重组克隆的筛选和鉴定讲义

第七章第七章 重组克隆的筛选和鉴定重组克隆的筛选和鉴定n内容提要内容提要n第一节第一节 载体表型选择法载体表型选择法n第二节第二节 DNA电泳检测法电泳检测法n第三节第三节 核酸杂交检测法核酸杂交检测法n第四节第四节 免疫化学检测法免疫化学检测法n第五节第五节 转译筛选法转译筛选法n第六节第六节 真核重组基因的选择方法真核重组基因的选择方法一般克隆与筛选策略一般克隆与筛选策略第一节第一节 载体表型选择法载体表型选择法n根据载体提供的表型进行选择的方法：根据载体提供的表型进行选择的方法：n抗生素抗性基因的插入失活选择法抗生素抗性基因的插入失活选择法n -半乳糖苷酶的显色反应选择法半乳糖苷酶的显色反应选择法一般原理一般原理n一种利用一种利用抗生素抗性基因抗生素抗性基因或或其他基因其他基因的的插入失活，来筛选重组子的方法插入失活，来筛选重组子的方法n通常外源通常外源DNA插入的位点设计在特定基插入的位点设计在特定基因上，一旦外源因上，一旦外源DNA插入，该基因就被插入，该基因就被破坏而失去活性由此来判断载体上是破坏而失去活性由此来判断载体上是否带有外源否带有外源DNA。

一、插入失活法的原理一、插入失活法的原理二、利用抗生素抗性基因：二、利用抗生素抗性基因：pBR322n以以pBR322为例，说明利用抗生素抗性基因的为例，说明利用抗生素抗性基因的插入失活的原理插入失活的原理1. 原理原理n在在pBR322上有多个单一的限制酶位点，如上有多个单一的限制酶位点，如BamH I位点，恰好在一个四环素抗性基因内位点，恰好在一个四环素抗性基因内如果有外源如果有外源DNA插入插入BamH I位点，那么涉及位点，那么涉及四环素抗性的基因就损坏，因此，带有重组四环素抗性的基因就损坏，因此，带有重组pBR322质粒的细胞，仍对氨苄青霉素有抗性，质粒的细胞，仍对氨苄青霉素有抗性，但对四环素的抗性消失（敏感）但对四环素的抗性消失（敏感）2. 筛选的方法筛选的方法n①①转化细胞涂布于含有氨苄青霉素的固体培转化细胞涂布于含有氨苄青霉素的固体培养基上，并培养至菌落出现养基上，并培养至菌落出现n②②用一个牙签接触培养基的表面，将沾有不用一个牙签接触培养基的表面，将沾有不同菌落的牙签，放到另一含有四环素的固体同菌落的牙签，放到另一含有四环素的固体培养基表面接触一下培养基表面接触一下。

n③③适温培养，有的克隆生长，有的不生长适温培养，有的克隆生长，有的不生长n④④根据不会生长的位置，再回到带氨苄的培根据不会生长的位置，再回到带氨苄的培养基上去找那些原始的克隆养基上去找那些原始的克隆n⑤⑤这些克隆因为丧失了对四环素的抗性，就这些克隆因为丧失了对四环素的抗性，就是含有重组是含有重组pBR322质粒的重组子质粒的重组子图图 pBR322的结构图的结构图3. 抗菌素标记的选择抗菌素标记的选择（（1））Ampr 氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因n产生产生 -内酰胺酶酶使氨苄青霉素变为青霉内酰胺酶酶使氨苄青霉素变为青霉酮酸青霉酮酸使蓝灰色的酮酸青霉酮酸使蓝灰色的碘碘-青霉素指示液青霉素指示液（（I2-KI-Aampicillin））褪色褪色nAmpr有有Pst I、、Sca I等多个插入位点等多个插入位点2）四环素）四环素n抑制细菌生长，但不杀死细菌抑制细菌生长，但不杀死细菌3）环丝氨酸）环丝氨酸n杀死生长的细菌，但不杀停止生长的细菌杀死生长的细菌，但不杀停止生长的细菌4. 选择的过程选择的过程（（1）四环素抗性插入失活）四环素抗性插入失活n如果在如果在Tetr上上插入外源插入外源DNA，导致四环，导致四环素抗性基因失活，可用素抗性基因失活，可用四环素四环素﹢环丝氨环丝氨酸酸的平板，选择重组克隆。

的平板，选择重组克隆nTetr插入失活的细菌，其生长可被四环插入失活的细菌，其生长可被四环素素抑制抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；，不被环丝氨酸杀死，保留下来； nTetr不失活的细菌，能抗四环素，正常不失活的细菌，能抗四环素，正常生长，但可被环丝氨酸杀死生长，但可被环丝氨酸杀死无环丝氨酸无环丝氨酸图图 四环素抗性插入失活四环素抗性插入失活重组克隆重组克隆（（2）氨苄青霉素抗性插入失活）氨苄青霉素抗性插入失活n氨苄青霉素抗性基因编码产生氨苄青霉素抗性基因编码产生 -内酰胺内酰胺酶酶使氨苄青霉素变为青霉酮酸酶使氨苄青霉素变为青霉酮酸青霉酮酸使霉酮酸使蓝灰色蓝灰色的碘的碘-青霉素指示液青霉素指示液褪褪色色n如果如果Ampr上插入外源上插入外源DNA，，导致氨苄导致氨苄青霉素抗性基因失活，就不能使碘青霉素抗性基因失活，就不能使碘-青青霉素指示液褪色霉素指示液褪色---呈呈蓝灰色据此选据此选择择阳性克隆阳性克隆图图 氨苄青霉素抗性插入失活氨苄青霉素抗性插入失活三、利用三、利用 -半乳糖苷酶显色半乳糖苷酶显色n选择重组子的原理选择重组子的原理1.  -半乳糖苷酶与半乳糖苷酶与Lac Z基因基因n由由E.coli lac操纵子上的操纵子上的Lac Z基因编码。

基因编码分解乳糖生成葡萄糖和半乳糖分解乳糖生成葡萄糖和半乳糖2. Lac Z 基因基因n突变的突变的Lac Z基因，只编码基因，只编码 -半乳糖苷半乳糖苷酶的酶的部分肽段部分肽段（氨基端）（氨基端） 2. 培养基中培养基中IPTG、、X-gal 的作用的作用（（1））IPTG作用作用n异丙基硫代异丙基硫代-β-D-半乳糖苷是诱导物，可诱导半乳糖苷是诱导物，可诱导lacZ 基因的表达基因的表达 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶2））X-gal作用作用n5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚- -D-半乳糖苷作为半乳糖苷作为 -半半乳糖苷酶水解的底物乳糖苷酶水解的底物3））X-gal的显色反应的显色反应nβ-半乳糖苷酶半乳糖苷酶 (四聚体四聚体)将将X-gal水解成半乳糖水解成半乳糖苷和苷和蓝色蓝色的吲哚衍生物的吲哚衍生物(靛蓝靛蓝) 在4℃蓝色蓝色加深n -互补作用是互补作用是pUC质粒质粒载体的特性载体的特性npUC载体：载体：含有含有Lac Z 基因，编码基因，编码 -半乳糖半乳糖苷酶的部分肽段（苷酶的部分肽段（  片段，氨基端）片段，氨基端） n受体菌：受体菌：基因组中带有基因组中带有突变的突变的 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶基因（缺失基因（缺失 片段），可被片段），可被IPTG诱导表达诱导表达（只编码（只编码 -半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的 -肽）。

肽） n载体和受体菌基因组互补：载体和受体菌基因组互补：只有当受体菌吸只有当受体菌吸收了带有收了带有LacZ 基因的基因的 pUC质粒，才能合成质粒，才能合成完整的有活性的完整的有活性的 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶3.  -互补作用互补作用n氨苄青霉素抗性基因氨苄青霉素抗性基因nLac Z 基因：编码基因：编码 -半乳糖苷酶的部半乳糖苷酶的部分肽段nLac Z 上有插入外源上有插入外源DNA的的MCS位点 pUC18/19的结构图的结构图n利用蓝白斑法筛选利用蓝白斑法筛选pUC8/9重组子，是一重组子，是一种直接检测种直接检测 -半乳糖苷酶活性的方法半乳糖苷酶活性的方法n①①先将转化子涂于含有氨苄青霉素的培先将转化子涂于含有氨苄青霉素的培养基，能合成养基，能合成 -半乳糖苷酶半乳糖苷酶n②②然后再通过检测然后再通过检测 -半乳糖苷酶的活性，半乳糖苷酶的活性，来选择重组子，如果既能抗氨苄青霉素，来选择重组子，如果既能抗氨苄青霉素，又能合成又能合成 -半乳糖苷酶的细胞，就是重半乳糖苷酶的细胞，就是重组子细胞组子细胞4. 筛选的方法：蓝白斑法筛选的方法：蓝白斑法n③③ -半乳糖苷酶分解半乳糖苷酶分解X-gal的显色反应的显色反应很灵敏。

当在含有氨卡青霉素、很灵敏当在含有氨卡青霉素、X-gal、、IPDG的培养基中，那些能合成完整的的培养基中，那些能合成完整的 -半乳糖苷酶的非重组子克隆，会因它半乳糖苷酶的非重组子克隆，会因它能分解能分解X-gal而变成蓝色；而变成蓝色；④④而重组子而重组子克隆因克隆因Lac Z 基因被破坏，不能合成基因被破坏，不能合成完整的完整的 -半乳糖苷酶，故不能分解半乳糖苷酶，故不能分解X-gal而呈白色而呈白色5. 选择培养的原理选择培养的原理n在含有在含有X-gal 和和IPTG 的选择培养基上，的选择培养基上，载体上载体上没有没有插入片段的转化子为插入片段的转化子为蓝色蓝色菌菌落，而落，而携带携带插入片段的重组质粒转化子插入片段的重组质粒转化子为为白色白色菌落n平板平板37℃培养后，放于冰箱培养后，放于冰箱3-4 小时，小时，可使显色反应充分，菌落为蓝色可使显色反应充分，菌落为蓝色图图  -半乳糖苷酶显色反应半乳糖苷酶显色反应* - -半乳半乳糖苷酶糖苷酶 乳糖乳糖半乳糖半乳糖葡萄糖葡萄糖X-gal半乳糖半乳糖5-溴溴-4-氯靛蓝氯靛蓝++蓝色蓝色图图 LacZ 插入外源插入外源DNA图图 白色菌落与蓝色菌落的挑选白色菌落与蓝色菌落的挑选四、四、pBS重组质粒的筛选实验重组质粒的筛选实验n使用的载体为使用的载体为pBS质粒。

质粒n转化受体菌为转化受体菌为E. coli DH5α菌株n由于由于pBS上带有上带有Ampr 和和lacZ 基因，故基因，故重组子的筛选采用重组子的筛选采用Amp 抗性筛选与抗性筛选与α-互互补现象筛选补现象筛选相结合的方法相结合的方法载体载体nα-供体供体为羧基末端缺失的为羧基末端缺失的β-半乳糖苷酶半乳糖苷酶如如pUC、、pGEM系列载体系列载体菌株菌株nα-受体受体为氨末端缺失的为氨末端缺失的β-半乳糖苷酶半乳糖苷酶如如DH5α(LacZ△△M15)、、JM101~110(LacZ△△M15)等1. 抗性筛选抗性筛选n因因pBS质粒带有质粒带有Ampr 基因，而外源基因，而外源DNA片段上不带该基因，故转化受体菌片段上不带该基因，故转化受体菌后，只有带有后，只有带有pBS DNA 的转化子，才的转化子，才能在含有能在含有Amp 的的LB 平板上存活下来；平板上存活下来；而只带有自身环化的外源而只带有自身环化的外源DNA片段的转片段的转化子则不能存活此为初步的抗性筛选化子则不能存活此为初步的抗性筛选2. lacZ 基因的插入失活基因的插入失活npBS质粒上带有质粒上带有β-半乳糖苷酶基因的半乳糖苷酶基因的调调控序列和控序列和β-半乳糖苷酶半乳糖苷酶N 端端146 个氨基个氨基酸的编码序列酸的编码序列。

该编码区有一个多克隆该编码区有一个多克隆位点，但并不破坏位点，但并不破坏lacZ 的阅读框架，不的阅读框架，不影响其正常功能影响其正常功能3. DH5α菌株菌株nE. coli DH5α菌株带有菌株带有β-半乳糖苷酶的半乳糖苷酶的C端的部分编码序列端的部分编码序列n在各自独立的情况下，在各自独立的情况下，pBS 和和DH5α编编码的码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性半乳糖苷酶的片段都没有酶活性但在但在pBS 和和DH5α融为一体时，可形成融为一体时，可形成具有具有β-半乳糖苷酶活性的蛋白质半乳糖苷酶活性的蛋白质4. α-互补现象互补现象nlacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的体与带有完整的近操纵基因区段的β-半半乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补的现乳糖苷酶阴性突变体之间实现互补的现象n由由α-互补产生的互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它细菌较易识别，它在生色底物在生色底物X-gal 存在下，被存在下，被IPTG 诱导，诱导，形成形成蓝色菌落蓝色菌落n当外源当外源DNA片段插入到片段插入到pBS 质粒的多克质粒的多克隆位点后，导致读码框架改变，表达蛋隆位点后，导致读码框架改变，表达蛋白失活，产生的肽段失去白失活，产生的肽段失去α-互补能力。

互补能力因此，在同样条件下，含重组质粒的转因此，在同样条件下，含重组质粒的转化子，在生色诱导培养基上，只能形成化子，在生色诱导培养基上，只能形成白色菌落白色菌落α互补作用互补作用/现象现象n当当pUC质粒转化质粒转化LacZ基因的氨基未端编基因的氨基未端编码序列缺失的码序列缺失的Lac- 指示菌株时，能恢复指示菌株时，能恢复β-半乳糖苷酶活性，从而在含半乳糖苷酶活性，从而在含IPTG和和X-gal的平板上，分解的平板上，分解X-gal成成5-溴溴-4-氯氯靛蓝，出现靛蓝，出现蓝色菌落蓝色菌落的现象n当外源当外源DNA插入插入pUC的的MCS时，时，α-互补互补作用被破坏，在作用被破坏，在IPTG和和X-gal平板上则平板上则不显蓝色而出现不显蓝色而出现白色菌落白色菌落第三节第三节 DNA电泳检测法电泳检测法 PFGEn从转化后的克隆（转化子）中快速抽提从转化后的克隆（转化子）中快速抽提重组质粒，琼脂糖凝胶电泳比较其分子重组质粒，琼脂糖凝胶电泳比较其分子量大小n插入外源插入外源DNA的重组质粒分子量大，没的重组质粒分子量大，没有插入外源有插入外源DNA的质粒分子量小的质粒分子量小。

n比较不同质粒在凝胶中的迁移率，迁移比较不同质粒在凝胶中的迁移率，迁移快慢不同，即可选出重组子快慢不同，即可选出重组子一、直接电泳检测法一、直接电泳检测法Marker载体载体重组重组图图 琼脂糖凝胶电泳图谱的比较琼脂糖凝胶电泳图谱的比较已知已知未知未知二、酶切产物电泳筛选法二、酶切产物电泳筛选法n1. 原理原理n根据已知的外源根据已知的外源DNA序列的限制性酶切序列的限制性酶切图谱，选择图谱，选择1~2种内切酶切割质粒，电种内切酶切割质粒，电泳后泳后比较比较DNA带数和长度带数和长度n或用一种内切酶切下插入片段，再用另或用一种内切酶切下插入片段，再用另一种酶酶切这个片段，电泳后一种酶酶切这个片段，电泳后比较两者比较两者是否符合预计的结果是否符合预计的结果图图 酶切产物的电泳筛选酶切产物的电泳筛选图图 限制性内切酶酶切图谱限制性内切酶酶切图谱图图 表型筛选加酶切筛选表型筛选加酶切筛选n００AATTAATT三、三、PCR扩增检测法扩增检测法1. 原理原理n在模板序列上扩增出预期在模板序列上扩增出预期DNA片断2. 过程过程（（1）从重组克隆中提取质粒（或）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。

2）用插入的）用插入的DNA片段的引物作片段的引物作PCR3））PCR产物电泳检查产物电泳检查4））PCR产物的长度是否与外源基因一致产物的长度是否与外源基因一致第四节第四节 核酸的分子杂交核酸的分子杂交n核酸杂交技术由核酸杂交技术由Hall、、Nygaard等于等于70年代建立，应用年代建立，应用DNA或或RNA探针，与探针，与靶序列在溶液中杂交，检测固定在硝酸靶序列在溶液中杂交，检测固定在硝酸纤维素（纤维素（NC）膜上的核酸序列的技术膜上的核酸序列的技术n核酸杂交法利用标记的核酸探针，与转核酸杂交法利用标记的核酸探针，与转化细胞的化细胞的DNA进行杂交，可以直接筛选进行杂交，可以直接筛选和鉴定目的序列克隆和鉴定目的序列克隆n常用的方法：将转化后生长的菌落，复常用的方法：将转化后生长的菌落，复印到硝酸纤维膜上，再用碱裂细菌菌落，印到硝酸纤维膜上，再用碱裂细菌菌落，释放的释放的DNA就吸附在膜上，再与标记的就吸附在膜上，再与标记的核酸探针温育杂交，核酸探针就结合在核酸探针温育杂交，核酸探针就结合在含有目的序列的菌落含有目的序列的菌落DNA上n该技术已广泛应用于基因的表达、基因该技术已广泛应用于基因的表达、基因定位、克隆基因的筛选、酶切图谱的制定位、克隆基因的筛选、酶切图谱的制作、基因组中特定基因序列检测、遗传作、基因组中特定基因序列检测、遗传病疾病的诊断及生物分类等方面。

病疾病的诊断及生物分类等方面 一、核酸分子杂交的基础一、核酸分子杂交的基础1. 变性与退火变性与退火nDNA以双链形式存在，在进行分子杂交以双链形式存在，在进行分子杂交时，先将双链时，先将双链DNA分子解聚为单链，这分子解聚为单链，这一过程称为一过程称为变性变性n两条单链通过碱基互补，聚合成稳定的两条单链通过碱基互补，聚合成稳定的双链区的过程称为双链区的过程称为退火或复性退火或复性2. 同源序列同源序列n不同来源的核酸单链只要彼此之间有一不同来源的核酸单链只要彼此之间有一定程度的互补顺序，即某种程度的同源定程度的互补顺序，即某种程度的同源性，就可形成杂交双链性，就可形成杂交双链n分子杂交可在分子杂交可在DNA与与DNA（（Southern blot）、）、RNA与与DNA（（Northern blot））或或RNA与与RNA（（In situ）的二条单链之）的二条单链之间进行3. 分子杂交法分子杂交法n分子杂交是通过一定方法，将核酸分子分子杂交是通过一定方法，将核酸分子固定在固相支持物上，然后用放射性标固定在固相支持物上，然后用放射性标记的记的探针探针与被固定的核酸分子杂交，经与被固定的核酸分子杂交，经显影后，显示出目的显影后，显示出目的DNA或或RNA所处所处的位置。

的位置n分子杂交就是将一种核酸单链用同位素分子杂交就是将一种核酸单链用同位素或非同位素标记成为探针，再与另一种或非同位素标记成为探针，再与另一种核酸单链进行杂交核酸单链进行杂交4. 探针探针n经过同位素或非同位素标记的已知序列经过同位素或非同位素标记的已知序列的寡核苷酸的寡核苷酸n单一的已知序列的寡核苷酸探针，能与单一的已知序列的寡核苷酸探针，能与它们的目的序列配对，可以准确地设计它们的目的序列配对，可以准确地设计杂交条件，以保证探针只与目的序列杂杂交条件，以保证探针只与目的序列杂交而不与序列相近的非完全配对序列杂交而不与序列相近的非完全配对序列杂交，对于一些未知序列的目的片段则无交，对于一些未知序列的目的片段则无效5. 杂交的灵敏度和特异性杂交的灵敏度和特异性n核酸分子杂交具有高度的灵敏度和特异核酸分子杂交具有高度的灵敏度和特异性n可以根据所使用的探针的已知序列，进可以根据所使用的探针的已知序列，进行特异性的靶序列检测行特异性的靶序列检测二、探针的类型二、探针的类型n根据核酸的性质，可分为：根据核酸的性质，可分为：nDNA探针、探针、RNA探针、探针、 cDNA探针和寡核酸探针和寡核酸探针。

探针n根据是否使用放射性标记物，可分为：根据是否使用放射性标记物，可分为：n放射性标记探针和非放射性标记探针放射性标记探针和非放射性标记探针n根据是否存在互补链，可分为：根据是否存在互补链，可分为：n单链和双链探针单链和双链探针n根据放射性标记物掺入情况，可分为：根据放射性标记物掺入情况，可分为：n均匀标记和末端标记探针均匀标记和末端标记探针1. 双链双链DNA探针探针n双链双链DNA探针的合成方法探针的合成方法n主要有两种：主要有两种：n①①切口平移法切口平移法n②②随机引物合成法随机引物合成法2. 单链单链DNA探针探针n单链单链DNA探针主要有两种合成方法探针主要有两种合成方法:n①①以以M13载体衍生序列为模板，用载体衍生序列为模板，用Klenow片段合成单链探针片段合成单链探针n②②以以RNA为模板，用反转录酶合成单链为模板，用反转录酶合成单链cDNA探针3. 末端标记末端标记DNA探针探针n以以Klenow片段标记片段标记3’末端为例说明末端末端为例说明末端标记的方法标记的方法4. 寡核苷酸探针寡核苷酸探针n利用寡核苷酸探针可检测到靶基因上单利用寡核苷酸探针可检测到靶基因上单个核苷酸的点突变。

个核苷酸的点突变n常用的寡核苷酸探针主要有两种常用的寡核苷酸探针主要有两种:n单一已知序列的寡核苷酸探针单一已知序列的寡核苷酸探针n许多简并性寡核苷酸探针组成的寡核苷许多简并性寡核苷酸探针组成的寡核苷酸探针库酸探针库三、探针的标记方法与选择三、探针的标记方法与选择1. 探针标记的方法探针标记的方法n①①缺口平移法缺口平移法n②②DNA快速末端标记快速末端标记n③③T4多核苷酸激酶标记多核苷酸激酶标记DNA 5’末端法末端法n④④随机引物延伸法随机引物延伸法n⑤⑤聚合酶链反应法聚合酶链反应法2. 标记方法的选择标记方法的选择n根据实验的要求如灵敏度和显示方法等，选根据实验的要求如灵敏度和显示方法等，选择合适的标记方法择合适的标记方法 n①①一般放射性探针比非放射性探针的灵敏度一般放射性探针比非放射性探针的灵敏度高n②②在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效在检测单拷贝基因序列时，应选用标记效率高、显示灵敏的探针标记方法率高、显示灵敏的探针标记方法n③③在对灵敏度要求不高时，可采用保存时间在对灵敏度要求不高时，可采用保存时间长的生物素探针技术，或比较稳定的碱性磷长的生物素探针技术，或比较稳定的碱性磷酸酶显示系统或过氧化物酶系统。

酸酶显示系统或过氧化物酶系统四、分子杂交四、分子杂交1.1.常用的核酸杂交方法常用的核酸杂交方法n①① Southern印迹杂交（印迹杂交（ Southern blot ）） n②② Northern印迹杂交（印迹杂交（Northern blot））n③③菌落原位杂交（菌落原位杂交（Colony in situ hybridization））n④④组织原位杂交（组织原位杂交（Tissue in situ hybridization）等n⑤⑤点杂交（点杂交（Dot blot））2. 分子杂交的分类分子杂交的分类n根据被测定的对象不同，可分为根据被测定的对象不同，可分为2大类大类:(1) Southern杂交杂交n被检对象为被检对象为DNA，探针为，探针为DNA或或RNADNA片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤片段经电泳分离后，从凝胶中转移到硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交维素滤膜或尼龙膜上，然后与探针杂交2) Northern杂交杂交nRNA片段经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤片段经电泳后，从凝胶中转移到硝酸纤维滤膜（维滤膜（NC）上，然后用探针杂交被检对）上，然后用探针杂交。

被检对象为象为RNA，探针为，探针为DNA或或RNA五、五、 Southern blot1. Southern杂交或杂交或DNA印迹印迹n1975年由年由Southern创建，称为创建，称为Southern印迹印迹技术用DNA或或RNA探针检测样品探针检测样品DNA 2. 特点特点nSouthern杂交用以检测经限制性内切酶切割杂交用以检测经限制性内切酶切割后的后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列片段中是否存在与探针同源的序列n从宿主细胞中提取基因组从宿主细胞中提取基因组DNA或质粒载体，或质粒载体，再用探针杂交只有插入目的片段的重组体，再用探针杂交只有插入目的片段的重组体，才能与探针杂交，并在才能与探针杂交，并在X光底片上曝光显示印光底片上曝光显示印迹3. 杂交的方法杂交的方法转膜：转膜：n将将DNA样本用限制性内切酶消化后，经琼脂样本用限制性内切酶消化后，经琼脂糖凝胶电泳，分离各酶解片段，然后经碱变糖凝胶电泳，分离各酶解片段，然后经碱变性、性、Tris缓冲液中和、高盐下通过毛吸作用，缓冲液中和、高盐下通过毛吸作用，将将DNA从凝胶中转印至硝酸纤维素（从凝胶中转印至硝酸纤维素（NC）滤）滤膜上，烘干固定后，即可用于杂交。

膜上，烘干固定后，即可用于杂交杂交：杂交：n在一定条件下，探针与同源在一定条件下，探针与同源DNA片段杂交，片段杂交，然后漂洗除去非特异性结合的探针通过自然后漂洗除去非特异性结合的探针通过自显影检查目的显影检查目的DNA所在位置所在位置4. 杂交的步骤或程序杂交的步骤或程序n(1) 酶切待测目的酶切待测目的DNA，凝胶电泳分离各酶，凝胶电泳分离各酶切片段，并使切片段，并使DNA原位变性为单链原位变性为单链n(2) 将单链将单链DNA片段转移到硝酸纤维素片段转移到硝酸纤维素（（NC）滤膜或尼龙膜上滤膜或尼龙膜上n(3) 预杂交滤膜，掩盖滤膜上非特异性位点预杂交滤膜，掩盖滤膜上非特异性位点n(4) 让单链的探针与同源让单链的探针与同源DNA片段杂交，漂片段杂交，漂洗除去非特异性结合的探针洗除去非特异性结合的探针n(5) 通过自显影检测目的通过自显影检测目的DNA所在位置所在位置Southern杂交杂交 (Southern印迹法印迹法)n将混合在一起的限制性酶切将混合在一起的限制性酶切DNA片段，片段，用琼脂糖电泳分开，并变性为单链用琼脂糖电泳分开，并变性为单链DNA，再转移到一张硝酸纤维素膜上。

在膜，再转移到一张硝酸纤维素膜上在膜上的单链上的单链DNA可用可用32p标记的单链标记的单链DNA探针杂交再用放射自显影方法，显示探针杂交再用放射自显影方法，显示出与探针顺序互补的限制性酶切出与探针顺序互补的限制性酶切DNA片片段的位置段的位置n这个方法能将上万个片段中的某一个特这个方法能将上万个片段中的某一个特殊的目的片段鉴定出来殊的目的片段鉴定出来图图 Southern blot图图 Southern blot凝胶电泳凝胶电泳底片显示杂交印迹底片显示杂交印迹图图 Southern印迹印迹六、六、Northern blot1. Northern印迹杂交印迹杂交n对被检测的对被检测的RNA进行变性凝胶电泳，以进行变性凝胶电泳，以除去除去RNA中的二级结构，使大小不同的中的二级结构，使大小不同的RNA完全分离完全分离n将变性后将变性后RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上，然后与探针杂交酸纤维素膜上，然后与探针杂交2. 特点特点n用用DNA或或RNA探针检测探针检测RNA样品n从宿主细胞中提取从宿主细胞中提取RNA，再用探针杂交再用探针杂交主要检测插入片段是否被转录。

主要检测插入片段是否被转录n用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛变性用甲基氧化汞、乙二醛或甲醛变性RNA，变性后的，变性后的RNA有利于在转印过程中与有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合，以及保持其单链状硝酸纤维素膜结合，以及保持其单链状态用NaOH会水解会水解RNA七、七、DNA-RNA杂交杂交nDNA-RNA杂交采用杂交采用R-环检测法环检测法n选择过程选择过程n①①用用mRNA与重组载体杂交与重组载体杂交n②②在在70%甲酰胺中，甲酰胺中，DNA双链变性，复双链变性，复性时，性时，DNA-RNA杂交分子比杂交分子比DNA-DNA双链更稳定双链更稳定n③③电镜下可见到电镜下可见到R-环形结构环形结构图图 DNA-RNA杂交（杂交（ R-环）环）八、菌落原位杂交八、菌落原位杂交n Colony in situ hybridization1. 杂交的方法杂交的方法n①①将细菌从平板转移到硝酸纤维素滤膜上将细菌从平板转移到硝酸纤维素滤膜上n②②将滤膜上的菌落原位裂解，以释出将滤膜上的菌落原位裂解，以释出DNAn③③烘干，将烘干，将DNA固定于膜上固定于膜上n④④与与32P标记的探针杂交标记的探针杂交。

n⑤⑤平板置于平板置于4℃，放射自显影，检测菌落杂交，放射自显影，检测菌落杂交信号（结果），并与平板上的菌落对应信号（结果），并与平板上的菌落对应2. 特点特点n对应的菌斑对应的菌斑(或噬菌斑或噬菌斑)位置不变，可以位置不变，可以直接找出阳性菌落直接找出阳性菌落n对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落对分散在若干个琼脂平板上的少数菌落(~200)进行克隆筛选时可采用本法进行克隆筛选时可采用本法n将分散在若干个琼脂平板上的少数菌落将分散在若干个琼脂平板上的少数菌落归并到一个琼脂主平板以及已置于第二归并到一个琼脂主平板以及已置于第二个琼脂平板表面的一张硝酸纤维素膜上个琼脂平板表面的一张硝酸纤维素膜上经培养一段时间后，对菌落进行原位裂经培养一段时间后，对菌落进行原位裂解图图 菌落原位杂交菌落原位杂交Colony in situ hybridization九、组织原位杂交九、组织原位杂交nTissue in situ hybridization，简称原位，简称原位杂交杂交1. 方法方法n组织或细胞经适当处理后，使细胞通透组织或细胞经适当处理后，使细胞通透性增加，探针直接进入细胞内与性增加，探针直接进入细胞内与DNA或或RNA杂交。

杂交2. 特点特点n组织的原位杂交与菌落的原位杂交不同，组织的原位杂交与菌落的原位杂交不同，可以确定可以确定探针的互补序列探针的互补序列在细胞内的空在细胞内的空间位置n例如，通过与细胞例如，通过与细胞RNA的杂交，可分析的杂交，可分析一种一种RNA在细胞组织中的分布、显示细在细胞组织中的分布、显示细胞及病原微生物的存在方式和部位等胞及病原微生物的存在方式和部位等 十、斑点杂交十、斑点杂交n斑点杂交是指将斑点杂交是指将DNA或或RNA样品直接点在硝样品直接点在硝酸纤维素滤膜上酸纤维素滤膜上,然后与核酸探针分子杂交然后与核酸探针分子杂交,以显示样品中是否存在特异的以显示样品中是否存在特异的DNA或或RNA同一种样品经不同倍数的稀释同一种样品经不同倍数的稀释,还可以得到半还可以得到半定量的结果所以它是一种简便、快速、经定量的结果所以它是一种简便、快速、经济的分析济的分析DNA或或RNA的方法的方法,在基因分析和在基因分析和基因诊断中经常用到基因诊断中经常用到,是研究基因表达的有力是研究基因表达的有力工具但由于目的序列未与非目的序列分离工具但由于目的序列未与非目的序列分离,不能了解目的序列的长度。

尤其在本底干扰不能了解目的序列的长度尤其在本底干扰较高时较高时,难以区分目的序列信号和干扰信号难以区分目的序列信号和干扰信号点杂交法（点杂交法（Dot blot））n将被检测标本点到膜上，烘烤固定将被检测标本点到膜上，烘烤固定n这种方法耗时短，可做半定量分析，一这种方法耗时短，可做半定量分析，一张膜上可同时检测多个样品张膜上可同时检测多个样品n为使点样准确方便，有多种多管吸印仪为使点样准确方便，有多种多管吸印仪如如Bio-Dot (Bio–Rad ) ，它们有许多孔，，它们有许多孔，样品加到孔中，在负压下就会流到膜上样品加到孔中，在负压下就会流到膜上呈斑点状或狭缝状，反复冲洗进样孔，呈斑点状或狭缝状，反复冲洗进样孔，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，取出膜烤干或紫外线照射以固定标本，这时的膜就可以进行杂交这时的膜就可以进行杂交n凝胶中凝胶中DNA片段的相对位置在片段的相对位置在DNA片段片段转移到滤膜的过程中继续保持着转移到滤膜的过程中继续保持着n附着在滤膜上的附着在滤膜上的DNA与与32P标记的探针标记的探针杂交，利用放射自显影术确定探针互补杂交，利用放射自显影术确定探针互补的每条的每条DNA带的位置，从而可以确定在带的位置，从而可以确定在众多酶解产物中含某一特定序列的众多酶解产物中含某一特定序列的DNA片段的位置和大小。

片段的位置和大小1. 核酸杂交核酸杂交n重组克隆与探针杂交重组克隆与探针杂交2. 检测用的探针检测用的探针n与外源与外源DNA插入片段互补的序列插入片段互补的序列3. 识别标记识别标记n（（1）放射性同位素：）放射性同位素：32P 或或 125I n（（2）非放射性标记：荧光素）非放射性标记：荧光素一、原理一、原理酶切前酶切前酶切后酶切后插入片段插入片段载体载体载体载体 载体载体重组体重组体重组体重组体第五节第五节 免疫化学检测法免疫化学检测法 n对表达产物的检测对表达产物的检测n蛋白蛋白—蛋白蛋白“杂交杂交” n利用抗体作为利用抗体作为“探针探针”，检测转入受体，检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因一、放射性抗体检测法一、放射性抗体检测法n1. 抗体与产物的结合方式抗体与产物的结合方式n根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：抗）的性质可分为几种作用方式：待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗二抗二抗125I 标记的二标记的二 抗结合蛋白抗结合蛋白固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗125I标记的二抗标记的二抗固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗固相支固相支持滤膜持滤膜固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗 二抗二抗125I 标记的二抗标记的二抗 结合蛋白结合蛋白125I标记的二抗标记的二抗2. 放射性抗体检测法过程放射性抗体检测法过程3. Broome-Gilbert双位点检测法双位点检测法n检测融合蛋白检测融合蛋白n既检测外源基因产物又检测载体基因产既检测外源基因产物又检测载体基因产物物质粒基因质粒基因A插入基因插入基因B表达表达质粒蛋白质粒蛋白A 外源蛋白外源蛋白B融合蛋白融合蛋白固相支固相支 持滤膜持滤膜抗抗A抗体抗体125I标记的标记的 抗抗B抗体抗体质粒蛋白质粒蛋白A 外源蛋白外源蛋白B质粒蛋白质粒蛋白A外源蛋白外源蛋白B固相支固相支 持滤膜持滤膜抗抗A抗体抗体发光，底片曝光发光，底片曝光二、免疫沉淀检测法二、免疫沉淀检测法n1. 原理原理n利用抗原利用抗原—抗体凝集反应。

抗体凝集反应n用于检测分泌型产物用于检测分泌型产物n2. 方法方法n把非放射性抗体加到平板培养基中，当把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈沉淀圈”n对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）三、酶联免疫吸附测（三、酶联免疫吸附测（ELISA））nEnzyme-linked immunosorbant assayn1. 原理原理n一抗（一抗（primary antibody）） 与目标分子的特异结合与目标分子的特异结合 n二抗（二抗（secondary antibody）） 与一抗的特异性结合与一抗的特异性结合 n酶连（酶连（enzyme-linke）） n 二抗上携带一种酶能催化一种反应将无二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。

从而推测目标分子的含量待测基因产物蛋白待测基因产物蛋白一抗一抗二抗二抗酶酶 待测基因产物蛋白待测基因产物蛋白 一抗一抗二抗二抗无色的底物无色的底物有色的产物有色的产物比色观察酶酶 2. ELISA检测的一般步骤检测的一般步骤n（（1）固定样品）固定样品n将待测样品加入将待测样品加入96孔微量滴定板孔微量滴定板（（microtiter plate）的孔中，干燥后就）的孔中，干燥后就被固定在孔底被固定在孔底孔底孔底（（2）一抗结合）一抗结合n加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体加入一抗，反应后冲洗掉未结合的抗体一抗一抗（（3）二抗结合）二抗结合n加入二抗，与一抗结合后再将未结合的加入二抗，与一抗结合后再将未结合的二抗冲洗掉二抗只识别一抗二抗冲洗掉二抗只识别一抗n二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧二抗上联着一种酶（碱性磷酸酶、过氧化物酶、脲酶等）化物酶、脲酶等）二抗二抗（（4）显色反应）显色反应n加入无色的底物，被二抗上所带的酶催加入无色的底物，被二抗上所带的酶催化反应转变成有色物质（或发光）化反应转变成有色物质（或发光）图图 ELISA assay（（5）比色）比色n在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，在特殊的分光光度仪（酶标仪）上比色，打印出结果。

打印出结果图图 Safire多功能扫描型酶标仪多功能扫描型酶标仪3.ELISA的局限性的局限性n有效，但准确性稍差（主要取决于一抗有效，但准确性稍差（主要取决于一抗的特异性）的特异性） n必须与其他方法一起综合考虑必须与其他方法一起综合考虑n最好用单克隆抗体（最好用单克隆抗体（monoclonal antibody））临床检验常用的单抗临床检验常用的单抗四、免疫印迹法（四、免疫印迹法（western blotting））n在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带的方法检测胶上的蛋白质泳带n1.原理原理n（（1））SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 （（SDS-PAGE））n①① SDSn是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷n②② 聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE））（（Polyacrylamide gel electrophoresis））n在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极移动，移动的速率主要取决于其分子量大小中向正极移动，移动的速率主要取决于其分子量大小（链的长短），从而把不同分子量的肽链分开。

链的长短），从而把不同分子量的肽链分开电泳电泳buffer电泳电泳buffer图 电泳槽 点样点样电泳方向电泳方向图n③③蛋白质电泳的分子量标准蛋白质电泳的分子量标准n已知分子量的蛋白质混合液，与待测样已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋白质提供分子量品一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计n商品化供应商品化供应n道尔顿道尔顿(质量单位质量单位, 等于一氧原子质量的等于一氧原子质量的十六分之一十六分之一 n一克约为一克约为6×1023道尔顿道尔顿Dalton④④凝胶中的蛋白质染色：凝胶中的蛋白质染色：n1）直接染色）直接染色n考马斯亮蓝：考马斯亮蓝： 灵敏度底、只能检出灵敏度底、只能检出>0.3-1μg/带，但可带，但可褪色回收褪色回收 n硝酸银：硝酸银： 灵敏度高、可检出灵敏度高、可检出2-5ng/带n2）转到膜上进行染色转到膜上进行染色图 直接染色电泳结果（（2））Western blottingn①① Western（转膜）（转膜）n电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、膜、中性尼龙膜等）中性尼龙膜等）n胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移到正极一侧的膜上移到正极一侧的膜上膜膜胶胶蛋白蛋白图 Western装置②② Blottingn原理与原理与ELISA相同。

相同n辣根过氧化物酶：辣根过氧化物酶：HRPO待测蛋白待测蛋白硝酸纤硝酸纤 维素膜维素膜一抗一抗 二抗二抗辣根过氧辣根过氧 化物酶化物酶底物底物产物，产物， 并发出光并发出光PAGE胶胶待测蛋白待测蛋白底片曝光底片曝光③③ Blotting过程过程n1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体））先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与与 膜上的蛋白结合膜上的蛋白结合n2）洗去未结合的一抗洗去未结合的一抗n3）用二抗与一抗结合（二抗上带有）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）n4）清洗掉未结合的二抗清洗掉未结合的二抗n5）用）用HRPO的底物浸泡膜的底物浸泡膜n6）暗室里曝光，冲洗胶片暗室里曝光，冲洗胶片Immuno Blotting④④结果结果图 单抗blotting结果图 多克隆抗体Blotting的结果第六节第六节 翻译筛选法翻译筛选法 n借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载体上的外源基因的转录，所选择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选其产物是否符合预期来筛选其产物是否符合预期n适用于适用于mRNA转录丰度高的外源基因转录丰度高的外源基因。

一、无细胞翻译系统一、无细胞翻译系统n能把外源的能把外源的mRNA翻译成蛋白质的细胞翻译成蛋白质的细胞提取物 如：麦胚提取物系统、网织红如：麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统细胞提取物系统二、转译筛选二、转译筛选n与预期的产物分子量相符？与预期的产物分子量相符？mRNA无细胞翻译系统无细胞翻译系统35S标记的标记的 甲硫氨酸甲硫氨酸翻译翻译35S标记的肽链标记的肽链PAGE电泳电泳放射自显影放射自显影比较放射性比较放射性 带纹的位置带纹的位置载体载体+外源外源DNA转录转录三、杂交抑制转译法三、杂交抑制转译法n1. 原理原理nmRNA一旦与一旦与DNA杂交成杂交成RNA-DNA双双链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）译被抑制）单链单链mRNA核糖体核糖体 小亚基小亚基核糖体核糖体 大亚基大亚基能翻译能翻译mRNADNA核糖体核糖体 小亚基小亚基核糖体核糖体 大亚基大亚基不能翻译不能翻译2. 过程过程四、杂交释放转译法四、杂交释放转译法n1. 原理原理n在高甲酰胺溶液中载体上克隆的在高甲酰胺溶液中载体上克隆的cDNA与它的与它的mRNA杂交吸附，然后洗脱，释杂交吸附，然后洗脱，释放出与它对应的放出与它对应的mRNA，进行体外转录。

进行体外转录 研究其转录产物的性质是否是预期的基研究其转录产物的性质是否是预期的基因产物（如分子量、免疫源性等）因产物（如分子量、免疫源性等）2. 过程过程硝酸纤硝酸纤 维素滤膜维素滤膜载体和插载体和插 入的入的cDNA总总mRNAcDNA基因的基因的 mRNA杂交杂交洗脱洗脱cDNA基因的基因的 mRNA体外翻译体外翻译cDNA编编码的蛋白码的蛋白电泳电泳凝胶放射自显影凝胶放射自显影cDNA编编 码的蛋白码的蛋白硝酸纤硝酸纤 维素滤膜维素滤膜载体和插载体和插 入的入的cDNA硝酸纤硝酸纤 维素滤膜维素滤膜载体和插载体和插 入的入的cDNA收集收集35S标记的氨基酸标记的氨基酸五、五、DNA-蛋白质相互作用筛选法蛋白质相互作用筛选法n专门设计检测能同专门设计检测能同DNA特异结合的蛋白特异结合的蛋白质因子待测蛋白质待测蛋白质硝硝 酸酸 纤纤 维维 素素 滤滤 膜膜能与蛋白质结能与蛋白质结 合的合的DNA序列序列放射性标记放射性标记待测蛋白质待测蛋白质硝硝 酸酸 纤纤 维维 素素 滤滤 膜膜能与蛋白质结能与蛋白质结 合的合的DNA序列序列放射性标记放射性标记第七节第七节 真核重组基因的选择方法真核重组基因的选择方法n一、哺乳动物基因转移的选择标记一、哺乳动物基因转移的选择标记n1. 胸苷激酶（胸苷激酶（thymidine kinase, tk））n（（1））TK选择原理选择原理n①①四氢叶酸的必要性四氢叶酸的必要性n真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基。

供甲基二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶dihydrofolate reductase，，DHFR二氢叶酸二氢叶酸四氢叶酸四氢叶酸DHFRn②②氨甲喋啉（氨甲喋啉（Methotrexate）的抑制作）的抑制作用用n氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似氨甲喋啉（或氨基喋啉）是叶酸的类似物 能抑制二氢叶酸还原酶，从而阻断能抑制二氢叶酸还原酶，从而阻断dATP、、dCTP和和dTTP的合成：的合成：dUMP dATP TTP dCTP 氨甲喋啉氨甲喋啉 抑制抑制 抑制抑制 n③③次黄嘌呤的补救作用次黄嘌呤的补救作用n细胞可以利用次黄嘌呤合成细胞可以利用次黄嘌呤合成dATP和和dCTPn④④胸苷酸激酶的补救作用胸苷酸激酶的补救作用nTK+细胞能产生胸苷酸激酶，所以可以细胞能产生胸苷酸激酶，所以可以利用培养基中的胸苷（利用培养基中的胸苷（T）合成）合成TTP，，存活TtkdUMP dATP TTP dCTP 次黄嘌呤次黄嘌呤 补救补救 氨甲喋啉氨甲喋啉 抑制抑制 抑制抑制 （（2））TK选择过程选择过程n①① HAT培养基培养基 含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培养含次黄嘌呤、氨基喋啉和胸苷的培养基基(hypoxanthine，，aminopterin，，thiymidine））n②② 宿主细胞宿主细胞 Tk- 细胞株细胞株n③③ 载体标记载体标记 TK基因，只有转入基因，只有转入TK基因的细胞才基因的细胞才能生存。

能生存2. 二氢叶酸还原酶基因二氢叶酸还原酶基因（（DHFR））n（（1）） 选择原理选择原理n①①二氢叶酸还原酶的必要性二氢叶酸还原酶的必要性n真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提真核细胞核苷酸的合成需要四氢叶酸提供甲基dUMPdATPTTPdCTP四氢叶酸四氢叶酸四氢叶酸四氢叶酸二氢叶酸还原酶合成四氢叶酸二氢叶酸还原酶合成四氢叶酸二氢叶酸二氢叶酸四氢叶酸四氢叶酸二氢叶酸还原酶二氢叶酸还原酶DHFR+细胞细胞nDHFR+细胞能产生二氢叶酸还原酶，细胞能产生二氢叶酸还原酶，所以能合成四氢叶酸所以能合成四氢叶酸n能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存生存n不需要补救！不需要补救！DHFR- 细胞细胞nDHFR- 细胞不能产生二氢叶酸还原酶，细胞不能产生二氢叶酸还原酶，所以不能合成四氢叶酸所以不能合成四氢叶酸n不能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基不能在无胸腺嘧啶和次黄嘌呤的培养基中生存n需要补救！需要补救！n②② 胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救n无四氢叶酸提供甲基，无四氢叶酸提供甲基，dNTP合成受阻合成受阻时，时，n胸腺嘧啶和次黄嘌呤分别补救胸腺嘧啶和次黄嘌呤分别补救:dUMPdATPTTPdATP次黄嘌呤次黄嘌呤补救补救胸苷胸苷补救补救（（2）选择过程）选择过程n①① 宿主细胞宿主细胞nDHFR-细胞株（不能在无核苷酸的培养细胞株（不能在无核苷酸的培养基中生长）。

基中生长）n需要胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救！需要胸腺嘧啶和次黄嘌呤补救！n②② 无核苷酸的培养基无核苷酸的培养基n透析除去血清中的内源性核苷酸，以免透析除去血清中的内源性核苷酸，以免补救n③③ 氨甲喋呤氨甲喋呤“加压加压” n添加少量氨甲喋啉抑制内源性添加少量氨甲喋啉抑制内源性DHFR的的补救作用，可提高选择补救作用，可提高选择nDHFR+基因n只有转入只有转入DHFR+基因的细胞才能生存基因的细胞才能生存无核苷酸的培养基无核苷酸的培养基DHFR-DHFR-DHFR+DHFR+livedie3. 新霉素抗性基因（新霉素抗性基因（neor））n（（1）选择原理）选择原理n①① 新霉素（新霉素（neomycin））n是细菌抗生素，干扰细菌的核糖体，使是细菌抗生素，干扰细菌的核糖体，使细菌的蛋白质合成不能正常进行，但不细菌的蛋白质合成不能正常进行，但不影响真核生物影响真核生物n②② G418（（geneticin））n新霉素的类似物，是一种新霉素的类似物，是一种 氨基糖苷，对氨基糖苷，对真核细胞和原核细胞都有毒性真核细胞和原核细胞都有毒性n③③ 新霉素抗性基因新霉素抗性基因—neorn细菌的新霉素抗性基因（细菌的新霉素抗性基因（neor）编码一）编码一种磷酸转移酶（种磷酸转移酶（APH），能使），能使G418失失活。

活G418真核细胞真核细胞死亡死亡G418存活存活neor真核细胞真核细胞（（2）选择过程）选择过程n①① G418培养基培养基n含致死剂量含致死剂量G418的完全培养基的完全培养基nG418：（：（100-800 g/mL））n②②宿主细胞宿主细胞n真核细胞株均可真核细胞株均可n③③载体标记载体标记nneor基因4. 氯霉素乙酰转移酶（氯霉素乙酰转移酶（CAT））nchloramphenicol acetyl transferasen（（1）选择原理）选择原理nCAT是由大肠杆菌转座子是由大肠杆菌转座子Tn9编码的，编码的，催化氯霉素发生乙酰化失活催化氯霉素发生乙酰化失活氯霉素氯霉素cat乙酰氯霉素乙酰氯霉素n（（2）） 选择条件选择条件n含氯霉素的完全培养基含氯霉素的完全培养基n（（3）） 宿主细胞宿主细胞n真核细胞株均可真核细胞株均可n（（4）载体标记）载体标记ncat基因（（5）） CAT分析方法分析方法n①① 分析乙酰氯霉素分析乙酰氯霉素n在转化的细胞提取物中测定是否有乙酰氯霉在转化的细胞提取物中测定是否有乙酰氯霉素n用抗用抗CAT的血清进行的血清进行Western blot或或ELISA，，检查检查CAT的表达。

的表达nAnti-CAT Antiserum is available from Invitrogen. nOther kits to assay for CAT protein nusing ELISA assay are available from Roche Molecular Biochemicals and Molecular Probes.二、植物转化体报道基因筛选法二、植物转化体报道基因筛选法n1. 报道基因（报道基因（reporter gene)n（（1））大肠杆菌的大肠杆菌的β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶葡萄糖醛酸糖苷酶 n （（β-D-glucuronidase，，GUS）；）； n（（2）细菌和萤火虫的荧光素酶）细菌和萤火虫的荧光素酶 n （（luciferase）；）； n（（3）水母绿色荧光蛋白（）水母绿色荧光蛋白（GFP）基因）基因 n （（Green Fluorescent Protein）n（（4）其它）其它2. 几种报道基因的作用原理几种报道基因的作用原理GFP紫外光照紫外光照发绿色荧光发绿色荧光4-甲甲-β-D-葡糖醛酸葡糖醛酸荧光产物荧光产物GUS5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-β-D-葡糖醛酸葡糖醛酸蓝色水解产物蓝色水解产物GUSFireflies emit light catalyzed by luciferase with ATP转入萤火虫的转入萤火虫的luciferase的烟草的烟草烟草叶片表达烟草叶片表达B型肝炎抗原型肝炎抗原植物细胞中适用的报道基因植物细胞中适用的报道基因酶活性是否显性方法是否成熟新霉素磷酸转移酶显性成熟潮霉素磷酸转移酶显性成熟二氢叶酸还原酶显性成熟氯霉素乙酰基转移酶显性成熟庆大霉素乙酰基转移酶显性成熟胭脂碱合成酶隐性成熟章鱼碱合成酶隐性成熟植物细胞中适用的报道基因植物细胞中适用的报道基因β-D-葡萄糖苷酶隐性成熟链霉素磷酸转移酶显性成熟萤火虫荧光素酶隐性成熟细菌荧光素酶隐性成熟苏氨酸脱氢酶显性成熟磷酸肌醇乙酰转移酶显性成熟乙酰乳酸合酶显性不成熟绿色荧光蛋白显性成熟Bromoxynil 硝化酶显性不成熟5-enolpyruvylshikimate-3磷酸转移酶显性成熟n在麦康凯培养基上，在麦康凯培养基上，α-互补产生的互补产生的Lac+细菌，细菌，由于含由于含β-半乳糖苷酶，能分解培养基中的乳半乳糖苷酶，能分解培养基中的乳糖，产生乳酸，使糖，产生乳酸，使pH 下降，因而产生红色菌下降，因而产生红色菌落。

落n而当外源片段插入后，失去而当外源片段插入后，失去α-互补能力，因互补能力，因而不产生而不产生β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，因而产生白色菌落的乳糖，因而产生白色菌落n通过通过α-互补现象筛法，将重组质粒与自身环互补现象筛法，将重组质粒与自身环化的载体化的载体DNA 分开复习思考题复习思考题n1. 概念：（概念：（1）克隆）克隆（（2）转化）转化 （（3）转位（）转位（4）基因工程）基因工程 （（6）限制性）限制性核酸内切酶核酸内切酶7）载体（）载体（8））G文库（文库（9）质）质粒（粒（10））c文库文库n2. 简述基因工程的基本过程简述基因工程的基本过程n3. 简述获得目的基因的主要方法简述获得目的基因的主要方法。