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1、重组体筛选与鉴定重组体筛选与鉴定 转化（转化（transformation)transformation)： 是将异源是将异源DNADNA分子引入一细胞株系，使受体细胞获分子引入一细胞株系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究得新的遗传性状的一种手段，是基因工程等研究领域的基本实验技术。领域的基本实验技术。重组质粒的转化重组质粒的转化转化方法转化方法1 1、化学的方法、化学的方法( (热击法热击法) )；使用化学试剂（如；使用化学试剂（如CaClCaCl）制备的感受态细胞，通过热击处理将载）制备的感受态细胞，通过热击处理将载体体DNADNA分子导入受体细胞；分子导入受体细胞；
2、2 2、电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受、电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将载体态细胞，通过高压脉冲的作用将载体DNADNA分子导分子导入受体细胞。入受体细胞。重组质粒的转化重组质粒的转化（热激法）（热激法）1、冰上融化感受态细胞；2、将10ul连接产物加入到100ul感受态细胞，冰浴40min；3、42热激90s，勿摇动！4、热激后立马放置冰上1-2min；5、加400ulLB液体培养基，置摇床，37，70-100rpm 1h；6、涂平板。 大肠杆菌感受态细胞的制备、大肠杆菌感受态细胞的制备、重组质粒的转化及克隆的筛选与鉴定重组质粒的转化及克隆的筛选
3、与鉴定 感受态细胞感受态细胞(competent cells):(competent cells): 受体细胞经过一些特殊的方法（如Cacl2、Rucl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞(competent cell)。 原理目前，感受态细胞的制备常用冰预冷的CaCl2处理细菌的方法制备，即用低渗CaCl2溶液在低温（0）时处理快速生长的细菌，从而获得感受态细菌。此时细菌膨胀成球形，外源DNA分子在此条件下易形成抗DNA酶的羟基钙磷酸复合物粘附在细菌表面，通过热激作用促进细胞对DNA的吸收。在一定条件下，经过连接后的片段与感受态细
4、胞混合保温，可以进入感受态细胞。进入感受态细胞的分子通过复制、表达，实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，即可筛选出转化体，即带有异源分子的受体细胞。 试剂：1.LB固体和液体培养基。2.含特定抗生素的LB固体培养基。3.100mM CaCl2溶液。4.含15%甘油的0.05mol/L CaCl2: 称取0.28g CaCl2(无水,分析纯),溶于50ml重蒸水中,加入15ml甘油,定容至100ml,高压灭菌。5. 待转化质粒。 实验步骤1.挑取一DH5单菌落于5ml LB培养液中37过夜培养 2.取其中500ul菌液于一含50mlLB培养液的
5、锥形瓶中，37振摇培养至OD600值达到0.5-0.6之间 3. 取50ml菌液置于离心管内，4 4500g离心5分钟4. 加入30ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液，摇荡重悬细胞，冰浴30分钟5. 4 4500g离心5分钟收集细胞后，加2 ml ,100mM的冰冷CaCl2溶液轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。 6.感受态细胞分装成200l的小份,暂且不用的贮存于-70可保存半年。 取其中一份进行转化。7. 向转化管中加入DNA（不超过10ul）,轻度摇晃混合后于冰上放置30分钟。8. 将上述混合物转移到预热到42的水浴锅中，热休克90秒 (不要摇动试管)，然后将试管迅速
6、转移到冰浴，冷却12分钟。9. 向管内加入800ul的LB培养液。然后37 培养45分钟。10. 取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素的LB固体平板上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀。室温放置几分钟11. 倒置平板于37 培养1216个小时。四、实验注意事项为了提高转化效率, 实验中要考虑以下几个重要因素： 1. 细胞生长状态和密度: 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600 来控制。2. 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5。 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2
7、 等均需是最高纯度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干燥的冷暗处。4. 防止杂菌和杂DNA的污染：整个操作过程均应在无菌条件下进行。 克隆的筛选与鉴定克隆的筛选与鉴定 不同抗生素基因筛选不同抗生素基因筛选 常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等；将经过转化后的细胞在选择性培养基中培养，才能较容易地筛选出转化体，即带有异源DNA分子的受体细胞。否则，如果将转化后的菌液涂在无选择性抗生素的培养基平板上，会出现成千上万的细菌菌落，将难以确认哪一个克隆含有转化的质粒。虽然只有那些含有被转化质粒的细菌才能在含有抗生素的平板上生长和繁殖，但对于连接混合物而言，此时
8、并不能确定哪个克隆含有插入片段。一、抗药性标记及其插入失活选择法一、抗药性标记及其插入失活选择法pBR322质粒上有两个抗菌素抗性基因质粒上有两个抗菌素抗性基因: Tetr和和Ampr。 Tetr上有插入位点上有插入位点BamH I和和Sal I; Ampr上有插入位点上有插入位点Pst I。一一 载体表型选择法载体表型选择法1. 原理：原理：（1）四环素：）四环素：（2）氨苄青霉素抗性基因：）氨苄青霉素抗性基因：产生产生 -内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青内酰胺酶，使氨苄青霉素转变为青霉酮酸，使碘霉酮酸，使碘-青霉素指示液（青霉素指示液（I2-KI-Aampicillin）（）（蓝灰色）褪色。
9、蓝灰色）褪色。抑制细菌生长，但不杀死细菌。抑制细菌生长，但不杀死细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。杀死生长的细菌，但不杀死停止生长的细菌。（3）环丝氨酸：）环丝氨酸：3. 选择过程：选择过程：如果在如果在Tetr上插入外源上插入外源DNA，导致四导致四环素抗性基因失活，可用环素抗性基因失活，可用四环素加环四环素加环丝氨酸丝氨酸平板培养基选择重组克隆。平板培养基选择重组克隆。Tetr失活的菌生长被四环素抑制，不被环失活的菌生长被四环素抑制，不被环丝氨酸杀死，保留下来；丝氨酸杀死，保留下来； Tetr不失活的菌抗四环素，能分裂生长，不失活的菌抗四环素，能分裂生长，反而被环丝氨酸杀死。反
10、而被环丝氨酸杀死。（1）四环素抗性插入失活）四环素抗性插入失活无环丝氨酸培养基无环丝氨酸培养基（2）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程）氨苄青霉素抗性插入失活选择过程如果如果Ampr上插入外源上插入外源DNA，导致氨苄导致氨苄青霉素抗性基因失活，可用碘青霉素抗性基因失活，可用碘-青霉素青霉素指示液选择。指示液选择。利用插入的外源基因的利用插入的外源基因的表达产物表达产物特性进行直特性进行直接选择。（只在特定条件下）。接选择。（只在特定条件下）。转化进来的外源基因产物能够弥补受转化进来的外源基因产物能够弥补受体菌株的突变型缺陷。体菌株的突变型缺陷。一、原理：一、原理：二二 根据插入基因的表型选择根据
11、插入基因的表型选择1.弥补缺陷弥补缺陷his-his+受体菌：受体菌：外源基因：外源基因：在不含组氨酸的在不含组氨酸的培养基中生长培养基中生长小鼠的二轻叶酸还原酶（小鼠的二轻叶酸还原酶（DHFR）对三甲氧对三甲氧苄二氨嘧啶有抗性。苄二氨嘧啶有抗性。DHFR载体载体连接连接转化受转化受体菌体菌三甲氧苄二氨嘧三甲氧苄二氨嘧啶培养基平板啶培养基平板含含DHFR的克隆才能生长的克隆才能生长例：例：使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。使被转化的受体菌表现出外源基因的表型。2. 增加新性状增加新性状利用有插入片段的重组载体的分子量比利用有插入片段的重组载体的分子量比野生型载体分子量大。野生型载体分子量大
12、。一、直接电泳检测法一、直接电泳检测法从转化后的菌体克隆从转化后的菌体克隆中分离质粒，电泳、中分离质粒，电泳、比较其分子量。比较其分子量。三三 DNA电泳检测法电泳检测法 分子量分子量 Marker载体载体重重组组克克隆隆二、酶切电泳筛选法二、酶切电泳筛选法1. 原理：原理：根据已知的外源根据已知的外源DNA序列的限制性酶切序列的限制性酶切图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电图谱，选择一两种内切酶切割质粒，电泳后比较电泳结果（泳后比较电泳结果（DNA带数和长度）。带数和长度）。或用合适的内切酶切下插入片断，再用或用合适的内切酶切下插入片断，再用其它酶切这个片断，电泳后比较结果是其它酶切这个片断，
13、电泳后比较结果是否符合预计的结果。否符合预计的结果。ABA或或B筛选过程筛选过程筛选过程筛选过程三、三、PCR扩增检测法扩增检测法1. 原理原理PCR能在模板序列上扩增出预期能在模板序列上扩增出预期DNA片断。片断。2. 过程过程（1）从重组克隆中提取质粒（或）从重组克隆中提取质粒（或DNA）。）。（2）用外源）用外源DNA插入片断引物作插入片断引物作PCR。（3）电泳）电泳PCR产物。产物。（4）检查是否有）检查是否有PCR产物。产物。（5）PCR产物的长度是否与外源基因一致。产物的长度是否与外源基因一致。1. 核酸核酸杂交杂交四四 核酸杂交检测法核酸杂交检测法 一、原理：一、原理：重组克隆
14、与探针杂交。重组克隆与探针杂交。3. 识别标记识别标记32P 或或 125I 。（1）放射性同位素）放射性同位素2. 检测用的探针检测用的探针与外源与外源DNA插入片断互补的序列。插入片断互补的序列。（2）非放射性标记）非放射性标记荧光素荧光素二、核酸杂交检测方法二、核酸杂交检测方法用用DNA（或（或RNA）探针检测探针检测DNA样品。样品。1. Southern blotting从宿主细胞中提取从宿主细胞中提取DNA（或质粒载或质粒载体），再用探针杂交。体），再用探针杂交。只有带有插入片断的重组载体才能只有带有插入片断的重组载体才能与探针杂交，在底片上曝光显示。与探针杂交，在底片上曝光显示。
15、酶切前酶切前酶切后酶切后插入片断插入片断载体载体Southern blot 筛选筛选结果结果（1）原位杂交筛选）原位杂交筛选特点：特点：对应的菌斑或噬菌斑位置不变，对应的菌斑或噬菌斑位置不变，可以直接找出阳性菌落。可以直接找出阳性菌落。（2）R-环检测法环检测法DNA-RNA杂交。杂交。1）原理：）原理：2）选择过程）选择过程在在70%甲酰胺中，把甲酰胺中，把DNA双链变性，复双链变性，复性的时候，性的时候，DNA-RNA杂交分子比杂交分子比DNA-DNA双链更稳定。电镜下可见一种双链更稳定。电镜下可见一种R-环环形结构。形结构。用外源基因的用外源基因的mRNA与重组载体杂交。与重组载体杂交。
16、缺点：需要电镜！缺点：需要电镜！2. Northern blotting用用DNA（或（或RNA）探针检测探针检测RNA样品。样品。主要检测插入片主要检测插入片断是否被转录。断是否被转录。从宿主细胞中提从宿主细胞中提取取RNA，再用探再用探针杂交。针杂交。利用抗体作为利用抗体作为“探针探针”来检测转入受体菌来检测转入受体菌并且表达出相应的蛋白质的外源基因。并且表达出相应的蛋白质的外源基因。根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）根据第一抗体（一抗）和第二抗体（二抗）的性质可分为几种作用方式：的性质可分为几种作用方式：一、放射性抗体检测法一、放射性抗体检测法五五 免疫化学检测法免疫化学检测法 1.
17、 抗体与产物的结合方式抗体与产物的结合方式对表达产物的检测。蛋白对表达产物的检测。蛋白蛋白蛋白“杂交杂交” 待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗二抗二抗125I 标记的二标记的二 抗结合蛋白抗结合蛋白固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗125I标记的二抗标记的二抗固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗固相支固相支持滤膜持滤膜固相支固相支持滤膜持滤膜待测基因待测基因 产物蛋白产物蛋白一抗一抗 二抗二抗125I 标记的二抗标记的二抗 结合蛋白结合蛋白125I标记的二抗标记的二抗2. 放射性抗体检测法过程放射性抗体检测法过程3. Bro
18、ome-Gilbert双位点检测法双位点检测法质粒基因质粒基因A插入基因插入基因B表达表达质粒蛋白质粒蛋白A 外源蛋白外源蛋白B融合蛋白融合蛋白检测融合蛋白。检测融合蛋白。既检测外源基因产物又检测载体基因产物。既检测外源基因产物又检测载体基因产物。固相支固相支 持滤膜持滤膜抗抗A抗体抗体125I标记的标记的 抗抗B抗体抗体质粒蛋白质粒蛋白A 外源蛋白外源蛋白B质粒蛋白质粒蛋白A外源蛋白外源蛋白B固相支固相支 持滤膜持滤膜抗抗A抗体抗体发光，底片曝光发光，底片曝光二、免疫沉淀检测法二、免疫沉淀检测法把非放射性抗体加到平板培养基中，把非放射性抗体加到平板培养基中，当插入基因的表达产物被细菌分泌到当
19、插入基因的表达产物被细菌分泌到菌落周围时，就会与抗体反应形成菌落周围时，就会与抗体反应形成“沉淀圈沉淀圈”。1. 原理原理抗原抗原抗体凝集反应。抗体凝集反应。检测分泌型产物。检测分泌型产物。2. 方法方法对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行对于不能被分泌到菌体外的蛋白质可先进行原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。原位溶菌处理（溶菌酶、原噬菌体诱发）。三、酶联免疫吸附测定（三、酶联免疫吸附测定（ELISA）Enzyme-linked immunosorbant assay1. 原理：原理：一抗（一抗（primary antibody）: 与目标分子的特异结合。与目标分子的特异结合。 二抗（二
20、抗（secondary antibody）：）： 与一抗的特异性结合。与一抗的特异性结合。 酶连（酶连（enzyme-linke）： 二抗上携带一种酶能催化一种反应将无二抗上携带一种酶能催化一种反应将无色的底物转变为有色的物质（或发光），再色的底物转变为有色的物质（或发光），再通过比色测定有色物质的含量（或光强度），通过比色测定有色物质的含量（或光强度），从而推测目标分子的含量。从而推测目标分子的含量。四、免疫印迹（四、免疫印迹（western blotting）法法1.1.原理：原理：在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方在蛋白质凝胶电泳以后，用转膜和免疫的方法检测胶上的蛋白质泳带。法检测胶
21、上的蛋白质泳带。（1）SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳聚丙烯酰胺凝胶电泳 是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的是蛋白质的变性剂，使煮沸变性的蛋白质维持线性状态，并与蛋白质蛋白质维持线性状态，并与蛋白质结合，使蛋白质带上负电荷。结合，使蛋白质带上负电荷。 SDS:（SDS-PAGE）：）： 聚丙烯酰胺凝胶电泳（聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）：）：（Polyacrylamide gel electrophoresis）在电场的作用下线性在电场的作用下线性蛋白质链在聚丙烯酰蛋白质链在聚丙烯酰胺凝胶介质中向正极胺凝胶介质中向正极移动，移动的速率主移动，移动的速率主要取决于其分子量大要取决于其分子量大小（链的长短），
22、从小（链的长短），从而把不同分子量的肽而把不同分子量的肽链分开。链分开。电泳电泳buffer电泳电泳buffer点样点样电泳方向电泳方向蛋白质电泳的分子蛋白质电泳的分子量标准量标准已知分子量的蛋白质已知分子量的蛋白质混合液，与待测样品混合液，与待测样品一起电泳，为样品蛋一起电泳，为样品蛋白质提供分子量估计。白质提供分子量估计。商品化供应商品化供应Da道尔顿道尔顿( (质量单位质量单位, , 等于等于一氧原子质量的十六分一氧原子质量的十六分之一。之一。 一克约为一克约为6106102323道尔顿道尔顿DaltonSDS PAGE凝胶中的蛋白质染色：凝胶中的蛋白质染色：考马斯亮蓝：考马斯亮蓝： 灵
23、敏度底、只能检出灵敏度底、只能检出0.3-1g/带带，但可，但可褪色回收。褪色回收。 硝酸银：硝酸银： 灵敏度高、可检出灵敏度高、可检出2-5ng/带。带。2）转到膜上进行染色。）转到膜上进行染色。1）直接染色）直接染色直接染色电泳结果直接染色电泳结果（2）Western blotting电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，电泳胶里的蛋白质带可以用电转的方法，转到膜上（硝酸纤维素膜、转到膜上（硝酸纤维素膜、PVDF膜、膜、中性尼龙膜等）。中性尼龙膜等）。 Western（转膜）转膜）胶里的蛋白质带在电胶里的蛋白质带在电场的作用下横向转移场的作用下横向转移到正极一侧的膜上。到正极一侧的膜上。膜膜
24、胶胶蛋白蛋白Western装置装置 Blotting原理与原理与ELISA相同。相同。待测蛋白待测蛋白硝酸纤硝酸纤 维素膜维素膜一抗一抗 二抗二抗辣根过氧辣根过氧 化物酶化物酶底物底物产物，产物， 并发出光并发出光PAGE胶胶待测蛋白待测蛋白底片曝光底片曝光辣根过氧化物酶：辣根过氧化物酶：HRPO1）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与）先用一抗（待测蛋白的单克隆抗体）与 膜上的蛋白结合。膜上的蛋白结合。2）洗去未结合的一抗。）洗去未结合的一抗。3）用二抗与一抗结合（二抗上带有）用二抗与一抗结合（二抗上带有HRPO）。）。4）清洗掉未结合的二抗。）清洗掉未结合的二抗。5）用）用HRPO的底物浸泡
25、膜。的底物浸泡膜。6）暗室里曝光，冲洗胶片。）暗室里曝光，冲洗胶片。 Blotting过程过程Immuno Blotting结果结果多克隆抗体多克隆抗体Blotting的的结果结果单抗单抗blotting结果结果一、无细胞翻译系统一、无细胞翻译系统第六节第六节 转译筛选法转译筛选法 能把外源的能把外源的mRNA翻译成蛋白质的细胞提翻译成蛋白质的细胞提取物。取物。 如：麦胚提取物系统、网织红细胞如：麦胚提取物系统、网织红细胞提取物系统。提取物系统。借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选借助无细胞翻译系统，通过表达或抑制所选择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛选择的克隆载体上的外源基因的转录，来筛
26、选其产物是否符合预期。其产物是否符合预期。适用于适用于mRNA转录丰度高的外源基因。转录丰度高的外源基因。二、转译筛选二、转译筛选mRNA无细胞翻译系统无细胞翻译系统35S标记的标记的 甲硫氨酸甲硫氨酸翻译翻译35S标记的肽链标记的肽链PAGE电泳电泳放射自显影放射自显影比较放射性比较放射性 带纹的位置带纹的位置载体载体+外源外源DNA转录转录与预期的产物与预期的产物分子量相符？分子量相符？三、杂交抑制转译法三、杂交抑制转译法mRNA一旦与一旦与DNA杂交成杂交成RNA-DNA双链双链后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被后就不能被核糖体翻译出蛋白质（转译被抑制）。抑制）。1. 原理原理2. 过
27、程过程专门设计检测能同专门设计检测能同DNA特异结合的蛋特异结合的蛋白质因子。白质因子。待测蛋白质待测蛋白质硝硝 酸酸 纤纤 维维 素素 滤滤 膜膜能与蛋白质结能与蛋白质结 合的合的DNA序列序列放射性标记放射性标记待测蛋白质待测蛋白质硝硝 酸酸 纤纤 维维 素素 滤滤 膜膜能与蛋白质结能与蛋白质结 合的合的DNA序列序列放射性标记放射性标记五、五、DNA-蛋白质相互作用筛选法蛋白质相互作用筛选法一般克隆与筛选策略一般克隆与筛选策略二、植物转化体报道基因筛选法二、植物转化体报道基因筛选法（1 1）大大肠肠杆菌的杆菌的-D-葡萄糖醛酸糖苷酶葡萄糖醛酸糖苷酶 （-D-glucuronidase，G
28、US）；）； （2 2）细菌和萤火虫的荧光素酶细菌和萤火虫的荧光素酶 （luciferase）；）； （3 3）水母绿色荧光蛋白（水母绿色荧光蛋白（GFP）基因基因 （Green Fluorescent Protein）。）。1. 报道基因（报道基因（reporter gene)（4 4）其它）其它2. 几种报道基因的作用原理几种报道基因的作用原理4-甲甲-D-葡糖醛酸葡糖醛酸荧光产物荧光产物GUSGFP紫外光照紫外光照发绿色荧光发绿色荧光5-溴溴-4-氯氯-3-吲哚吲哚-D-葡糖醛酸葡糖醛酸蓝色水解产物蓝色水解产物GUSFireflies emit light catalyzed by lu
29、ciferase with ATP转入萤火虫转入萤火虫的的luciferase的烟草的烟草 半乳糖苷酶系统筛选（蓝半乳糖苷酶系统筛选（蓝/ /白斑筛选）白斑筛选） -互补现象：互补现象： 因为许多载体都带有一个半乳糖苷酶半乳糖苷酶（LacZ）基因的调控序列和头146个氨基酸的编码信息，编码-互补肽，该肽段能与宿主编码的缺陷型-半乳糖苷酶实现基因内互补（ -互补）。当这种载体转入可编码半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞中时，在异丙基-D硫代半乳糖苷（IPTG）的诱导下，宿主可同时合成这两种肽段，虽然它们各自都没有酶活性，但它们可以融为一体形成具有酶活性的蛋白质。所以称这种现象为-互补现象。 由互补
30、产生的半乳糖苷酶(LacZ)能够作用于生色底物5溴4氯3吲哚D半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会造成LacZ()基因的失活，破坏-互补作用，就不能产生具有活性的酶。所以，有重组质粒的菌落为白色，而没有重组质粒的菌落为蓝色。 -半乳糖苷酶使半乳糖苷酶使Xgal分解成兰色产物。分解成兰色产物。其他鉴定方法其他鉴定方法 鉴定带有重组质粒克隆的方法常用的有-互补、小规模制备质粒DNA进行酶切分析、插入失活、PCR以及杂交筛选的方法。最常用的方法是小规模制备质粒DNA进行酶切分析，对于带有LacZ基因的载体还可以结合-互补现象来筛选。
