒子枪法，其基本原理是将外源将外源DNA包裹在微小的钨粉或金属颗粒的包裹在微小的钨粉或金属颗粒的表面表面，然后借助高压动力射入受体细胞或组，然后借助高压动力射入受体细胞或组织，当微粒上的织，当微粒上的DNA进入细胞后将整合到植进入细胞后将整合到植物基因组中并得以表达。物基因组中并得以表达。按照动力来源可将基因枪分为火药动力基因按照动力来源可将基因枪分为火药动力基因枪、高压气体动力基因枪和高压放电动力基因枪。枪、高压气体动力基因枪和高压放电动力基因枪。由于基因枪法的操作对象可以是完整的细胞或组由于基因枪法的操作对象可以是完整的细胞或组织，这就克服了受体材料的

130、限制，而且不必制备织，这就克服了受体材料的限制，而且不必制备原生质体，因此实验步骤简单易行，具有相当广原生质体，因此实验步骤简单易行，具有相当广泛的应用范围，已经成为研究植物细胞转化和创泛的应用范围，已经成为研究植物细胞转化和创造转基因植物的最有效方法之一。造转基因植物的最有效方法之一。到目前为止，利用基因枪法已经在豆到目前为止，利用基因枪法已经在豆类和多数禾本科农作物、果树、花卉和林类和多数禾本科农作物、果树、花卉和林木等植物上获得转基因植株。木等植物上获得转基因植株。高压穿孔法。又称为电击法，是利用高压穿孔法。又称为电击法，是利用高压电流脉冲在细胞质膜上形成微孔，使高压电流脉冲在细胞质膜上

131、形成微孔，使DNA直接通过微孔或者作为微孔闭合时伴直接通过微孔或者作为微孔闭合时伴随发生的膜组分重新进入细胞质并整合到随发生的膜组分重新进入细胞质并整合到宿主细胞中。宿主细胞中。与原生质体融合法相比，通过高压电与原生质体融合法相比，通过高压电穿孔法获得的转化植株外源穿孔法获得的转化植株外源DNA整合拷贝整合拷贝数较低，对受体细胞的选择性不强，但是数较低，对受体细胞的选择性不强，但是要获得对特定的宿主细胞的最佳转化条件要获得对特定的宿主细胞的最佳转化条件（如电场强度、电击时间等）需要大量的（如电场强度、电击时间等）需要大量的前期工作。前期工作。微注射法。微注射法。此法是利用琼脂糖包埋、聚赖此法是

132、利用琼脂糖包埋、聚赖氨酸粘连和微吸管吸附等方式氨酸粘连和微吸管吸附等方式将受体细胞固定将受体细胞固定，然后然后将供体将供体DNA或或RNA直接注射进入受体细胞直接注射进入受体细胞。所用受体一般是原生质体或生殖细胞，对于具有所用受体一般是原生质体或生殖细胞，对于具有较大子房或胚囊的植株则无须进行细胞固定，在较大子房或胚囊的植株则无须进行细胞固定，在田间就可以进行活体操作，被称为田间就可以进行活体操作，被称为“子房注射法子房注射法”或或“花粉管通道法花粉管通道法”。以烟草、苜蓿和玉米原生质体等为受以烟草、苜蓿和玉米原生质体等为受体材料，利用上述方法都获得了成功。此外，体材料，利用上述方法都获得了成

133、功。此外，在玉米、小麦、水稻等多种植物上，也有利在玉米、小麦、水稻等多种植物上，也有利用子房注射法成功地获得转基因植株的报道。用子房注射法成功地获得转基因植株的报道。微注射法的优点是可以进行活体操作，微注射法的优点是可以进行活体操作，不影响植物正常的发育进程。田间子房注射不影响植物正常的发育进程。田间子房注射操作简便、成本低。但只对子房较大的植物操作简便、成本低。但只对子房较大的植物有效，对于种子很小的植物操作要求精确度有效，对于种子很小的植物操作要求精确度高，需要显微操作，转化率也相对较低，而高，需要显微操作，转化率也相对较低，而且且转基因后代容易出现嵌合体转基因后代容易出现嵌合体。其他直接

134、转化方法。随着科技的不断其他直接转化方法。随着科技的不断前进，人们先后又发明了多种直接转化方前进，人们先后又发明了多种直接转化方法，如超声波介导法、脉冲电泳法和离子法，如超声波介导法、脉冲电泳法和离子束介导等方法，但是由于上述方法技术还束介导等方法，但是由于上述方法技术还不成熟、转化率低，有的原理不清楚或者不成熟、转化率低，有的原理不清楚或者所需设备太昂贵，因此在实际中的应用受所需设备太昂贵，因此在实际中的应用受到了限制。到了限制。5、转化体的筛选和鉴定、转化体的筛选和鉴定转化体的筛选与鉴定是农作物转基因转化体的筛选与鉴定是农作物转基因育种中的一个关键问题，贾士荣育种中的一个关键问题，贾士荣1

135、993年年提出了一套转基因植物的标准。对于提出了一套转基因植物的标准。对于转模转模式植物式植物应具有：应具有：应有严格的对照；应有严格的对照；转化当代（转化当代（R0）至少有一种相应的酶活分析）至少有一种相应的酶活分析（如（如GUS，NPT）；）；R1代应有代应有Southern或或Northern杂交的证据；杂交的证据；有性繁殖作物需要标记基因控制的表现性状有性繁殖作物需要标记基因控制的表现性状传递给传递给R1代的证据，无性繁殖作物有繁殖一代稳代的证据，无性繁殖作物有繁殖一代稳定遗传的证据；定遗传的证据；转化系统应能够重复。转化系统应能够重复。对于转目的基因植物：对于转目的基因植物：应有严格

136、的对照；应有严格的对照；应提出转化当代（应提出转化当代（R0代）目的基因整合代）目的基因整合和表达的分子生物学证据（和表达的分子生物学证据（Southern，Northern，Western或者其它方法）；或者其它方法）；R0代需有目的基因控制的表型性状代需有目的基因控制的表型性状（如抗病、抗虫性等）；（如抗病、抗虫性等）；有性繁殖作物需有目的基因控制的表型有性繁殖作物需有目的基因控制的表型性状传递给后代的证据，无性繁殖作物有繁性状传递给后代的证据，无性繁殖作物有繁殖一代稳定遗传的证据。殖一代稳定遗传的证据。对转化体的筛选和鉴定包括两个层次：对转化体的筛选和鉴定包括两个层次：转化体的筛选转化体

137、的筛选外源目的基因在植物受体外源目的基因在植物受体细胞中的转化频率往往是相当低的，在数量庞大的细胞中的转化频率往往是相当低的，在数量庞大的受体细胞群中，通常只有为数不多的一小部分获得受体细胞群中，通常只有为数不多的一小部分获得了外源了外源DNA，而其中目的基因已被整合到核基因组，而其中目的基因已被整合到核基因组并实现表达的转化细胞则更加稀少。为了有效地选并实现表达的转化细胞则更加稀少。为了有效地选择出这些真正的转化细胞，必要使用特异性的选择择出这些真正的转化细胞，必要使用特异性的选择标记基因标记基因（selectablemarkergenes）进行标记。进行标记。常用选择标记基因包括抗生素抗性

138、基因常用选择标记基因包括抗生素抗性基因及除草剂抗性基因两大类，如卡那霉素抗性及除草剂抗性基因两大类，如卡那霉素抗性基因基因NPT和潮霉素抗性基因和潮霉素抗性基因hpt，除草剂，除草剂抗性基因抗性基因bar基因和基因和Glyphosate抗性基因抗性基因epsps等。在实际工作中，是将选择标记基等。在实际工作中，是将选择标记基因与适当因与适当启动子启动子构成嵌合基因并克隆到质粒构成嵌合基因并克隆到质粒载体上，与目的基因同时进行转化。载体上，与目的基因同时进行转化。当标记基因被导入受体细胞之后，就会当标记基因被导入受体细胞之后，就会使转化细胞具有抵抗相应抗生素和除草剂的使转化细胞具有抵抗相应抗生素

139、和除草剂的能力，抑制、杀死非转化细胞，转化细胞则能力，抑制、杀死非转化细胞，转化细胞则能够存活下来。由于目的基因和标记基因同能够存活下来。由于目的基因和标记基因同时整合进入受体细胞的比率相当高，因此在时整合进入受体细胞的比率相当高，因此在具有上述抗性的转化细胞中将有很高比率的具有上述抗性的转化细胞中将有很高比率的转化细胞同时含有上述两类基因。转化细胞同时含有上述两类基因。转化体的鉴定转化体的鉴定通过选择压筛选得通过选择压筛选得到的再生植株只能初步证明标记基因已经整到的再生植株只能初步证明标记基因已经整合进入受体细胞，至于目的基因是否整合、合进入受体细胞，至于目的基因是否整合、表达还一无所知，因

140、此还必须对抗性植株进表达还一无所知，因此还必须对抗性植株进一步检测。根据检测水平的不同可以分为一步检测。根据检测水平的不同可以分为DNA水平、转录水平和翻译水平的鉴定。水平、转录水平和翻译水平的鉴定。6、转化体的安全性评价和育种利用、转化体的安全性评价和育种利用通过上述鉴定证实携带目的基因的转化通过上述鉴定证实携带目的基因的转化体，还必须根据有关转基因产品的管理规定、体，还必须根据有关转基因产品的管理规定、在可控制条件下进行安全性评价和大田育种在可控制条件下进行安全性评价和大田育种利用研究。利用研究。从目前的植物基因工程育种实践来看，利用转从目前的植物基因工程育种实践来看，利用转基因方法获得的

141、转基因植株，常常存在外源基因失基因方法获得的转基因植株，常常存在外源基因失活、纯合致死、花粉致死效应，以及目标性状明确活、纯合致死、花粉致死效应，以及目标性状明确的基因导入植物后由于插入点的原因可能导致其它的基因导入植物后由于插入点的原因可能导致其它性状的变化等现象；有些转基因植株可能会由于组性状的变化等现象；有些转基因植株可能会由于组织培养方面的原因造成结实率降低。织培养方面的原因造成结实率降低。因而，通过转因而，通过转基因方法往往难以直接获得理想的品种（系）基因方法往往难以直接获得理想的品种（系）。一般在获得转化体后，应结合利用一般在获得转化体后，应结合利用杂交、回交、自交等常规转育手段，

142、最杂交、回交、自交等常规转育手段，最终选育综合性状优良的转基因品种。终选育综合性状优良的转基因品种。二、二、转基因作物的遗传特点转基因作物的遗传特点利用转基因技术进行作物品种改良利用转基因技术进行作物品种改良已经成为一种全新的育种途径，通过将已经成为一种全新的育种途径，通过将优良的外源基因导入育种材料，可以取优良的外源基因导入育种材料，可以取得常规育种难以获得的突破性进展。得常规育种难以获得的突破性进展。研究表明，外源目的基因在许多转化体研究表明，外源目的基因在许多转化体中都能够稳定整合、正常表达，表现出经典中都能够稳定整合、正常表达，表现出经典的孟德尔遗传规律。但是，随着转基因应用的孟德尔遗

143、传规律。但是，随着转基因应用实践的增多，越来越多的实验发现，外源基实践的增多，越来越多的实验发现，外源基因在受体中的命运受到一系列生理生化过程因在受体中的命运受到一系列生理生化过程的作用并以复杂的遗传方式表现出来。的作用并以复杂的遗传方式表现出来。这主要是由于外源基因进入宿主细胞后，将会这主要是由于外源基因进入宿主细胞后，将会受到宿主基因组的监控，一般要发生受到宿主基因组的监控，一般要发生DNA片段丢失、片段丢失、重排、异常重组，加之外源基因在宿主基因组内整重排、异常重组，加之外源基因在宿主基因组内整合的随机性和多拷贝的影响，使外源基因在转基因合的随机性和多拷贝的影响，使外源基因在转基因植株后

144、代中的遗传规律变得非常复杂，对其了解还植株后代中的遗传规律变得非常复杂，对其了解还处于初始阶段。因此，研究外源基因在转化体后代处于初始阶段。因此，研究外源基因在转化体后代中的遗传规律是转基因育种研究的重要组成部分，中的遗传规律是转基因育种研究的重要组成部分，也是当前研究的热点之一。也是当前研究的热点之一。从现有研究结果来看，外源基因从现有研究结果来看，外源基因主要是通过同源重组、位点特异性重主要是通过同源重组、位点特异性重组、转座作用和异常重组几种整合方组、转座作用和异常重组几种整合方式进入受体基因组。式进入受体基因组。通过各种途径整合进入植物基因通过各种途径整合进入植物基因组的外源基因中只有

145、很少一部分能够组的外源基因中只有很少一部分能够整合到基因组。而能够稳定遗传的外整合到基因组。而能够稳定遗传的外源基因所占比例更是非常小。源基因所占比例更是非常小。例如，利用转化效率较高的农杆菌对模例如，利用转化效率较高的农杆菌对模式植物拟南芥进行外源基因转移来看，外源式植物拟南芥进行外源基因转移来看，外源基因整合进入基因组的平均比例为基因整合进入基因组的平均比例为30-80%，而能够稳定遗传的转基因植株所占的比例，而能够稳定遗传的转基因植株所占的比例一般不超过一般不超过10%，这主要是由于在转基因后，这主要是由于在转基因后代中大多数外源基因都已经丢失或发生基因代中大多数外源基因都已经丢失或发生

146、基因沉默所导致的。沉默所导致的。在转基因技术出现的初期，人们关在转基因技术出现的初期，人们关心的主要是转化频率，只要用分子生物心的主要是转化频率，只要用分子生物学方法检测到外源基因整合到受体基因学方法检测到外源基因整合到受体基因组中就已经令人满意了。组中就已经令人满意了。随着研究的不断深入，人们不但随着研究的不断深入，人们不但希望得到转化体，更希望外源基因在希望得到转化体，更希望外源基因在受体植物中能够正常表达，从而获得受体植物中能够正常表达，从而获得新的材料。因而外源基因在转化体内新的材料。因而外源基因在转化体内的表现，即能否表达、表达水平如何的表现，即能否表达、表达水平如何就成为人们关注的

147、焦点之一。就成为人们关注的焦点之一。通过对转化植株的检测发现，大通过对转化植株的检测发现，大多数转基因植株能够正常表达，但是多数转基因植株能够正常表达，但是也有少数植株出现非正常情况，其中也有少数植株出现非正常情况，其中最主要的就是转基因植株发生基因沉最主要的就是转基因植株发生基因沉默这一现象。默这一现象。所谓所谓基因沉默是指整合到基因组中的外源基因沉默是指整合到基因组中的外源基因不能正常表达，而是处于一种失活状态基因不能正常表达，而是处于一种失活状态。1990年年Napli等首次在转基因植物中观察到外等首次在转基因植物中观察到外源基因失活现象。他们在进行矮牵牛转苯基乙源基因失活现象。他们在进

148、行矮牵牛转苯基乙烯酮合成酶基因的研究中发现有烯酮合成酶基因的研究中发现有42%的转基因的转基因当代植株产生白色或紫白相间的花朵，即外源当代植株产生白色或紫白相间的花朵，即外源基因与内源基因均被抑制，简称共抑制。基因与内源基因均被抑制，简称共抑制。1994年通过对年通过对30多家从事转基因作物多家从事转基因作物研究和商品化生产公司的调查发现，几乎所研究和商品化生产公司的调查发现，几乎所有调查对象的转基因植株中都存在转基因失有调查对象的转基因植株中都存在转基因失活现象，主要表现为外源基因的表达水平大活现象，主要表现为外源基因的表达水平大幅度降低。各独立转化体之间差异显著。幅度降低。各独立转化体之间

149、差异显著。上述调查结果极大地引起人们的重视，上述调查结果极大地引起人们的重视，因为通过对转基因发生机制的研究，一方面因为通过对转基因发生机制的研究，一方面可以找到克服基因沉默的方法，促进作物基可以找到克服基因沉默的方法，促进作物基因工程商品化，另一方面可以进一步探索作因工程商品化，另一方面可以进一步探索作物调控基因的表达方式和途径。物调控基因的表达方式和途径。虽然目前对转基因作物中基因沉默问虽然目前对转基因作物中基因沉默问题有较深入的研究，但是对控制转基因沉题有较深入的研究，但是对控制转基因沉默机理还相当有限。导致转基因沉默的原默机理还相当有限。导致转基因沉默的原因是十分复杂的，从现有的研究结

150、果来看，因是十分复杂的，从现有的研究结果来看，按照整合方式和整合拷贝数来分主要包括按照整合方式和整合拷贝数来分主要包括顺式失活、反式失活和共抑制三种形式。顺式失活、反式失活和共抑制三种形式。顺式失活是因为顺式失活是因为多拷贝的外源基因连多拷贝的外源基因连在一起，发生甲基化作用而失活在一起，发生甲基化作用而失活；反式失；反式失活是顺式失活的一种复杂形式。活是顺式失活的一种复杂形式。顺式失活的转基因作为一个顺式失活的转基因作为一个“沉默因子沉默因子”而影响染色体上等位或非等位的基因甲基而影响染色体上等位或非等位的基因甲基化，导致基因失活。而沉默因子本身不发生化，导致基因失活。而沉默因子本身不发生变

151、化；共抑制发生在转基因和内源同源基因变化；共抑制发生在转基因和内源同源基因之间或转基因纯合体两个位点之间的相互作之间或转基因纯合体两个位点之间的相互作用从而导致基因沉默。用从而导致基因沉默。在初步阐明外源基因失活机理的基础在初步阐明外源基因失活机理的基础上，人们先后采用了多种方法克服基因沉上，人们先后采用了多种方法克服基因沉默问题，其中最经典的方式有去甲基化、默问题，其中最经典的方式有去甲基化、降低拷贝数、添加增强子以及对外源基因降低拷贝数、添加增强子以及对外源基因的结构进行改造等方法。的结构进行改造等方法。现有的研究结果表明：重复序列是引现有的研究结果表明：重复序列是引起基因沉默的关键。因此

152、，如何降低外源起基因沉默的关键。因此，如何降低外源基因在作物体内整合的拷贝数是解决基因基因在作物体内整合的拷贝数是解决基因沉默的有效方式之一。沉默的有效方式之一。降低外源基因在作物体内整合的拷贝数降低外源基因在作物体内整合的拷贝数可通过两条途径进行：一是在转基因植株后可通过两条途径进行：一是在转基因植株后代中选择单拷贝植株；二是选用外源基因拷代中选择单拷贝植株；二是选用外源基因拷贝数低的转基因方法，例如采用农杆菌介导贝数低的转基因方法，例如采用农杆菌介导的外源基因转移获得的转基因植株中外源基的外源基因转移获得的转基因植株中外源基因的拷贝数比通过基因枪轰击方法获得的转因的拷贝数比通过基因枪轰击方

153、法获得的转基因植株中外源基因的整合数目要低得多。基因植株中外源基因的整合数目要低得多。通过对目的基因进行结构改造也是克通过对目的基因进行结构改造也是克服基因沉默的一种很好的方式，例如国外服基因沉默的一种很好的方式，例如国外有报道称：通过对原始的有报道称：通过对原始的Bt基因进行结构基因进行结构改造，包括去除一些可能影响报道的序列、改造，包括去除一些可能影响报道的序列、增加一些能与核糖体增加一些能与核糖体80S亚基形成二聚体亚基形成二聚体起始复合物的序列，结果发现起始复合物的序列，结果发现Bt基因的表基因的表达可以提高达可以提高10倍以上。倍以上。随着人们对外源基因整合规律、基因随着人们对外源基

154、因整合规律、基因沉默机理研究的深入，相信一定能够找到沉默机理研究的深入，相信一定能够找到解决外源基因表达异常的有效方法。解决外源基因表达异常的有效方法。（三）外源基因在后代中的遗传规律（三）外源基因在后代中的遗传规律转基因植物的基因分离与经典的遗传分转基因植物的基因分离与经典的遗传分离是不同的。在经典遗传理论中遗传分离是离是不同的。在经典遗传理论中遗传分离是统一的，等位基因分离将会导致性状分离，统一的，等位基因分离将会导致性状分离，遗传方式相对简单，主要表现为简单遗传学遗传方式相对简单，主要表现为简单遗传学的遗传规律。通过农杆菌介导转化的拟南芥的遗传规律。通过农杆菌介导转化的拟南芥种子后代群体

155、目的基因的遗传分离结果总结种子后代群体目的基因的遗传分离结果总结于表。于表。表表拟南芥转化群体的遗传分离拟南芥转化群体的遗传分离-分离类型分离类型家系数家系数百分率百分率-1 1个位点的整合（个位点的整合（3131） 81 52 81 522 2个位点的整合个位点的整合 不连锁（不连锁（151151） 32 21 32 21连锁（连锁（3131， 151 151） 9 6 9 63 3个位点的整合个位点的整合 不连锁（不连锁（631631） 9 6 9 64 4个或多个连锁或不连锁的位点（个或多个连锁或不连锁的位点（25512551） 5 3 5 3例外（例外（3131） 20 13 20 1

156、3合计合计156100- 但是通过对转基因植物遗传规律的研但是通过对转基因植物遗传规律的研究发现，外源基因的分离与其所控制性状究发现，外源基因的分离与其所控制性状的分离不一定吻合。实质上，两者的分离的分离不一定吻合。实质上，两者的分离是在不同层次上进行的，即基因本身的分是在不同层次上进行的，即基因本身的分离和由该基因控制的性状的分离。离和由该基因控制的性状的分离。大量转基因遗传研究结果表明，大量转基因遗传研究结果表明，2/3以以上转化植株的外源基因呈现出单基因显性的上转化植株的外源基因呈现出单基因显性的孟德尔式的分离，自交后代表现孟德尔式的分离，自交后代表现3：1分离。分离。与非转化亲本杂交后

157、代表现与非转化亲本杂交后代表现1：1分离规律；分离规律；至少部分表现出两个不连锁的显性基因，在至少部分表现出两个不连锁的显性基因，在自交后代中表现出自交后代中表现出15：1的分离规律，或呈的分离规律，或呈现两对以上显性基因的分离规律。现两对以上显性基因的分离规律。但是显性个体比例显著低于孟德尔比但是显性个体比例显著低于孟德尔比例的现象也普遍存在，这大多数发生在早例的现象也普遍存在，这大多数发生在早期世代，极少数转化体还常常发生复杂的期世代，极少数转化体还常常发生复杂的转基因分离，例如有的转基因当代自交一转基因分离，例如有的转基因当代自交一代符合代符合3：1的分离规律，自交二代却不符的分离规律，

158、自交二代却不符合孟德尔规律。合孟德尔规律。在一些文章中，对转基因无规律分离在一些文章中，对转基因无规律分离的原因作了探讨。可能的原因有：外源基的原因作了探讨。可能的原因有：外源基因的重排或缺失，外源基因导入诱发的隐因的重排或缺失，外源基因导入诱发的隐性致死突变或转基因纯合致死，含转基因性致死突变或转基因纯合致死，含转基因的雄配子致死、非转化体在早代逃避选择的雄配子致死、非转化体在早代逃避选择等。等。进一步研究表明，转基因分离方式的多样性与进一步研究表明，转基因分离方式的多样性与转基因的整合方式和拷贝数有关。多拷贝整合是常转基因的整合方式和拷贝数有关。多拷贝整合是常见的整合方式，在某些整合事件中

159、，转基因的拷贝见的整合方式，在某些整合事件中，转基因的拷贝数达到几十个，它们有的串联整合，有的独立整合，数达到几十个，它们有的串联整合，有的独立整合，有的串联与独立整合共存。这些转基因拷贝在世代有的串联与独立整合共存。这些转基因拷贝在世代传递中的不稳定性和相互位置的改变以及彼此之间传递中的不稳定性和相互位置的改变以及彼此之间直接与（或）间接的互作，增加了外源基因分离与直接与（或）间接的互作，增加了外源基因分离与表达的复杂性。表达的复杂性。一般来说，一般来说，农杆菌介导的遗传转化后代多呈简农杆菌介导的遗传转化后代多呈简单的孟德尔遗传单的孟德尔遗传，而一些直接转化方法如基因枪法，而一些直接转化方法

160、如基因枪法获得的转基因后代分离相对复杂一些。这是因为获得的转基因后代分离相对复杂一些。这是因为Ti质粒在受体染色体组上一般以特异的交换重组方式质粒在受体染色体组上一般以特异的交换重组方式整合整合，整合的位置较固定而且拷贝数较少；，整合的位置较固定而且拷贝数较少；基因枪基因枪法一般为随机整合法一般为随机整合，整合方式和整合位置以及整合，整合方式和整合位置以及整合的拷贝数往往不确定，所以后代的遗传方式也较复的拷贝数往往不确定，所以后代的遗传方式也较复杂。杂。三、三、转基因作物品种的选育转基因作物品种的选育通过转基因技术获得的转化植株很少直通过转基因技术获得的转化植株很少直接作为品种进行推广应用，这

161、是由于各类作接作为品种进行推广应用，这是由于各类作物品种都具有一系列主要育种目标性状，这物品种都具有一系列主要育种目标性状，这些性状又各具有其组成因素及生理生化基础，些性状又各具有其组成因素及生理生化基础，将外源基因导入植株只能赋予该株具有特定将外源基因导入植株只能赋予该株具有特定的目标性状，对于其它目标性状是否符合生的目标性状，对于其它目标性状是否符合生产的需要还不清楚。产的需要还不清楚。虽然可从受体材料的来源上对所获得的虽然可从受体材料的来源上对所获得的转基因植株的性状加以推测，但是由于转基转基因植株的性状加以推测，但是由于转基因目标性状是通过非常规手段方式获得的，因目标性状是通过非常规手

162、段方式获得的，外源基因的插入很有可能对原有基因组的结外源基因的插入很有可能对原有基因组的结构发生破坏，并对宿主基因的表达产生影响，构发生破坏，并对宿主基因的表达产生影响，这势必影响甚至改变该作物品种的原有性状。这势必影响甚至改变该作物品种的原有性状。此外，转基因植株的安全风险性也是一此外，转基因植株的安全风险性也是一个值得考虑的问题。因此，通过转基因发生个值得考虑的问题。因此，通过转基因发生获得的植株还必须通过常规的品种鉴定途径获得的植株还必须通过常规的品种鉴定途径才能用于生产。从目前转基因育种情况来看，才能用于生产。从目前转基因育种情况来看，所获得的转基因植株主要用于为培育新的品所获得的转基

163、因植株主要用于为培育新的品种而创造育种资源。种而创造育种资源。如同传统作物育种一样，对转基因作物如同传统作物育种一样，对转基因作物品种进行选育时也要遵循一定的育种程序，品种进行选育时也要遵循一定的育种程序，同时兼顾转基因育种的特殊性。从目前同时兼顾转基因育种的特殊性。从目前转基转基因育种的过程来看，主要的程序有以下步骤因育种的过程来看，主要的程序有以下步骤：转基因作物育种目标的制定；转基因作物育转基因作物育种目标的制定；转基因作物育种方法的确定及转基因植株的获得；转基因种方法的确定及转基因植株的获得；转基因作物品种的选育等作物品种的选育等。（一）转基因作物育种目标的制定（一）转基因作物育种目标

164、的制定要充分考虑到转基因作物，尤其是外源要充分考虑到转基因作物，尤其是外源目的基因对人类健康和环境安全的影响。由目的基因对人类健康和环境安全的影响。由于转基因作物品种不同于采用常规方法培育于转基因作物品种不同于采用常规方法培育的品种，外源基因的导入是否对人体有害、的品种，外源基因的导入是否对人体有害、转基因作物的种植对环境是否产生负面影响转基因作物的种植对环境是否产生负面影响都是我们制定育种目标时应该充分考虑的。都是我们制定育种目标时应该充分考虑的。（二）转基因方法的确定及转基因植株的获得（二）转基因方法的确定及转基因植株的获得由于不同的转基因方法各有其优缺点，由于不同的转基因方法各有其优缺点

165、，因此在选择具体的方法时应该充分考虑到上因此在选择具体的方法时应该充分考虑到上述情况。例如，农杆菌介导对于转化双子叶述情况。例如，农杆菌介导对于转化双子叶植物十分有效，因此在创造双子叶转基因植植物十分有效，因此在创造双子叶转基因植物时一般优先用这种方法。在前面所述的培物时一般优先用这种方法。在前面所述的培育转基因抗虫棉植株时，多数采用的都是农育转基因抗虫棉植株时，多数采用的都是农杆菌介导方式获得的。杆菌介导方式获得的。受体品种的选择在转基因育种中是十分受体品种的选择在转基因育种中是十分重要的。一般来说，如果转化方法可行，那重要的。一般来说，如果转化方法可行，那么，受体品种首先选择生产上正在大面

166、积推么，受体品种首先选择生产上正在大面积推广或即将在生产上推广的优良品种。用它们广或即将在生产上推广的优良品种。用它们转化而成的转基因植株易于快速地培育出新转化而成的转基因植株易于快速地培育出新品种在生产上推广利用。品种在生产上推广利用。不管通过什么方法，都要对获得的转基不管通过什么方法，都要对获得的转基因植株开展分子与遗传分析，选择单拷贝插因植株开展分子与遗传分析，选择单拷贝插入的转基因植株用于新品种的选育。入的转基因植株用于新品种的选育。在确定具体的转基因方法和候选目的基在确定具体的转基因方法和候选目的基因之后，就可以对按照具体的方法实行外源因之后，就可以对按照具体的方法实行外源目的基因的

167、转移，在进行严格的转基因鉴定目的基因的转移，在进行严格的转基因鉴定之后获得转基因植株直接作为作物的新品种之后获得转基因植株直接作为作物的新品种或者是育种新资源。或者是育种新资源。（三）转基因作物品种的选育（三）转基因作物品种的选育利用遗传转化途径培育的转基因植株从利用遗传转化途径培育的转基因植株从育种角度来看，只是产生的一种种质资源。育种角度来看，只是产生的一种种质资源。要想在生产上加以利用，必须通过育种家的要想在生产上加以利用，必须通过育种家的加工，培育出成型的品种后，才能推广。加工，培育出成型的品种后，才能推广。1、纯系育种、纯系育种所谓转基因作物选择育种是指在现有转所谓转基因作物选择育种

168、是指在现有转基因群体中通过个体选择或混合选择等方式基因群体中通过个体选择或混合选择等方式选优去劣，育成新品种的方法。选优去劣，育成新品种的方法。出现变异的原因出现变异的原因外源基因的导入、外源基因的导入、整合和表达、整合的目的基因的分离、一因整合和表达、整合的目的基因的分离、一因多效、位置效应以及克隆的体细胞无性系变多效、位置效应以及克隆的体细胞无性系变异都会引起变异。此外，还有多种因素可引异都会引起变异。此外，还有多种因素可引起变异，例如：转基因植株在繁殖和种植过起变异，例如：转基因植株在繁殖和种植过程中，由于隔离操作不严格而发生生物学混程中，由于隔离操作不严格而发生生物学混杂、机械混杂。杂

169、、机械混杂。由于环境条件的作用，导致的基因突变；由于环境条件的作用，导致的基因突变；或者由于生态条件差异较大，较易引起的自或者由于生态条件差异较大，较易引起的自然突变等。这些性状各异的转基因植株都是然突变等。这些性状各异的转基因植株都是培育新品种的宝贵资源，但是并非所有的个培育新品种的宝贵资源，但是并非所有的个体都能够符合生产需要的，其中只有极少部体都能够符合生产需要的，其中只有极少部分植株能够直接运用到生产中，因此还必须分植株能够直接运用到生产中，因此还必须结合常规的育种条件进行系统选育。结合常规的育种条件进行系统选育。选择育种的方法选择育种的方法如果转基因植株的如果转基因植株的株型、农艺性

170、状比较整齐一致，仅有整合的株型、农艺性状比较整齐一致，仅有整合的目的基因分离，那么可采用改良混合选择育目的基因分离，那么可采用改良混合选择育种。如果通过农杆菌或花粉管介导的转基因种。如果通过农杆菌或花粉管介导的转基因原始品系的农艺性状、目的基因都有分离，原始品系的农艺性状、目的基因都有分离，那么就应该按严格的选择育种进行新品种的那么就应该按严格的选择育种进行新品种的选育。选育。安徽省种子公司和东至县棉花原种场合作，安徽省种子公司和东至县棉花原种场合作，1996年从江苏省农科院经济作物所引进抗虫棉材料，年从江苏省农科院经济作物所引进抗虫棉材料，对抗虫性、丰产性、农艺性状等进行选育，对抗虫性、丰产

171、性、农艺性状等进行选育，1996年年底选育出底选育出8个品系、个品系、40个株行、个株行、400个单株。对当选个单株。对当选的材料进行海南岛的加代繁殖和抗虫性、丰产性比较，的材料进行海南岛的加代繁殖和抗虫性、丰产性比较，1997年选育出优良品系年选育出优良品系6个参加安徽省区试。同时对个参加安徽省区试。同时对表现突出的皖表现突出的皖5品系进行生产试验以及抗虫性和栽培品系进行生产试验以及抗虫性和栽培等专项试验和大面积示范。等专项试验和大面积示范。区试结果表明：皖区试结果表明：皖5籽棉产量籽棉产量3321.45kg/hm2，比对照泗棉，比对照泗棉3号（常规号（常规治虫）增产治虫）增产11.1%。皮

172、棉产量。皮棉产量1214.55kg/hm2，比对照泗棉，比对照泗棉3号（常规号（常规治虫）减产治虫）减产2.8%，不显著。该品系于，不显著。该品系于1997年通过安徽省农作物品种审定委员会年通过安徽省农作物品种审定委员会审定，命名为国抗棉审定，命名为国抗棉1号。号。对于可以采用无性繁殖的作物来说，通过对于可以采用无性繁殖的作物来说，通过这种方式获得转基因新品种更为有利，因为无这种方式获得转基因新品种更为有利，因为无性繁殖并不需要纯合的基因型，但是表现型却性繁殖并不需要纯合的基因型，但是表现型却是一致的。在进行转基因作物品种选育时可以是一致的。在进行转基因作物品种选育时可以对转基因植株自交后代进

173、行单株选育，再通过对转基因植株自交后代进行单株选育，再通过无性繁殖的方式对符合育种目标要求的单株进无性繁殖的方式对符合育种目标要求的单株进行扩大繁殖，并推广应用到生产上。行扩大繁殖，并推广应用到生产上。2、回交育种、回交育种由于基因型的限制，用农杆菌介导进由于基因型的限制，用农杆菌介导进行遗传转化所用的受体往往是生产上已经行遗传转化所用的受体往往是生产上已经淘汰的品种，因此，获得转基因植株后，淘汰的品种，因此，获得转基因植株后，还必须通过回交的方法将导入的目的基因还必须通过回交的方法将导入的目的基因转入到生产上正在推广的或即将推广的品转入到生产上正在推广的或即将推广的品种中。回交方法见第六章。

174、种中。回交方法见第六章。美国目前生产上大面积栽种的抗虫棉品美国目前生产上大面积栽种的抗虫棉品种种NuCOTN33、NuCOTN35就是通过回交就是通过回交的手段培育出来的。用的手段培育出来的。用DP5415、DP5690（岱字棉公司的品种）为轮回亲本（岱字棉公司的品种）为轮回亲本与与Monsanto公司通过农杆菌介导的方法培公司通过农杆菌介导的方法培育出的珂字棉育出的珂字棉312的转的转Bt抗虫棉为非轮回亲抗虫棉为非轮回亲本，通过回交、最后纯合而培育出来的。本，通过回交、最后纯合而培育出来的。中国农科院棉花研究所通过中棉所中国农科院棉花研究所通过中棉所16与转基因抗虫棉种质系杂交，并以中棉所与

175、转基因抗虫棉种质系杂交，并以中棉所16为轮回亲本进行回交，培育出为轮回亲本进行回交，培育出“中棉所中棉所30”。回交育种过程中，轮回亲本应选当前正回交育种过程中，轮回亲本应选当前正在生产上推广的品种，最好选在区域试验和在生产上推广的品种，最好选在区域试验和生产试验中表现优异、有希望审定、推广的生产试验中表现优异、有希望审定、推广的品种。回交过程中，应注意目的基因的选择，品种。回交过程中，应注意目的基因的选择，避免丢失。避免丢失。3、杂交育种、杂交育种通过转基因品种或品系之间的相互通过转基因品种或品系之间的相互杂交或与常规品种杂交、选择，选育出杂交或与常规品种杂交、选择，选育出转基因新品种的方法

176、。转基因新品种的方法。“中棉所中棉所31”选自中棉所选自中棉所16与转与转Bt基因基因抗虫棉种质系抗虫棉种质系110杂交，经连续加代和系统杂交，经连续加代和系统选育而成的中早熟抗虫棉新品种。选育而成的中早熟抗虫棉新品种。“中棉所中棉所32”则是选自中棉所则是选自中棉所17转转Bt基因抗虫棉种基因抗虫棉种质系杂交后代。质系杂交后代。这一育种方法可在保持抗虫性的基础上，这一育种方法可在保持抗虫性的基础上，将两个或更多个亲本品种的理想基因结合于同将两个或更多个亲本品种的理想基因结合于同一个杂种个体中，以便培育出具有多个亲本的一个杂种个体中，以便培育出具有多个亲本的综合优良性状的新品种。综合优良性状的

177、新品种。杂种后代一般采用系谱法选择。由于基杂种后代一般采用系谱法选择。由于基因分离，杂交育种一般需要时间长。在杂交因分离，杂交育种一般需要时间长。在杂交育种的早期世代，在抗虫性选择的基础上，育种的早期世代，在抗虫性选择的基础上，对纤维品质和农艺性状尤其是加强衣分的选对纤维品质和农艺性状尤其是加强衣分的选择。杂交育种程序见第五章。择。杂交育种程序见第五章。4、杂种品种、杂种品种转基因杂交作物品种的培育与制种与常规转基因杂交作物品种的培育与制种与常规杂种品种的培育与制种方法基本相同，不同杂种品种的培育与制种方法基本相同，不同的是的是所用的亲本中至少有一个是转基因作物所用的亲本中至少有一个是转基因作

178、物品种或品系。品种或品系。具体的杂交组合有以下几种：亲本之一具体的杂交组合有以下几种：亲本之一是转基因作物品种，另一个亲本为常规非转是转基因作物品种，另一个亲本为常规非转基因品种（系）配制而成的杂交种；以不育基因品种（系）配制而成的杂交种；以不育系为母本，具有目标性状的转基因植株为父系为母本，具有目标性状的转基因植株为父本配制杂交组合；父母本均为转基因作物配本配制杂交组合；父母本均为转基因作物配制的杂交组合等。制的杂交组合等。具体采用哪种方式要根据配制成的杂交具体采用哪种方式要根据配制成的杂交种的产量和品质优势表现情况而定，但是最种的产量和品质优势表现情况而定，但是最好双亲均为含有目标性状的转

179、基因材料，好双亲均为含有目标性状的转基因材料，这这样在利用杂交二代时样在利用杂交二代时，目标性状不会出现分，目标性状不会出现分离。离。但是由于转基因作物品种出现的时间较短，但是由于转基因作物品种出现的时间较短，还没有太多的材料可供利用，例如在配制转基还没有太多的材料可供利用，例如在配制转基因抗虫棉杂交种时，初期都采用转基因抗虫棉因抗虫棉杂交种时，初期都采用转基因抗虫棉和常规非转基因品种配制杂交组合。如我国推和常规非转基因品种配制杂交组合。如我国推广种植面积最大的转基因抗虫棉杂交种中棉所广种植面积最大的转基因抗虫棉杂交种中棉所29和南抗和南抗3号就属于这种类型。号就属于这种类型。随着转基因抗虫棉

180、材料的日益丰富，杂随着转基因抗虫棉材料的日益丰富，杂交转基因抗虫棉的配制也向双亲均为转基因交转基因抗虫棉的配制也向双亲均为转基因抗虫棉的组合发展，这是因为配制这种组合抗虫棉的组合发展，这是因为配制这种组合的双亲的遗传背景不同，杂种优势更为明显、的双亲的遗传背景不同，杂种优势更为明显、产量高、品质好，同时又具有很好的抗虫性。产量高、品质好，同时又具有很好的抗虫性。四、转基因作物的生物安全性四、转基因作物的生物安全性由于转基因产品存在一定的风险，如由于转基因产品存在一定的风险，如转基因产转基因产品本身对人类的毒害作用、转基因作物对环境的破品本身对人类的毒害作用、转基因作物对环境的破坏性作用包括转入

181、的外源基因在环境中的扩散、对坏性作用包括转入的外源基因在环境中的扩散、对物种多样性的影响物种多样性的影响等，因此必须从等，因此必须从保障人类健康、保障人类健康、发展农业生产和维护生态平衡与社会安全的基础发展农业生产和维护生态平衡与社会安全的基础出出发，提出一系列具有指导意义的对应策略和行之有发，提出一系列具有指导意义的对应策略和行之有效的具体措施。具体建议如下：效的具体措施。具体建议如下：1、加强转基因产品的安全性研究、加强转基因产品的安全性研究在在研究与开发转基因产品时，必须加强其安全研究与开发转基因产品时，必须加强其安全性防范的长期跟踪研究。性防范的长期跟踪研究。2、建立完善的检测体系与质

182、量审批制、建立完善的检测体系与质量审批制度度为确保转基因产品进、出口的安全性，为确保转基因产品进、出口的安全性，必须建立起一套完善的既符合国际标准又与必须建立起一套完善的既符合国际标准又与我国国情相适应的检测体系，以及严格的质我国国情相适应的检测体系，以及严格的质量标准和审批制度。有关审批机构应该相对量标准和审批制度。有关审批机构应该相对独立于研制与开发商之外，而且也不应该受独立于研制与开发商之外，而且也不应该受到过多的行政干预。到过多的行政干预。3、不断完善相关法规、不断完善相关法规转基因产品安转基因产品安全性法规的建立与执行应该以严格的检测手全性法规的建立与执行应该以严格的检测手段为基准，

183、同时应该培养一批既懂得生物技段为基准，同时应该培养一批既懂得生物技术专业知识、又能驾驭法律的专门人才。术专业知识、又能驾驭法律的专门人才。4、加强宏观调控、加强宏观调控有关决策层应该对有关决策层应该对转基因产品的产业化及市场化速度进行有序转基因产品的产业化及市场化速度进行有序的宏观调控，任何转基因产品的安全性防范的宏观调控，任何转基因产品的安全性防范措施都必须建立在对该项技术的发展进行适措施都必须建立在对该项技术的发展进行适当调控的前提下，否则，在商业利益的驱动当调控的前提下，否则，在商业利益的驱动下只能是防不胜防。下只能是防不胜防。5、加强对公众的宣传和教育、加强对公众的宣传和教育通过多通过

184、多种渠道、多层次的科普宣传教育，培养公众种渠道、多层次的科普宣传教育，培养公众对转基因产品及其安全性问题的客观公正意对转基因产品及其安全性问题的客观公正意识，从而培育对转基因产品具有一定了解、识，从而培育对转基因产品具有一定了解、认识和判断能力的消费者群体。这对于转基认识和判断能力的消费者群体。这对于转基因产品能否获得市场的有力支撑至关重要。因产品能否获得市场的有力支撑至关重要。6、为公众提供良好的咨询服务、为公众提供良好的咨询服务应应该设立足够数量的具有较高权威性的相关该设立足够数量的具有较高权威性的相关咨询机构，从而为那些因缺乏专业知识而咨询机构，从而为那些因缺乏专业知识而难以对某种转基因

185、产品做出选择的消费者难以对某种转基因产品做出选择的消费者提供有效的指导性帮助。提供有效的指导性帮助。7、规范转基因产品市场、规范转基因产品市场必须培育健康、必须培育健康、规范的转基因产品市场。转基因产品的安全性决规范的转基因产品市场。转基因产品的安全性决定其在市场中的发展潜力。因此，有关转基因产定其在市场中的发展潜力。因此，有关转基因产品质量及其安全性的广告宣传，应该具有科学性品质量及其安全性的广告宣传，应该具有科学性和真实性。一旦消费者因广告宣传而受到误导或和真实性。一旦消费者因广告宣传而受到误导或因假冒产品而被欺骗，转基因产品就会因消费者因假冒产品而被欺骗，转基因产品就会因消费者的望而生畏

186、而失去市场。的望而生畏而失去市场。第三节第三节 分子标记辅助选择育种分子标记辅助选择育种传统的育种传统的育种主要是根据主要是根据植株的表现型进植株的表现型进行选择，行选择，而环境条件、基因间互作、基因型而环境条件、基因间互作、基因型与环境互作等多种因素都会影响表型选择效与环境互作等多种因素都会影响表型选择效率。例如抗病性的鉴定就受发病条件、植株率。例如抗病性的鉴定就受发病条件、植株生理状况、评价标准等影响；品质、产量等生理状况、评价标准等影响；品质、产量等数量性状的选择鉴定工作更困难，如何提高数量性状的选择鉴定工作更困难，如何提高选择效率，是育种工作的关键。选择效率，是育种工作的关键。育种者在

187、长期的实践中不断探索运育种者在长期的实践中不断探索运用遗传标记来提高育种的选择效率与育用遗传标记来提高育种的选择效率与育种预见性。遗传标记包括形态学标记、种预见性。遗传标记包括形态学标记、细胞学标记、生化标记与分子标记。细胞学标记、生化标记与分子标记。棉花的芽黄、番茄的叶型、抗棉花的芽黄、番茄的叶型、抗TMV的矮黄标记、水稻的的紫色叶鞘的矮黄标记、水稻的的紫色叶鞘等等形态性状标记形态性状标记，在育种工作中曾得，在育种工作中曾得到一定的应用。到一定的应用。以非整倍体、缺失、倒位、易位等以非整倍体、缺失、倒位、易位等染色体数目、结构变异为基础的染色体数目、结构变异为基础的细胞学细胞学标记标记，在小

188、麦等作物的基因定位、连锁，在小麦等作物的基因定位、连锁图谱构建、染色体工程以及外缘基因鉴图谱构建、染色体工程以及外缘基因鉴定中起到重要的作用，但许多作物难以定中起到重要的作用，但许多作物难以获得这类标记。获得这类标记。生化标记生化标记主要是利用基因的表达产物如主要是利用基因的表达产物如同工酶与贮藏蛋白，在一定程度上可反应基同工酶与贮藏蛋白，在一定程度上可反应基因型的差异，它们在小麦、玉米等作物遗传因型的差异，它们在小麦、玉米等作物遗传育种中有所应用。但是它们受植株发育阶段育种中有所应用。但是它们受植株发育阶段与环境条件及温度、电泳条件影响，难以满与环境条件及温度、电泳条件影响，难以满足遗传育种

189、工作的需要。足遗传育种工作的需要。以以DNA多态性为基础的分子标记多态性为基础的分子标记，目前，目前已在作物遗传图谱构建、重要农艺性状基因已在作物遗传图谱构建、重要农艺性状基因的标记定位、种质资源的遗传多样性分析与的标记定位、种质资源的遗传多样性分析与品种指纹图谱及纯度鉴定等方面得到广泛应品种指纹图谱及纯度鉴定等方面得到广泛应用，尤其是用，尤其是分子标记辅助选择分子标记辅助选择（molecularmarker-assistedselection，MAS）育）育种更受到人们的重视。种更受到人们的重视。一、分子标记的类型和作用原理一、分子标记的类型和作用原理（一）分子标记的类型和特点（一）分子标记

190、的类型和特点按技术特性，分子标记可分为三大按技术特性，分子标记可分为三大类。类。第一类是以分子杂交为基础的第一类是以分子杂交为基础的DNA标记技术，标记技术，主要有限制性片段长度多态主要有限制性片段长度多态性标记（性标记（Restrictionfragmentlengthpolymorphisms，RFLP）。）。第二类是以第二类是以聚合酶链式反应聚合酶链式反应（Polymerasechainreaction，PCR反应）为基础的各种反应）为基础的各种DNA指纹技指纹技术术。PCR是是Mullis等（等（1985）首创的）首创的在模板在模板DNA、引物和、引物和4种脱氧核糖核苷种脱氧核糖核苷酸

191、存在的条件下，依赖于酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的聚合酶的体外酶促反应，合成特异体外酶促反应，合成特异DNA片段的一片段的一种方法。种方法。PCR技术的特异性取决于引物与技术的特异性取决于引物与模板模板DNA的特异结合。的特异结合。PCR反应分反应分变变性性（denaturation）、）、复性复性（annealling）、）、延伸延伸（extension）三步。）三步。变性变性指的是通过加热使指的是通过加热使DNA双螺双螺旋的氢键断裂，双链解离形成单链旋的氢键断裂，双链解离形成单链DNA的过程的过程。复性（又称退火）是指当温度降低复性（又称退火）是指当温度降低时，单链时，单链DNA回复

192、为双链的过程，回复为双链的过程，由于由于模板分子结构较引物复杂得多，而且反模板分子结构较引物复杂得多，而且反应体系中引物应体系中引物DNA大大高于模板大大高于模板DNA，容易使引物和其互补的模板在局部形，容易使引物和其互补的模板在局部形成杂交链。成杂交链。延伸延伸是指在是指在DNA聚合酶和聚合酶和4种脱氧种脱氧核糖核苷三磷酸、底物及核糖核苷三磷酸、底物及Mg2+存在的存在的条件下，在聚合酶催化下进行以引物为条件下，在聚合酶催化下进行以引物为起始点的起始点的53的的DNA延伸（延伸（DNA链的合成）。链的合成）。以上三步为一个循环，每一循环以上三步为一个循环，每一循环的产物可以作为下一个循环的模

193、板，的产物可以作为下一个循环的模板，经经25-30个循环后，介于两个引物之个循环后，介于两个引物之间的特异间的特异DNA片段得到大量的复制，片段得到大量的复制，数量可达数量可达2106-7拷贝。拷贝。按照按照PCR所需引物类型又可分为：所需引物类型又可分为：单引物单引物PCR标记，其多态性来源于单个随机标记，其多态性来源于单个随机引物作用下扩增产物长度或序列的变异，包括引物作用下扩增产物长度或序列的变异，包括随机扩随机扩增多态性增多态性DNA标记标记（RandomamplificationpolymorphismDNA，RAPD）、）、简单重复序列中简单重复序列中间区域标记间区域标记（inte

194、r-simplesequencerepeatspolymorphisms。ISSR）等技术。）等技术。双引物选择性扩增的双引物选择性扩增的PCR标记，标记，主要通过引物主要通过引物3端碱基的变化获得多态端碱基的变化获得多态性，这种标记主要指性，这种标记主要指扩增片段长度多态扩增片段长度多态性标记性标记（Amplifiedfragmentlengthpolymorphisms，AFLP）。）。需要通过克隆、测序来构建特殊双引需要通过克隆、测序来构建特殊双引物的物的PCR标记如标记如简单序列重复标记简单序列重复标记（Simplesequencerepeats，SSR）、）、序列特征化序列特征化扩增

195、区域扩增区域（Sequencecharacterizedamplifiedregion，简称，简称SCAR技术）和序技术）和序标位标位（Sequence-taggedsites，简称，简称STS）等。）等。第三类是一些新型的分子标记第三类是一些新型的分子标记如如单核苷酸多态性单核苷酸多态性（Singlenucleotidepolymorphism，SNP），由基因组核），由基因组核苷酸水平上的变异引起的苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态序列多态性，包括单碱基的转换、颠换以及单碱性，包括单碱基的转换、颠换以及单碱基的插入缺失等。基的插入缺失等。表达序列标签表达序列标签（Expressedseq

196、uencestags，EST）是在）是在cDNA文库中随机挑选克隆，并进行单边测序文库中随机挑选克隆，并进行单边测序（Singlepasssequence）而产生的）而产生的300-500bp的核苷酸片段。的核苷酸片段。分子标记是以分子标记是以DNA多态性为基础，因而多态性为基础，因而具有以下优点具有以下优点：表现稳定，多态性直接以表现稳定，多态性直接以DNA形式表形式表现，无组织器官、发育时期特异性，不受环现，无组织器官、发育时期特异性，不受环境条件、基因互作影响；境条件、基因互作影响；数量多，理论上遍及整个基因组；数量多，理论上遍及整个基因组；多态性高，自然界存在许多等位变异，多态性高，自

197、然界存在许多等位变异，无需专门人为创造特殊遗传材料，这为与重无需专门人为创造特殊遗传材料，这为与重要性状基因紧密连锁标记的筛选创造了条件；要性状基因紧密连锁标记的筛选创造了条件；对目标性状表达无不良影响，与不良对目标性状表达无不良影响，与不良性状无必然连锁；性状无必然连锁；部分标记遗传方式为共显性，可鉴别纯部分标记遗传方式为共显性，可鉴别纯合体与杂合体；合体与杂合体；对于特定探针或引物可引进或根据发表对于特定探针或引物可引进或根据发表的特定序列自行合成，一般实验室均可进行。的特定序列自行合成，一般实验室均可进行。应用于分子标记辅助育种的标记主应用于分子标记辅助育种的标记主要有要有RFLP、RA

198、PD、SSR、AFLP、STS等。它们的遗传、表现特点总结于等。它们的遗传、表现特点总结于表。表。表表主要分子标记产生体系及特点主要分子标记产生体系及特点-比较内容比较内容RFLPRAPDAFLPSSRISSRSCAR STSCAPS-主要原理主要原理限制酶切限制酶切随机随机PCR扩增扩增限制性酶切限制性酶切PCR扩增扩增随机随机PCR扩增扩增特异特异PCR扩增扩增特异特异PCR扩增扩增PCR扩增产物扩增产物southern杂交杂交结合结合PCR扩增扩增 限制性酶切限制性酶切-探针或引探针或引特定序列特定序列9-10bp由核心序列酶切由核心序列酶切特异引物特异引物以以2-、3-、4-RAPD特

199、征带特征带RFLP探针序列探针序列特异引物，特异引物，物来源物来源DNA探针探针随机引物随机引物位点及选择性碱基位点及选择性碱基核苷酸为基元的核苷酸为基元的测序设计的测序设计的Alu-因子、因子、YAC、 组成的特定引物组成的特定引物不同重复次数作为引物不同重复次数作为引物特异引物特异引物Cosmid插入末端插入末端序列设计引物序列设计引物-基因组中丰富度基因组中丰富度中等中等很高很高高高高高高高中等（？）中等（？）中等中等中等（？）中等（？）多态性水平多态性水平中等中等较高较高非常高非常高高高高高 中等中等检测基因组区域检测基因组区域单单/低低整个整个整个整个重复重复重复序列间隔重复序列间隔

200、整个整个单拷贝区单拷贝区整个整个拷贝区拷贝区基因组基因组基因组基因组序列序列的单拷贝区的单拷贝区基因组基因组 基因组基因组-可检测座位数可检测座位数1-41-1020-1001-50-50或更多或更多1 11可靠性可靠性高高中中高高高高高高高高高高高高遗传特性遗传特性共显性共显性显性显性/共显性共显性共显性共显性/显性显性共显性共显性显性显性/共显性共显性共显性共显性显性显性/共显性共显性共显性共显性DNA质量要求质量要求高高5-10g中中10-100g很高很高50-100g中中10-100g中中2-50g中中5-10g高高50-100g需否序列信息需否序列信息否否否否否否需需否否需需需需需需

201、-放射性放射性通常是通常是不是不是通常是通常是不是不是不是不是不是不是不是不是不是不是实际周期实际周期长长短短较长较长短短短短短短短短短短发展成本发展成本高高低低高高高高低低高高高高高高-（二）分子标记的原理和遗传特性（二）分子标记的原理和遗传特性1、RFLP发现最早，目前应用最为广泛的一种分发现最早，目前应用最为广泛的一种分子标记。这一类标记在子标记。这一类标记在20世纪世纪70年代已被发年代已被发现。现。1980年，人类首先将其应用于构建连锁年，人类首先将其应用于构建连锁图。目前，该技术已广泛应用于动植物连锁图。目前，该技术已广泛应用于动植物连锁图的构建、重要农艺性状基因的分子标记。图的构

202、建、重要农艺性状基因的分子标记。RFLP标记的原理标记的原理植物基因组植物基因组DNA上的碱基替换、插入、缺失或重复等，造成上的碱基替换、插入、缺失或重复等，造成某种限制性内切酶（某种限制性内切酶（restrctionenzymes，简称简称RE）酶切位点的增加或丧失是产生限制）酶切位点的增加或丧失是产生限制性片段长度多态性的原因。对每一个性片段长度多态性的原因。对每一个DNA/RE组合而言，所产生的片段是特异性组合而言，所产生的片段是特异性的，它可作为某一的，它可作为某一DNA所特有的所特有的“指纹指纹”。某一生物基因组某一生物基因组DNA经限制性内切酶消化后，经限制性内切酶消化后，能产生数

203、百万条能产生数百万条DNA片段，通过琼脂糖电泳可将这片段，通过琼脂糖电泳可将这些片段按大小顺序分离，然后将他们按原来的顺序些片段按大小顺序分离，然后将他们按原来的顺序和位置移至易于操作的尼龙膜或硝酸纤维素膜上，和位置移至易于操作的尼龙膜或硝酸纤维素膜上，用放射性同位素（如用放射性同位素（如32P）或非放射性物质（如生）或非放射性物质（如生物素、地高辛等）标记的物素、地高辛等）标记的DNA做探针，与膜上的做探针，与膜上的DNA进行杂交（即进行杂交（即Southern杂交）。杂交）。若某一位置上的若某一位置上的DNA酶切片段与探针相酶切片段与探针相似，或者说同源程度较高，则标记好的探针似，或者说同

204、源程度较高，则标记好的探针就结合在这个位置上。放射自显影或酶学检就结合在这个位置上。放射自显影或酶学检测后，则可显示出不同材料对该探针的限制测后，则可显示出不同材料对该探针的限制性片段多态性情况。性片段多态性情况。对于线粒体和叶绿体等相对较小的对于线粒体和叶绿体等相对较小的DNA分子，通过合适的限制性内切酶酶切，分子，通过合适的限制性内切酶酶切，电泳分析后有可能直接检测出电泳分析后有可能直接检测出DNA片段的差片段的差异，就不需要异，就不需要Southern杂交。杂交。RFLP分析的探针，必须是单拷贝或寡拷分析的探针，必须是单拷贝或寡拷贝的，否则，杂交结果不能显示清晰可辨的贝的，否则，杂交结果

205、不能显示清晰可辨的带型，表现为弥散状，不易进行观察分析。带型，表现为弥散状，不易进行观察分析。RFLP探针主要有三种来源，即探针主要有三种来源，即cDNA克隆、克隆、植物基因组克隆（植物基因组克隆（RandomGenome克隆，克隆，简称简称RG克隆）和克隆）和PCR克隆。克隆。RFLP标记的特点标记的特点RFLP标记具有标记具有共显性的特点。共显性（共显性的特点。共显性（co-dominant）标）标记指的是双亲的两个以上分子量不同的多态记指的是双亲的两个以上分子量不同的多态性片段均在性片段均在F1中表现。它已被广泛应用于多中表现。它已被广泛应用于多种生物的遗传分析，特别是构建植物遗传图种生

206、物的遗传分析，特别是构建植物遗传图谱。谱。RFLP标记所需标记所需DNA量大（量大（5-15g），检测步），检测步骤繁琐，需要的仪器、设备较多，周期长，检测少数骤繁琐，需要的仪器、设备较多，周期长，检测少数几个探针时成本较高，用作探针的几个探针时成本较高，用作探针的DNA克隆其制备克隆其制备与存放较麻烦；与存放较麻烦；检测中要利用放射性同位素检测中要利用放射性同位素（通常为（通常为（32P），易造成污染。尽管非放射性物质标记方法），易造成污染。尽管非放射性物质标记方法可用，但可用，但价格高价格高，杂交信号相对较弱，灵敏度也较同，杂交信号相对较弱，灵敏度也较同位素标记低。位素标记低。目前，目前，

207、RFLP标记直接用于育种成本高，标记直接用于育种成本高，人们正致力于将人们正致力于将RFLP标记转化为标记转化为PCR标记，标记，便于育种上利用。便于育种上利用。2 2、RAPDRAPD标记标记RAPD标记的原理标记的原理Williams等等（1990）以）以DNA聚合酶链式反应为基础而提聚合酶链式反应为基础而提出的。所谓出的。所谓RAPD标记是用随机排列的寡聚脱标记是用随机排列的寡聚脱氧核苷酸单链引物（长度为氧核苷酸单链引物（长度为10个核苷酸）通个核苷酸）通过过PCR扩增染色体组中的扩增染色体组中的DNA所获得的长度所获得的长度不同的多态性不同的多态性DNA片段。片段。 RAPD标记同标记

208、同PCR技术，但又有别于常规的技术，但又有别于常规的PCR反应。主要表现在以下反应。主要表现在以下3个方面：个方面：引物。常规的引物。常规的PCR反应所用的是一对引物，反应所用的是一对引物，长度通常为长度通常为20bp（碱基对）左右；（碱基对）左右；RAPD所用的引所用的引物为一个，长度仅物为一个，长度仅10bp。反应条件。常规的反应条件。常规的PCR复性温度较高，一般复性温度较高，一般为为55-60，而，而RAPD的复性温度仅为的复性温度仅为36左右。左右。扩增产物。常规的扩增产物。常规的PCR扩增产物为特异扩增，扩增产物为特异扩增，而而RAPD产物为随机扩增。产物为随机扩增。这样，这样，R

209、APD反应在最初反应周期中，由反应在最初反应周期中，由于短的随机单引物，低的退火温度，一方面于短的随机单引物，低的退火温度，一方面保证了核苷酸引物与模板的稳定配对，另一保证了核苷酸引物与模板的稳定配对，另一方面因引物中碱基的随机排列而又允许适当方面因引物中碱基的随机排列而又允许适当的错配，从而扩大引物在基因组的错配，从而扩大引物在基因组DNA中配对中配对的随机性，提高了基因组的随机性，提高了基因组DNA分析的效率。分析的效率。原理上与原理上与RAPD相似的还有相似的还有AP-PCR（Arbitrarilyprimedpolymeraechainreaction）。AP-PCR指在指在PCR反应

210、中使用的引物长度与一般反应中使用的引物长度与一般PCR反应中的引物反应中的引物相当，但在反应开始阶段退火温度较低，允许大量配相当，但在反应开始阶段退火温度较低，允许大量配错，因此可引发随机的扩增。一般在错，因此可引发随机的扩增。一般在AP-PCR反应中反应中应用放射性标记，其产物在聚丙烯酰胺凝胶上分离，应用放射性标记，其产物在聚丙烯酰胺凝胶上分离，然后通过放射自显影，检测其多态性然后通过放射自显影，检测其多态性。RAPD标记的特点标记的特点如果基因组在特定引物如果基因组在特定引物结合区域发生结合区域发生DNA片段插入、缺失或碱基突变，就片段插入、缺失或碱基突变，就可能导致特定引物结合点分布发生

211、相应变化，导致可能导致特定引物结合点分布发生相应变化，导致PCR产物增加、缺少或分子量大小的变化。若产物增加、缺少或分子量大小的变化。若PCR产物增加或缺少，则产生显性的产物增加或缺少，则产生显性的RAPD标记；若标记；若PCR产物发生分子量变化则产生共显性的产物发生分子量变化则产生共显性的RAPD标标记，通过电泳分析即可检测出基因组记，通过电泳分析即可检测出基因组DNA在这些区在这些区域的多态性。域的多态性。RAPD标记一般表现为显性遗传，极少标记一般表现为显性遗传，极少数表现为共显性遗传。显性标记指的是数表现为共显性遗传。显性标记指的是F1的的多态性片段与亲本之一完全一样，这样在杂多态性片

212、段与亲本之一完全一样，这样在杂交组合后代中扩增产物的记录可记为交组合后代中扩增产物的记录可记为“有有/无无”，即把每一随机扩增多态性片段作为分子，即把每一随机扩增多态性片段作为分子图谱的一个位点。图谱的一个位点。RAPD引物长度一般为引物长度一般为10个碱基，个碱基，人工人工合成成本低，合成成本低，一套引物可用于不同作物，建一套引物可用于不同作物，建立一套不同作物标准指纹图谱。立一套不同作物标准指纹图谱。RAPD可以可以方便用于种质资源指纹档案建立，种内遗传方便用于种质资源指纹档案建立，种内遗传多样性分析和品种纯度鉴定。因此多样性分析和品种纯度鉴定。因此RAPD也也是一种潜力很大的分子标记。是

213、一种潜力很大的分子标记。由于使用由于使用DNA扩增仪，扩增仪，操作自动化程度高，操作自动化程度高，分析量大分析量大，且，且免去了免去了RFLP中探针制备、同位素中探针制备、同位素标记、标记、Southern印迹等步骤，分析速度很快。印迹等步骤，分析速度很快。RAPD分析所需分析所需DNA样本量少（一般样本量少（一般5-10ng），对），对DNA质量要求较质量要求较RFLP低低。同时，。同时，RAPD标记还可转化为标记还可转化为RFLP探针，探针，SCAR及及STS等表现为共显性和显性的分子标记。等表现为共显性和显性的分子标记。RAPD最大缺点是重复性较差最大缺点是重复性较差。RAPD标记的实验

214、条件摸索和引物的选择是十分关标记的实验条件摸索和引物的选择是十分关键而艰巨的工作。为此研究人员应对不同物键而艰巨的工作。为此研究人员应对不同物种做大量的探索工作，以确定每一物种的最种做大量的探索工作，以确定每一物种的最佳反应程序包括模板佳反应程序包括模板DNA、引物、引物、Mg2+浓浓度等。只要实验条件标准化，可以提高度等。只要实验条件标准化，可以提高RAPD标记的再现性。标记的再现性。SCAR（Sequencecharacterizedamplifiedregion）标记标记在在RAPD技术技术的基础上，的基础上，1993年，年，Paran等提出了一种将等提出了一种将RAPD标记转化成特异序

215、列扩增区域标记，标记转化成特异序列扩增区域标记，即即SCAR标记。标记。它的基本原理是：目标它的基本原理是：目标DNA经经RAPD分析后，分析后，将将RAPD多态片段克隆多态片段克隆对克隆片段两端测序对克隆片段两端测序根据根据测序结果设计长为测序结果设计长为18-24bp的引物，一般引物前的引物，一般引物前10个碱基应包括原来的个碱基应包括原来的RAPD扩增所用的引物。多态性扩增所用的引物。多态性片段克隆之前首先应从凝胶上回收该片段。由于片段克隆之前首先应从凝胶上回收该片段。由于Taq酶可使酶可使PCR产物产物3末端带上末端带上A尾巴，人工设计的尾巴，人工设计的克隆载体克隆载体5末端有一个突出

216、的末端有一个突出的T碱基。碱基。这样可使这样可使PCR产物高效地克隆到载体上。产物高效地克隆到载体上。将连接产物转化大肠杆菌，涂平板，挑选重将连接产物转化大肠杆菌，涂平板，挑选重组克隆，测序分析、设计引物、组克隆，测序分析、设计引物、PCR扩增，扩增，检测是否还能扩增出原来的多态性条带。这检测是否还能扩增出原来的多态性条带。这种转化成功的标记就称为种转化成功的标记就称为SCAR标记。由于标记。由于SCAR标记所用的引物长，特异性扩增重复性标记所用的引物长，特异性扩增重复性好，可有效地用于分子育种。好，可有效地用于分子育种。3、AFLP它是荷兰它是荷兰Keygene公司科学家公司科学家Marc和

217、和Pieter1993年创造发明的一种年创造发明的一种DNA分子标记。该分子标记。该技术是对限制性核酸内切酶片段的选择性扩增，又技术是对限制性核酸内切酶片段的选择性扩增，又称基于称基于PCR的的RFLP。鉴于。鉴于AFLP标记的多态性强，标记的多态性强，一次可检测到一次可检测到100-150个扩增产物，因而非常适合个扩增产物，因而非常适合绘制品种指纹图谱及遗传多样性的研究。绘制品种指纹图谱及遗传多样性的研究。、AFLP标标记记的的原原理理首首先先对对基基因因组组的的DNA进进行行双双酶酶切切，其其中中一一种种为为酶酶切切频频率率较较高高的的限限制制性性内内切切酶酶（frequentcutter

218、），另另一种为酶切频率较低的酶（一种为酶切频率较低的酶（rarecutter）。）。用用酶酶切切频频率率较较高高的的限限制制性性内内切切酶酶消消化化基基因因组组DNA是是为为了了产产生生易易与与扩扩增增的的、而而且且可可在在任任何何测测序序胶胶上上能能较较好好分分离离出出大大小小合合适适的的短短DNA片片段段；用用后后者者消消化化基基因因组组DNA是是限限制制用用于于扩扩增增的的模模板板DNA片片段段的的数数量量。AFLP扩扩增增数数量量是是由由酶酶切切频频率率较较低低的的限限制制性性内内切切酶在基因组中的酶切位点数量决定的。酶在基因组中的酶切位点数量决定的。将将酶酶切切片片段段和和含含有有与

219、与其其粘粘性性末末端端相相同同的的人人工工接接头头连连接接，连连接接后后的的接接头头序序列列及及临临近近内内切切酶酶识识别别位位点点就就作作为为以以后后PCR反反应应的的引引物物结结合合位位点点，通通过过选选择择在在末末端端上上分分别别添添加加1-3个个选选择择性性碱碱基基的的不不同同引引物物，选选择择性性地地识识别别具具有有特特异异配配对对顺顺序序的的酶酶切切片片段段与与之之结结合合，从从而而实实现现特特异异扩扩增增，最最后后用用变变性性聚聚丙丙烯烯酰酰胺胺凝凝胶胶电电泳泳分分离离扩扩增增产产物物。AFLP分分析析的的基基本本步步骤骤可可概括为：概括为：将基因组将基因组DNA同时用同时用2种

220、限制性核酸内种限制性核酸内切酶进行双酶切后，形成分子量大小不等的切酶进行双酶切后，形成分子量大小不等的随机限制性片段，在这些随机限制性片段，在这些DNA片段两端连接片段两端连接上特定的寡核苷酸接头（上特定的寡核苷酸接头（oligonucleotideadapters）；）；通过接头序列和通过接头序列和PCR引物引物3末端末端的识别，对限制性片段进行选择扩增。的识别，对限制性片段进行选择扩增。一般一般PCR引物用同位素引物用同位素32P或或33P标记；标记；聚丙烯酰胺凝胶电泳分离特异扩增限制聚丙烯酰胺凝胶电泳分离特异扩增限制性片段；性片段；将电泳后的凝胶转移吸附到滤纸上，将电泳后的凝胶转移吸附到

221、滤纸上，经干胶仪进行干胶处理；经干胶仪进行干胶处理；在在X光片上感光，数日后冲洗胶光片上感光，数日后冲洗胶片并进行结果分析。片并进行结果分析。为了避免为了避免AFLP分析中的同位素操作，分析中的同位素操作，目前已发展了目前已发展了AFLP荧光标记、银染等新的荧光标记、银染等新的检测扩增产物的手段。检测扩增产物的手段。AFLP标记的特点标记的特点AFLP技术结合了技术结合了RFLP稳定性和稳定性和PCR技术高效性的优点，不需技术高效性的优点，不需要预先知道要预先知道DNA序列的信息，因而可以用于序列的信息，因而可以用于任何动植物的基因组研究。任何动植物的基因组研究。AFLP多态性远远超过其它分子

222、标记，利多态性远远超过其它分子标记，利用放射性同位素在变性的聚丙烯酰胺凝胶上用放射性同位素在变性的聚丙烯酰胺凝胶上电泳可检测到电泳可检测到50-100条条AFLP扩增产物，一扩增产物，一次次PCR反应可以同时检测多个遗传位点，被反应可以同时检测多个遗传位点，被认为是指纹图谱技术中多态性最丰富的一项认为是指纹图谱技术中多态性最丰富的一项技术。技术。AFLP标记具有共显性表达、无复等位效标记具有共显性表达、无复等位效应等优点，表现孟德尔方式遗传。应等优点，表现孟德尔方式遗传。该技术受专利保护，目前用于分析的该技术受专利保护，目前用于分析的试试剂盒价格较贵，分析成本高，对剂盒价格较贵，分析成本高，对

223、DNA的纯度的纯度及内切酶质量要求也比较高及内切酶质量要求也比较高，这是它的不足，这是它的不足之处。之处。4、SSR1987年年Nakamura发现生物基因组内有一种发现生物基因组内有一种短短的重复次数不同的核心序列的重复次数不同的核心序列，它们在生物体内多态，它们在生物体内多态性水平极高，一般称为性水平极高，一般称为可变数目串联重复序列可变数目串联重复序列，简，简称称VNTR（variablenumbertandemrepeat）。）。VNTR标记包括小卫星（标记包括小卫星（minisatellites）和微卫星）和微卫星（microsatellites）标记两种。）标记两种。微卫星标记即微

224、卫星标记即SSR标记，是一类由标记，是一类由1-6个碱基个碱基组成的基序（组成的基序（motif）串联重复而成的）串联重复而成的DNA序列，序列，其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置。其长度一般较短，广泛分布于基因组的不同位置。如（如（CA）n，（，（AT）n，（，（GGC）n、（GATA）n等重复，其中等重复，其中n代表重复次数，其大代表重复次数，其大小在小在10-60之间。这类序列的重复长度具有高度之间。这类序列的重复长度具有高度变异性。变异性。对对SSR的研究最早始于动物基因组，的研究最早始于动物基因组，特别是人类和哺乳动物基因组的研究。目特别是人类和哺乳动物基因组的研究。目前植物

225、前植物SSR研究也非常活跃。研究也非常活跃。根据基因数据库检索及基因文库杂交筛选，已根据基因数据库检索及基因文库杂交筛选，已明确在植物核基因组中，各种明确在植物核基因组中，各种SSR数量从大到小依数量从大到小依次为：（次为：（AT）n、An、Tn、（、（AG）n、（、（CT）n、（AAT）n、（、（ATT）n、（、（GTT）n、（、（AGC）n、（GCT）n、（、（AAG）n、（、（CTT）n、（、（AATT）n、（TTAA）n、（、（AAAT）n、（、（ATTT）n、（AC）n、（、（GT）n等。等。SSR标记的原理标记的原理尽管微卫星尽管微卫星DNA分分布于整个基因组的不同位置上，但其两端

226、的布于整个基因组的不同位置上，但其两端的序列多是相对保守的单拷贝序列。根据微卫序列多是相对保守的单拷贝序列。根据微卫星星DNA两端的单拷贝序列设计一对特异引物，两端的单拷贝序列设计一对特异引物，利用利用PCR技术，扩增每个位点的微卫星技术，扩增每个位点的微卫星DNA序列，通过电泳分析核心序列的长度多态性。序列，通过电泳分析核心序列的长度多态性。一般地，同一类微卫星一般地，同一类微卫星DNA可分布于整可分布于整个基因组的不同位置上，通过其个基因组的不同位置上，通过其重复次数的重复次数的不同以及重叠程度的不完全而造成每个座位不同以及重叠程度的不完全而造成每个座位的多态性的多态性。SSR标记多态性丰

227、富，重复性好，标记多态性丰富，重复性好，其标记呈共显性，分散分布于基因组中。其标记呈共显性，分散分布于基因组中。建立建立SSR标记必须克隆足够数量的标记必须克隆足够数量的SSR并进行测序，设计相应的并进行测序，设计相应的PCR引物。其一般引物。其一般程序如下：程序如下：建立基因组建立基因组DNA的质粒文库；的质粒文库；根据欲得到的根据欲得到的SSR类型设计并合成寡类型设计并合成寡聚核苷酸探针，通过菌落杂交筛选所需重组聚核苷酸探针，通过菌落杂交筛选所需重组克隆。如欲得到（克隆。如欲得到（AT）n/（TA）nSSR，则可合成则可合成G（AT）n作探针，通过菌落原位作探针，通过菌落原位杂交从文库中筛

228、选阳性克隆；杂交从文库中筛选阳性克隆；对阳性克隆对阳性克隆DNA插入序列测序；插入序列测序；根据根据SSR两侧序列设计并合成引物；两侧序列设计并合成引物；以待研究的植物以待研究的植物DNA为模板，用合成为模板，用合成的引物进行的引物进行PCR扩增反应；扩增反应；高浓度琼脂糖凝胶、非变性或变性聚高浓度琼脂糖凝胶、非变性或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其多态性。丙烯酰胺凝胶电泳检测其多态性。目前，目前，SSR标记技术已被广泛用于遗传标记技术已被广泛用于遗传图谱构建，品种指纹图谱绘制及品种纯度检图谱构建，品种指纹图谱绘制及品种纯度检测以及目标性状基因标记等领域。特别在人测以及目标性状基因标记等领域。特别

229、在人类和哺乳动物的分子连锁图谱中，已成为取类和哺乳动物的分子连锁图谱中，已成为取代代RFLP标记的第二代分子标记。标记的第二代分子标记。SSR标记的特点标记的特点SSR检测是依据检测是依据其两侧特定的引物进行其两侧特定的引物进行PCR扩增，因此是基扩增，因此是基于全基因组于全基因组DNA扩增其微卫星区域。检测扩增其微卫星区域。检测到的一般是一个单一的复等位基因位点。到的一般是一个单一的复等位基因位点。SSR标记为共显性标记，可鉴别出杂合标记为共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；重复性高，稳定可靠。为了提子和纯合子；重复性高，稳定可靠。为了提高分辨率，通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳，高分辨率，通常使

230、用聚丙烯酰胺凝胶电泳，它可检测出单拷贝差异。它兼有它可检测出单拷贝差异。它兼有PCR反应的反应的优点，所需优点，所需DNA样品量少，对样品量少，对DNA质量要求质量要求不高。不高。使用使用SSR技术的前提是需要知道重复序列技术的前提是需要知道重复序列两翼的两翼的DNA序列序列。这可在其它种的。这可在其它种的DNA数据数据库中查询，但更多的是必须针对每个染色体座库中查询，但更多的是必须针对每个染色体座位的微卫星，从其基因组文库中可发现可用的位的微卫星，从其基因组文库中可发现可用的克隆，进行测序，以其两端的单拷贝序列设计克隆，进行测序，以其两端的单拷贝序列设计引物，因此，引物，因此，微卫星标记的开

231、发成本高。微卫星标记的开发成本高。ISSR标记标记在在SSR标记的的基础上开标记的的基础上开发的发的ISSR（inter-simplesequencerepeatpolymorphicDNA）分子标记是用两个相邻分子标记是用两个相邻SSR区域内的引物去扩增它们中间单拷贝序列，区域内的引物去扩增它们中间单拷贝序列，通过电泳检测其扩增产物的多态性。通过电泳检测其扩增产物的多态性。引物设计采用两个核苷酸、三个核苷酸或四个引物设计采用两个核苷酸、三个核苷酸或四个核苷酸序列为基元（核苷酸序列为基元（motifs），以其不同重复次数），以其不同重复次数再加上几个非重复的锚定碱基组成随机引物，从而再加上几个

232、非重复的锚定碱基组成随机引物，从而保证引物与基因组保证引物与基因组DNA中中SSR的的5或或3末端结合，末端结合，通过通过PCR反应扩增两个反应扩增两个SSR之间的之间的DNA片段。如片段。如（AC）nX、（、（TG）nX、（、（ATG）nX、（CTC）nX、（、（GAA）nX等（等（X代表非重复的锚定代表非重复的锚定碱基）。碱基）。Naganka等（等（1997）已在小麦的）已在小麦的ISSR标记研标记研究中发现究中发现ISSR标记可获得数倍于标记可获得数倍于RAPD标记的信息标记的信息量。由于量。由于ISSR标记不像标记不像RFLP标记步骤烦琐，而且标记步骤烦琐，而且不需要同位素标记，因此

233、，针对重复序列含量高的不需要同位素标记，因此，针对重复序列含量高的物种，利用物种，利用ISSR法可与法可与RFLP、RAPD等分子标记相等分子标记相媲美。它对填充遗传连锁图上大的不饱和区段、富媲美。它对填充遗传连锁图上大的不饱和区段、富集有用的理论标记具有重要意义。集有用的理论标记具有重要意义。5、其它标记、其它标记CAPs（cleavedamplificationpolymorphismsequence-taggedsites）该技术又称该技术又称PCR-RFLP。用特异设计的用特异设计的PCR引物扩增目标材料时，由于特定引物扩增目标材料时，由于特定位点的碱基突变、插入或缺失数很小，以至无多

234、态位点的碱基突变、插入或缺失数很小，以至无多态性出现，往往需要对相应性出现，往往需要对相应PCR扩增片段进行酶切处扩增片段进行酶切处理，以检测其多态性理，以检测其多态性（Akopyanz等等，1992）。其基本步骤是：首先利用特定引物进行其基本步骤是：首先利用特定引物进行PCR扩扩增，然后将增，然后将PCR扩增产物用限制性内切酶酶切，酶扩增产物用限制性内切酶酶切，酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳将切产物通过琼脂糖凝胶电泳将DNA片段分开，片段分开，EB染染色，观察其多态性。与色，观察其多态性。与RFLP技术一样，技术一样，CAPs技术技术检测的多态性其实是酶切片段大小的差异。检测的多态性其实是酶切片

235、段大小的差异。Talbert等（等（1994）在小麦中将）在小麦中将RFLP标记转化为标记转化为STS标记过标记过程中，有些程中，有些STS标记无多态性，但是酶切后又出现多标记无多态性，但是酶切后又出现多态性。态性。CAPs作为一种分子标记，有以下几个优点作为一种分子标记，有以下几个优点:引物与限制性酶组合非常多，增加了揭示多引物与限制性酶组合非常多，增加了揭示多态性的机会，而且操作简便，可用琼脂糖凝胶电泳态性的机会，而且操作简便，可用琼脂糖凝胶电泳分析；分析；真核生物中，真核生物中，CAPs呈共显性呈共显性；所需所需DNA量少；量少；结果稳定可靠；结果稳定可靠；操作简便、快捷、自动化程度高。

236、操作简便、快捷、自动化程度高。CAPs标标记最成功的应用是构建拟南芥遗传图谱。记最成功的应用是构建拟南芥遗传图谱。Konieczny等（等（1993）将）将RFLP探针两端测序，探针两端测序，合成合成PCR引物，在拟南芥基因组引物，在拟南芥基因组DNA中进行扩增，中进行扩增，之后用一系列之后用一系列4碱基识别序列的限制性内切酶酶切碱基识别序列的限制性内切酶酶切扩增产物，产生了很多扩增产物，产生了很多CAPs标记，并且只用了标记，并且只用了28个个F2植株，就将这些植株，就将这些CAPs标记定位在各染色体上标记定位在各染色体上并构建了遗传图谱，并构建了遗传图谱，Hittalmani（1995）等

237、找到）等找到了一个抗稻瘟病基因了一个抗稻瘟病基因Pi-2（t）的）的CAPs标记。标记。总之，总之，CAPs标记在二倍体植物研究中标记在二倍体植物研究中可发挥巨大的作用，是可发挥巨大的作用，是PCR标记的有力补充。标记的有力补充。但是在多倍体植物中的应用还有一点局限性，但是在多倍体植物中的应用还有一点局限性，另外，另外，CAPs标记需使用内切酶，这又增加标记需使用内切酶，这又增加了研究成本，限制了该技术的广泛应用。了研究成本，限制了该技术的广泛应用。STS（Sequence-taggedsites）STS是序列标签位点或序列位点的简称。它是序列标签位点或序列位点的简称。它是指基因组中长度为是指

238、基因组中长度为200-500bp，而且核苷，而且核苷酸顺序已知的单拷贝序列，可采用酸顺序已知的单拷贝序列，可采用PCR技术技术将其专一扩增出来。将其专一扩增出来。1989年，华盛顿大学的年，华盛顿大学的Olson等人利用等人利用STS单单拷贝序列作为染色体特异的界标（拷贝序列作为染色体特异的界标（landmark），），即利用不同即利用不同STS的排列顺序和它们之间的间隔距离的排列顺序和它们之间的间隔距离构成构成STS图谱，作为该物种的染色体框架图图谱，作为该物种的染色体框架图（frameworkmap），它对基因组研究和新基因），它对基因组研究和新基因的克隆以及遗传图谱向物理图谱的转化研究具

239、有重的克隆以及遗传图谱向物理图谱的转化研究具有重要意义。要意义。STS引物的获得主要来自于引物的获得主要来自于RFLP单拷单拷贝的探针序列、微卫星序列。其中，最富有贝的探针序列、微卫星序列。其中，最富有信息和多态性的信息和多态性的STS标记应该是扩增含有微标记应该是扩增含有微卫星重复顺序的卫星重复顺序的DNA区域所获得的区域所获得的STS标记。标记。迄今为止，迄今为止，STS引物的设计主要依据单引物的设计主要依据单拷贝的拷贝的RFLP探针，根据已知的探针，根据已知的RFLP探针两探针两端序列，设计合适的引物，进行端序列，设计合适的引物，进行PCR扩增。扩增。与与RFLP相比，相比，STS标记最

240、大的优势在于不需标记最大的优势在于不需要保存探针克隆等活体物质，只需从有关数要保存探针克隆等活体物质，只需从有关数据库中调出其相关信息即可。据库中调出其相关信息即可。随着人类基因组研究的深入，表达序随着人类基因组研究的深入，表达序列标定（列标定（expressedsequencetags，ESTs）应运而生。由于它直接与一个表达）应运而生。由于它直接与一个表达基因相关，很易于转变成基因相关，很易于转变成STS。STS标记表现共显性遗传，很容易在不同标记表现共显性遗传，很容易在不同组合的遗传图谱间进行标记的转移，而且是组合的遗传图谱间进行标记的转移，而且是沟通植物遗传图谱和物理图谱的中介，它的沟

241、通植物遗传图谱和物理图谱的中介，它的实用价值很具有吸引力。实用价值很具有吸引力。但是，与但是，与SSR标记一样，标记一样，STS标记的开标记的开发依赖于序列分析及引物合成，酶切仍显成发依赖于序列分析及引物合成，酶切仍显成本太高。目前，国际上已开始收集本太高。目前，国际上已开始收集STS信息，信息，并建立起相应的信息库，以便于各国同行随并建立起相应的信息库，以便于各国同行随时调用。时调用。表表主要分子标记产生体系及特点主要分子标记产生体系及特点-比较内容比较内容RFLPRAPDAFLPSSRISSRSCAR STSCAPS-主要原理主要原理限制酶切限制酶切随机随机PCR扩增扩增限制性酶切限制性酶

242、切PCR扩增扩增随机随机PCR扩增扩增特异特异PCR扩增扩增特异特异PCR扩增扩增PCR扩增产物扩增产物southern杂交杂交结合结合PCR扩增扩增 限制性酶切限制性酶切-探针或引探针或引特定序列特定序列9-10bp由核心序列酶切由核心序列酶切特异引物特异引物以以2-、3-、4-RAPD特征带特征带RFLP探针序列探针序列特异引物，特异引物，物来源物来源DNA探针探针随机引物随机引物位点及选择性碱基位点及选择性碱基核苷酸为基元的核苷酸为基元的测序设计的测序设计的Alu-因子、因子、YAC、 组成的特定引物组成的特定引物不同重复次数作为引物不同重复次数作为引物特异引物特异引物Cosmid插入末

243、端插入末端序列设计引物序列设计引物-基因组中丰富度基因组中丰富度中等中等很高很高高高高高高高中等（？）中等（？）中等中等中等（？）中等（？）多态性水平多态性水平中等中等较高较高非常高非常高高高高高 中等中等检测基因组区域检测基因组区域单单/低低整个整个整个整个重复重复重复序列间隔重复序列间隔整个整个单拷贝区单拷贝区整个整个拷贝区拷贝区基因组基因组基因组基因组序列序列的单拷贝区的单拷贝区基因组基因组 基因组基因组-可检测座位数可检测座位数1-41-1020-1001-50-50或更多或更多1 11可靠性可靠性高高中中高高高高高高高高高高高高遗传特性遗传特性共显性共显性显性显性/共显性共显性共显性

244、共显性/显性显性共显性共显性显性显性/共显性共显性共显性共显性显性显性/共显性共显性共显性共显性DNA质量要求质量要求高高5-10g中中10-100g很高很高50-100g中中10-100g中中2-50g中中5-10g高高50-100g需否序列信息需否序列信息否否否否否否需需否否需需需需需需-放射性放射性通常是通常是不是不是通常是通常是不是不是不是不是不是不是不是不是不是不是实际周期实际周期长长短短较长较长短短短短短短短短短短发展成本发展成本高高低低高高高高低低高高高高高高-二、重要农艺性状基因连锁标记筛选技术二、重要农艺性状基因连锁标记筛选技术MAS育种不仅可以通过与目标性状基因育种不仅可以

245、通过与目标性状基因紧密连锁的分子标记在早世代对目的性状进紧密连锁的分子标记在早世代对目的性状进行选择，同时也可以利用分子标记对轮回亲行选择，同时也可以利用分子标记对轮回亲本的背景进行选择。目标基因的标记筛选本的背景进行选择。目标基因的标记筛选（genetagging）是进行）是进行MAS育种的基础。育种的基础。用于用于MAS育种的分子标记需具备育种的分子标记需具备3条件：条件：1、分子标记与目标基因紧密连锁（最好、分子标记与目标基因紧密连锁（最好1cM或更小，或共分离）；或更小，或共分离）；2、标记实用性强。重复性好，而且能经济简、标记实用性强。重复性好，而且能经济简便地检测大量个体（当前以便

246、地检测大量个体（当前以PCR为基础）；为基础）；3、不同遗传背景选择有效。遗传背景的、不同遗传背景选择有效。遗传背景的MAS则需要有某一亲本基因型的分子标记研究基础。则需要有某一亲本基因型的分子标记研究基础。（一）遗传图谱的构建与重要农艺性状基因的标记（一）遗传图谱的构建与重要农艺性状基因的标记通过建立分子遗传图谱，可同时对许多通过建立分子遗传图谱，可同时对许多重要农艺性状基因进行标记。许多农作物上重要农艺性状基因进行标记。许多农作物上已经构建了以分子标记为基础的遗传图谱，已经构建了以分子标记为基础的遗传图谱，这些图谱在重要农艺性状基因的标记和定位、这些图谱在重要农艺性状基因的标记和定位、基因

247、的图位克隆、比较作图以及基因的图位克隆、比较作图以及MAS育种等育种等方面都非常有意义。方面都非常有意义。但是由于分子标记数目的限制，目前作图亲本但是由于分子标记数目的限制，目前作图亲本的选用首先考虑亲本间的多态性水平，育种目标性的选用首先考虑亲本间的多态性水平，育种目标性状考虑较少，这样使遗传图谱的构建与重要农艺性状考虑较少，这样使遗传图谱的构建与重要农艺性状基因的标记筛选割离开来。因此，根据育种目标状基因的标记筛选割离开来。因此，根据育种目标选用两个特殊栽培品种作为亲本来构建作物的品种选用两个特殊栽培品种作为亲本来构建作物的品种品种图谱，将作物图谱构建和寻找与农艺性状基品种图谱，将作物图谱

248、构建和寻找与农艺性状基因紧密连锁的分子标记有机结合起来。因紧密连锁的分子标记有机结合起来。遗传作图的原理与经典连锁测验一致，遗传作图的原理与经典连锁测验一致，即基于染色体的交换与重组。在细胞减数分即基于染色体的交换与重组。在细胞减数分裂时，非同源染色体上的基因相互独立、自裂时，非同源染色体上的基因相互独立、自由组合，而位于同源染色体上的连锁基因在由组合，而位于同源染色体上的连锁基因在减数分裂前期减数分裂前期I非姊妹染色单体间的交换而非姊妹染色单体间的交换而发生基因重组。发生基因重组。用重组率来表示基因间的遗传距离。图用重组率来表示基因间的遗传距离。图距单位用厘摩（距单位用厘摩（centi-Mo

249、rgan，cM）表示，）表示，一个一个cM的大小大致符合的大小大致符合1%的重组率。遗传的重组率。遗传图谱只显示基因间在染色体上的相对位置，图谱只显示基因间在染色体上的相对位置，并不反应并不反应DNA的实际长度。的实际长度。遗传图谱构建的主要环节为：遗传图谱构建的主要环节为：1、群体中不同植株的标记基因型分析；、群体中不同植株的标记基因型分析；2、借助于计算机程序构建连锁群。因此，、借助于计算机程序构建连锁群。因此，要构建好的遗传图谱，首先要选择合适的亲要构建好的遗传图谱，首先要选择合适的亲本及分离群体，这直接关系到建立遗传图谱本及分离群体，这直接关系到建立遗传图谱的难易程度、遗传图谱的准确性

250、及所构建图的难易程度、遗传图谱的准确性及所构建图谱的适用性。谱的适用性。亲本间的差异不宜过大，否则会降低后亲本间的差异不宜过大，否则会降低后代的结实率及所构建图谱的准确度。而亲本代的结实率及所构建图谱的准确度。而亲本间适度的差异范围因不同物种而异，通常多间适度的差异范围因不同物种而异，通常多态性高的异交作物可选择种内不同品种作杂态性高的异交作物可选择种内不同品种作杂交亲本，而多态性低的自交作物则需选择不交亲本，而多态性低的自交作物则需选择不同种间或亚种间品种作杂交亲本。同种间或亚种间品种作杂交亲本。如玉米的多态性极好，一般品种间配制如玉米的多态性极好，一般品种间配制的群体就可成为理想的分子标记

251、作图群体，的群体就可成为理想的分子标记作图群体，而番茄的多态性较差，因而选用不同种间的而番茄的多态性较差，因而选用不同种间的后代构建分子标记作图群体。后代构建分子标记作图群体。用于分子标记的遗传作图群体一般用于分子标记的遗传作图群体一般分为两类，一类为暂时性分离群体，包分为两类，一类为暂时性分离群体，包括括F2群体、群体、BC群体等；另一类为加倍单群体等；另一类为加倍单倍体倍体（doubledhaploid，DH）和重组近和重组近交系交系（recombinantinbredlines，RIL）等永久性分离群体。等永久性分离群体。F2群体构建比较省事。但是由于每个群体构建比较省事。但是由于每个F

252、2单株所提供的单株所提供的DNA有限，而且只能使用一代，有限，而且只能使用一代，限制了该群体的作图能力。限制了该群体的作图能力。BC群体是由群体是由F1与与亲本之一回交产生的群体。由于该群体的配亲本之一回交产生的群体。由于该群体的配子类型较少，统计和作图分析较为简单，但子类型较少，统计和作图分析较为简单，但是提供的信息量少于是提供的信息量少于F2群体，而且可供作图群体，而且可供作图的材料有限不能多代使用。的材料有限不能多代使用。若通过远缘杂交构建的若通过远缘杂交构建的F2作图群体，易作图群体，易发生向两极疯狂分离，标记比例容易偏离发生向两极疯狂分离，标记比例容易偏离31或或121。第二类为永久

253、性分离群体，包。第二类为永久性分离群体，包括重组自交系群体、加倍单倍体群体等。括重组自交系群体、加倍单倍体群体等。RIL群体是由群体是由F2经多代自交一粒传（经多代自交一粒传（singleseeddescendant，SSD）使后代基因组相对）使后代基因组相对纯合的群体。纯合的群体。自花授粉作物作图群体的构建方法：自花授粉作物作图群体的构建方法：P1P2-F1-F1F1P1F1P2F1F2B1BC1B2BC2DHLF3RIL图图遗传作图群体构建方法遗传作图群体构建方法异花授粉作物作图群体的构建方法：异花授粉作物作图群体的构建方法：ABCDEfG=对对B、D、G位点来说，相当于位点来说，相当于F

254、2AbcdEfg对对A、C、E位点来说，相当于测交位点来说，相当于测交F位点不分离位点不分离AbCDEfG=aBCdefg图图遗传作图群体构建方法遗传作图群体构建方法表表不同作图群体的特点不同作图群体的特点-F2BC1DHRIL-群体形成群体形成F1自交后代自交后代回交后代回交后代花粉分化个体花粉分化个体个体自交后代个体自交后代性状研究对象性状研究对象个体个体个体个体品系品系品系品系准确度准确度低低低低高高高高必要的群体规模必要的群体规模大大大大中中中中分离比例分离比例121或或31111111-RIL群体是由群体是由F2经多代自交一粒传经多代自交一粒传（singleseeddescendan

255、t，SSD）使后代基使后代基因组相对纯合的群体。因组相对纯合的群体。RIL群体一旦建立，群体一旦建立，就可以代代繁衍相传，有利于不同实验室的就可以代代繁衍相传，有利于不同实验室的协同研究而且作图的准确性更高。缺点是建协同研究而且作图的准确性更高。缺点是建立立RIL群体相当费时，而且有的作物很难产群体相当费时，而且有的作物很难产生生RIL群体。群体。DH群体是通过对群体是通过对F1花药离体培养或通花药离体培养或通过特殊的技术（如棉花的半胚生殖材料）得过特殊的技术（如棉花的半胚生殖材料）得到单倍体植株后代，再经染色体加倍而获得到单倍体植株后代，再经染色体加倍而获得的纯合二倍体分离群体。因此，的纯合

256、二倍体分离群体。因此，DH群体也群体也能长期保存。但构建能长期保存。但构建DH群体需深厚的组织群体需深厚的组织培养基础和染色体加倍技术。培养基础和染色体加倍技术。与暂时性群体相比，永久性群体至少有两方面与暂时性群体相比，永久性群体至少有两方面的长处：的长处： 1、群体中各品系的遗传组成相对固定，可以通、群体中各品系的遗传组成相对固定，可以通过种子繁殖代代相传，不断地增加新的遗传标记，并过种子繁殖代代相传，不断地增加新的遗传标记，并可在不同的研究小组之间共享信息；可在不同的研究小组之间共享信息； 2、可以对性状的鉴定进行重复试验以得到可靠、可以对性状的鉴定进行重复试验以得到可靠的结果。这对于某些

257、病害的抗性鉴定以及受多基因控的结果。这对于某些病害的抗性鉴定以及受多基因控制而且易受环境影响的数量性状的分析尤为重要。制而且易受环境影响的数量性状的分析尤为重要。许多重要的农艺性状，如抗病性、抗虫许多重要的农艺性状，如抗病性、抗虫性、育性，一些抗逆性（抗盐、抗旱）等都性、育性，一些抗逆性（抗盐、抗旱）等都表现为质量性状遗传的特点。由于这些性状表现为质量性状遗传的特点。由于这些性状只受单基因或少数几个主基因控制，一般均只受单基因或少数几个主基因控制，一般均有显隐性，在分离世代无法通过表现型来识有显隐性，在分离世代无法通过表现型来识别目的基因位点是纯合还是杂合。别目的基因位点是纯合还是杂合。在几对

258、基因作用相同时（如一些抗病基因对病在几对基因作用相同时（如一些抗病基因对病原菌的不同生理小种反应不同），无法识别哪些基原菌的不同生理小种反应不同），无法识别哪些基因在起作用，特别是一些质量性状虽然受少数主基因在起作用，特别是一些质量性状虽然受少数主基因控制，但是其中许多性状的表现还受遗传背景、因控制，但是其中许多性状的表现还受遗传背景、微效基因以及环境条件的影响。所以，利用分子标微效基因以及环境条件的影响。所以，利用分子标记技术来定位，识别质量性状基因，特别是利用分记技术来定位，识别质量性状基因，特别是利用分子标记对一些易受环境影响的抗性基因的选择就变子标记对一些易受环境影响的抗性基因的选择就

259、变得相对简单。得相对简单。（二）近等基因系的培育与重要农艺性状基因的标记（二）近等基因系的培育与重要农艺性状基因的标记近等基因系（近等基因系（NIL）是）是Young等人最早等人最早提出来的。提出来的。近等基因系的培育主要是通过多近等基因系的培育主要是通过多次的定向回交，它与原来的轮回亲本就构成次的定向回交，它与原来的轮回亲本就构成了一对近等基因系。了一对近等基因系。在回交导入目标性状基在回交导入目标性状基因的同时，与目标基因连锁的染色体片段将因的同时，与目标基因连锁的染色体片段将随之进入回交子代中。随之进入回交子代中。NIL作图的基本思路是鉴别位于导入的目标基作图的基本思路是鉴别位于导入的目

260、标基因附近连锁区内的分子标记，借助于分子标记定位因附近连锁区内的分子标记，借助于分子标记定位目标基因。利用这样的品系可在不需要完整遗传图目标基因。利用这样的品系可在不需要完整遗传图谱的情况下，先用一对近等基因系筛选与目标基因谱的情况下，先用一对近等基因系筛选与目标基因连锁的分子标记，再用近等基因系间的杂交分离群连锁的分子标记，再用近等基因系间的杂交分离群体进行标记与目的基因连锁的验证，从而筛选出与体进行标记与目的基因连锁的验证，从而筛选出与目标基因连锁的分子标记。目标基因连锁的分子标记。Param等等1991年运用年运用212个随机引物个随机引物对莴苣抗感霜霉病（对莴苣抗感霜霉病（Dm）的近等

261、基因系进）的近等基因系进行了行了RAPD分析，将分析，将4个个RAPD标记定位在标记定位在Dm1和和Dm3连锁区域，连锁区域，6个定位在个定位在Dm11连连锁区。锁区。用近等基因系方法，还筛选出燕麦锈用近等基因系方法，还筛选出燕麦锈病、大麦茎斑病、小麦的腥黑穗病、番茄病、大麦茎斑病、小麦的腥黑穗病、番茄的线虫病、花叶病毒、烟草的黑根瘤等抗的线虫病、花叶病毒、烟草的黑根瘤等抗性基因以及很多其它目的基因的分子标记性基因以及很多其它目的基因的分子标记。（三）群体分离分析法与重要农艺性状基因的标记（三）群体分离分析法与重要农艺性状基因的标记近等基因系的基因作图效率很高，但是近等基因系的基因作图效率很高

262、，但是一个近等基因系的培育耗费时间长，既费工一个近等基因系的培育耗费时间长，既费工又费时。另外，许多植物很难构建其近等基又费时。另外，许多植物很难构建其近等基因系，如一些林木植物既无可利用的遗传图因系，如一些林木植物既无可利用的遗传图谱，又对其系谱了解很少，几乎不可能创造谱，又对其系谱了解很少，几乎不可能创造近等基因系。近等基因系。1991年，年，Michelmore等提出了群体等提出了群体分离分析法分离分析法（Bulkedsegregateanalysis，BSA），），为快速高效筛选重要农艺性状基因为快速高效筛选重要农艺性状基因的分子标记打下了基础。的分子标记打下了基础。以某一抗病基因为例

263、说明构建以某一抗病基因为例说明构建BSA群体群体的方法。用某一作物的抗病品种与感病品种的方法。用某一作物的抗病品种与感病品种杂交，杂交，F2抗病基因发生分离。依抗病性表现抗病基因发生分离。依抗病性表现将分离群体分成将分离群体分成2组，组，1组为抗病的，另组为抗病的，另1组组为感病的。然后分别从两组中选出为感病的。然后分别从两组中选出5-10株株抗、感极端类型的植株提取抗、感极端类型的植株提取DNA，等量混，等量混合构成抗、感合构成抗、感DNA池。池。对这两个混合对这两个混合DNA池进行多态性分析，池进行多态性分析，筛选出有多态性差异的标记，再分析筛选出有多态性差异的标记，再分析F2所所有的分离

264、单株，以验证该标记与目标性状有的分离单株，以验证该标记与目标性状的连锁关系以及连锁的紧密程度。的连锁关系以及连锁的紧密程度。利用利用BSA法，法，1991年，年，Michelmore等从等从100个随机引物中筛选到个随机引物中筛选到3个与莴苣个与莴苣Dm5/8基因连基因连锁、而且遗传距离在锁、而且遗传距离在15cM内的分子标记。内的分子标记。Giovannoni等通过已知的等通过已知的RFLP遗传图谱，选择不遗传图谱，选择不同的同的RFLP基因型建立基因型建立DNA混合库，筛选出与番茄混合库，筛选出与番茄果实成熟及茎蒂脱落基因连锁的果实成熟及茎蒂脱落基因连锁的RAPD标记。目前，标记。目前，利

265、用该法已广泛用于主要农作物重要农艺性状基因利用该法已广泛用于主要农作物重要农艺性状基因连锁的分子标记筛选。连锁的分子标记筛选。（四）数量性状基因的定位（四）数量性状基因的定位产量、成熟期、品质、抗旱性等大多数产量、成熟期、品质、抗旱性等大多数重要的农艺性状均表现为数量性状的遗传特重要的农艺性状均表现为数量性状的遗传特点。影响这类性状的表现型差异由多个基因点。影响这类性状的表现型差异由多个基因位点（数量性状位点，位点（数量性状位点，QTL）和环境共同决）和环境共同决定，子代常常发生超亲分离。筛选与多基因定，子代常常发生超亲分离。筛选与多基因控制的数量性状基因连锁的分子标记要比筛控制的数量性状基因

266、连锁的分子标记要比筛选主基因控制的质量性状复杂得多。选主基因控制的质量性状复杂得多。用于用于QTL分析的群体最好是永久性群体，分析的群体最好是永久性群体，如重组近交系和加倍单倍体群体。如重组近交系和加倍单倍体群体。永久性群体中各品系的遗传组成相对稳永久性群体中各品系的遗传组成相对稳定，可通过种子繁殖代代相传，并可对目标定，可通过种子繁殖代代相传，并可对目标性状或易受环境影响的性状进行重复鉴定以性状或易受环境影响的性状进行重复鉴定以得到更为可靠的结果。得到更为可靠的结果。从数量性状遗传分析的角度讲，永久性从数量性状遗传分析的角度讲，永久性群体中各品系基因型纯合，排除了基因间的群体中各品系基因型纯

267、合，排除了基因间的显性效应，不仅是研究控制数量性状基因的显性效应，不仅是研究控制数量性状基因的加性效应、上位性效应及连锁关系的理论材加性效应、上位性效应及连锁关系的理论材料，同时也可在多个环境和季节中研究数量料，同时也可在多个环境和季节中研究数量性状的基因型与互作关系。性状的基因型与互作关系。永久性群体的培育费用高，因此永久性群体的培育费用高，因此QTL的标的标记与定位也有用暂时性分离群体。记与定位也有用暂时性分离群体。开始时，分离群体用单标记分析方法进行开始时，分离群体用单标记分析方法进行QTL的定位，例如，在一个的定位，例如，在一个F2群体，给予任何一群体，给予任何一个特定的标记个特定的标

268、记M，如果所有，如果所有M1M1同质个体的表现同质个体的表现型平均值高于型平均值高于M2M2同质个体，那么就可以推断存同质个体，那么就可以推断存在一个在一个QTL与这个标记连锁。与这个标记连锁。如果显著水平设置太低，这种方法的假如果显著水平设置太低，这种方法的假阳性高。此外，阳性高。此外，QTL不一定与任一给定的标不一定与任一给定的标记等位，尽管它与最近的标记之间具有很强记等位，尽管它与最近的标记之间具有很强的联系，但是它的准确位置和它的效应还不的联系，但是它的准确位置和它的效应还不能确定。能确定。区间作图的引入，克服了上述许多问题。区间作图的引入，克服了上述许多问题。它沿着染色体对相邻区间逐

269、个进行扫描，确它沿着染色体对相邻区间逐个进行扫描，确定每个区间任一特定位置的定每个区间任一特定位置的QTL的似然轮廓。的似然轮廓。更准确地说，是确定是否存在一个更准确地说，是确定是否存在一个QTL的似的似然比的对数然比的对数（LanderBostien）。）。在似然轮廓图中，那些超过特定显著水在似然轮廓图中，那些超过特定显著水平的最大值处，表明是存在平的最大值处，表明是存在QTL的可能位置。的可能位置。显著水平必须调整到避免来自多重测验的假显著水平必须调整到避免来自多重测验的假阳性。置信区间为相对于顶峰两边各阳性。置信区间为相对于顶峰两边各1个个LOD值的距离。值的距离。区间作图一直是应用最广

270、泛的一种方区间作图一直是应用最广泛的一种方法，特别是它应用于自交衍生的群体。其法，特别是它应用于自交衍生的群体。其软件软件Mapmaker/QTL（White-headInstitute，1993）是免费提供的。尽管）是免费提供的。尽管已对该方法进行过许多精度和效率的研究，已对该方法进行过许多精度和效率的研究，但是都没有产生重要的修改。但是都没有产生重要的修改。第第2种方法是种方法是Haley和和knott（1992）发展的多元回归分析法。该方法相对发展的多元回归分析法。该方法相对LOD作作图而言，在精度和准确度上与区间作图产生图而言，在精度和准确度上与区间作图产生非常相似的结果，它具有程序简

271、单、计算快非常相似的结果，它具有程序简单、计算快速的优点，适合于处理复杂的后代和模型中速的优点，适合于处理复杂的后代和模型中包含广泛的固定效应的情形。包含广泛的固定效应的情形。例如，性别的不同和环境的不同。显例如，性别的不同和环境的不同。显著性测验和置信区间估计可利用著性测验和置信区间估计可利用Bootstrapping抽样方法抽样方法（Visscheretal，1996；LebretonVisscher，1998）。）。第第3种方法是同时用一个给定的染色体种方法是同时用一个给定的染色体上的所有标记进行回归模型分析，利用加权上的所有标记进行回归模型分析，利用加权最小平方和法或模拟进行显著性测验

272、最小平方和法或模拟进行显著性测验（Kearsey-Hyne，1994）。它具有计算）。它具有计算速度快和在一个测验中利用所有标记信息的速度快和在一个测验中利用所有标记信息的优点。优点。如果一个染色体上只有一个如果一个染色体上只有一个QTL，所有，所有定位和测定标记两侧之间的定位和测定标记两侧之间的QTL效应的必要效应的必要信息都可以利用。尽管你确实不知道哪些标信息都可以利用。尽管你确实不知道哪些标记在记在QTL两侧或者每条染色体上只有一个两侧或者每条染色体上只有一个QTL，不论，不论QTL怎样在染色体上分布，多重怎样在染色体上分布，多重标记方法确实提供了模型的整个测验。标记方法确实提供了模型的

273、整个测验。三、三、作物作物MAS育种育种（一）作物（一）作物MAS育种需具备的条件育种需具备的条件要开展要开展MAS育种，必须具备如下条育种，必须具备如下条件：件：分子标记与目标基因共分离或紧分子标记与目标基因共分离或紧密连锁，一般要求两者之间的遗传距离密连锁，一般要求两者之间的遗传距离小于小于5cM，最好，最好1cM或更小；或更小；具有在大群体中利用分子标记具有在大群体中利用分子标记进行筛选的有效手段，目前，主要应进行筛选的有效手段，目前，主要应用在自动化程度高、相对易于分析，用在自动化程度高、相对易于分析，而且成本较小的而且成本较小的PCR技术；技术；筛选技术在不同试验室间重复性筛选技术在

274、不同试验室间重复性好，而且具有经济、易操作的特点；好，而且具有经济、易操作的特点；应有实用化程度高并能协助育种应有实用化程度高并能协助育种家作出抉择的计算机数据处理软件。家作出抉择的计算机数据处理软件。由单基因或寡基因控制的质量性状的分子标由单基因或寡基因控制的质量性状的分子标记，易于用于记，易于用于MAS育种。对大多数数量性状遗传育种。对大多数数量性状遗传的重要农艺性状，若利用的重要农艺性状，若利用MAS育种则必须具有精育种则必须具有精确的确的QTL图谱。这不仅需要将重复的性状利用合适图谱。这不仅需要将重复的性状利用合适软件分成多个软件分成多个QTLs，并将各个，并将各个QTL标记定位于合标

275、记定位于合适的遗传图谱上，而且还与是否有对该数量性状适的遗传图谱上，而且还与是否有对该数量性状表现型进行准确检测的方法。表现型进行准确检测的方法。用于作图的群体大小、可重复性、环境用于作图的群体大小、可重复性、环境影响和不同遗传背景的影响以及是否有合适影响和不同遗传背景的影响以及是否有合适的数量性状遗传分析方法等有关。这为筛选的数量性状遗传分析方法等有关。这为筛选某一复杂农艺性状的某一复杂农艺性状的QTL标记提出了更高的标记提出了更高的要求，也增加了要求，也增加了MAS付诸育种实践的难度。付诸育种实践的难度。（二）（二）MAS育种方法育种方法筛选与质量性状基因紧密连锁的分子筛选与质量性状基因紧

276、密连锁的分子标记用于辅助育种，可免受环境条件的影响。标记用于辅助育种，可免受环境条件的影响。Deal等（等（1995）将普通小麦）将普通小麦4D染色体长臂染色体长臂上的抗盐基因转移到硬粒小麦上的抗盐基因转移到硬粒小麦4B染色体上，染色体上，利用与该抗盐基因连锁的分子标记进行选择，利用与该抗盐基因连锁的分子标记进行选择，大大提高了选择效率。大大提高了选择效率。研究表明：在一个有研究表明：在一个有100个个体数的回个个体数的回交后代群体中，借助交后代群体中，借助100个个RFLP标记选择，标记选择，只需只需3代就可使后代的基因型回复到轮回亲本代就可使后代的基因型回复到轮回亲本的的99.2%，而随机

277、挑选则需要，而随机挑选则需要7代才能达到。代才能达到。利用利用MAS技术在快速基因累集方面也表技术在快速基因累集方面也表现出其巨大的优越性，国际水稻所现出其巨大的优越性，国际水稻所Mackill等等（1992）已将抗稻瘟病基因）已将抗稻瘟病基因Pi-l、Pi-Z5、Pi-ta精确定位，并建立了分别具有这精确定位，并建立了分别具有这3个基个基因的等基因系。通过因的等基因系。通过MAS聚合杂交获得聚合杂交获得3个个抗稻瘟病累集到一个材料中的个体。抗稻瘟病累集到一个材料中的个体。近十多年来，分子标记的研究已近十多年来，分子标记的研究已经得到快速发展，在许多作物中已定经得到快速发展，在许多作物中已定位

278、了很多重要性状的基因，但是预测位了很多重要性状的基因，但是预测品系或品种的报道还很少。品系或品种的报道还很少。原因主要有：原因主要有：标记信息的丢失。标记标记信息的丢失。标记仍然存在，但是由于重组使标记与基因分离，仍然存在，但是由于重组使标记与基因分离，导致选择偏离方向；导致选择偏离方向；QTL定位和效应估算定位和效应估算的不精确性；的不精确性；上位性的存在，由于上位性的存在，由于QTL与与环境、环境、QTL与与QTL之间存在互作，导致不同之间存在互作，导致不同环境、不同背景下选择效率发生偏差；环境、不同背景下选择效率发生偏差；标标记鉴定技术有待于进一步提高。记鉴定技术有待于进一步提高。尽管近年来标记鉴定技术在实用尽管近年来标记鉴定技术在实用性及降低成本方面都得到了很大的发性及降低成本方面都得到了很大的发展，但是对于大多数试验室来说，展，但是对于大多数试验室来说，MAS还是一项费时耗资的工作。还是一项费时耗资的工作。尽管目前尽管目前MAS的成功应用还存在许的成功应用还存在许多困难，但是多困难，但是MAS在未来作物育种中的在未来作物育种中的作用是毋容置疑的。相信在不久的将来，作用是毋容置疑的。相信在不久的将来，随着分子生物技术的进一步发展以及各随着分子生物技术的进一步发展以及各种作物图谱的日趣饱和，种作物图谱的日趣饱和，MAS会发挥它会发挥它应有的作用。应有的作用。