细胞工程主要技术

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1、细胞工程主要技术细胞工程主要技术2动物物细胞工程主要技胞工程主要技术l第一章第一章动物物细胞胞转化（化（诱变）l第二章第二章细胞融合技胞融合技术l第三章第三章哺乳哺乳动物克隆技物克隆技术l第四章第四章哺乳哺乳动物胚胎培养与移植物胚胎培养与移植l利用利用杂交瘤制交瘤制备单克隆抗体技克隆抗体技术l干干细胞技胞技术3第一章第一章 动物细胞的转化（诱变）动物细胞的转化（诱变）通通通通过过过过细细细细胞胞胞胞培培培培养养养养，世世世世界界界界上上上上已已已已建建建建立立立立了了了了大大大大量量量量细细细细胞胞胞胞株株株株，我我我我国国国国业业业业已已已已建立了上百个细胞株，为细胞生物学和医学做出了重大贡

2、献。建立了上百个细胞株，为细胞生物学和医学做出了重大贡献。建立了上百个细胞株，为细胞生物学和医学做出了重大贡献。建立了上百个细胞株，为细胞生物学和医学做出了重大贡献。正正正正常常常常组组组组织织织织的的的的初初初初级级级级培培培培养养养养物物物物，在在在在传传传传代代代代培培培培养养养养过过过过程程程程中中中中，细细细细胞胞胞胞的的的的寿寿寿寿命命命命有有有有一一一一定定定定的的的的限限限限度度度度，只只只只有有有有癌癌癌癌细细细细胞胞胞胞和和和和发发发发生生生生转转转转化化化化的的的的细细细细胞胞胞胞才才才才能能能能无无无无限限限限增增增增殖下去。殖下去。殖下去。殖下去。所所所所谓谓谓谓转化

3、即即即即是是是是指指正正常常细细胞胞在在某某种种因因子子的的作作用用下下发发生生突突变变而成为具有癌特性的细胞。而成为具有癌特性的细胞。4建建立立无无限限细细胞胞系系的的关关键键就就是是要要千千方方百百计计地地使使培培养养细细胞胞发发生生转转化化，即即用用某某种种因因子子刺刺激激正常细胞发生突变而具有癌特性。正常细胞发生突变而具有癌特性。目目前前，使使正正常常培培养养细细胞胞发发生生转转化化的的刺刺激激因因子子主主要要有有三三大大类类：物物理理因因子子、化化学学因因子子和和生物因子。生物因子。5（一）物理因子（一）物理因子能使培养细胞发生转化的能使培养细胞发生转化的能使培养细胞发生转化的能使培

4、养细胞发生转化的物理因子主要是指物理因子主要是指物理因子主要是指物理因子主要是指一些电离辐射：一些电离辐射：一些电离辐射：一些电离辐射：放射性同位素的射线：放射性同位素的射线：放射性同位素的射线：放射性同位素的射线：60606060CoCoCoCo、14141414C C C C、131131131131I I I I、32323232P P P P、3 3 3 3H H H HX X 射线射线射线射线紫外线照射紫外线照射紫外线照射紫外线照射物物理理致致癌癌剂剂6（二）化学因子（二）化学因子对细胞具有转化作用的对细胞具有转化作用的对细胞具有转化作用的对细胞具有转化作用的化学因子达数千种之多，化

5、学因子达数千种之多，化学因子达数千种之多，化学因子达数千种之多，其中有无机物，也有有机物。其中有无机物，也有有机物。其中有无机物，也有有机物。其中有无机物，也有有机物。无机物：砷砷砷砷、石石石石棉棉棉棉、铬铬铬铬化化化化合合合合物物物物、镍镍镍镍化化化化合合合合物物物物、镉镉镉镉化化化化合合合合物物物物有机物：苯苯苯苯、联联联联苯苯苯苯胺胺胺胺、杂杂杂杂环环环环烃烃烃烃、煤煤煤煤焦焦焦焦油油油油、黄黄黄黄曲曲曲曲霉霉霉霉素素素素(aflatoxin)(aflatoxin)、亚硝胺、烟碱、亚硝胺、烟碱、亚硝胺、烟碱、亚硝胺、烟碱(nicotine)(nicotine) 化化学学致致癌癌剂剂7（三

6、）生物因子（三）生物因子对对对对细细细细胞胞胞胞具具具具有有有有转转转转化化化化作作作作用用用用的的的的生生生生物物物物因因因因子子子子为为为为肿肿肿肿瘤瘤瘤瘤病病病病毒毒毒毒(tumor (tumor virus)virus)， 又又又又 称称称称 致致致致 癌癌癌癌 病病病病 毒毒毒毒 (oncogenic (oncogenic virus)virus)。现现现现已已已已发发发发现现现现有有有有许许许许多多多多种种种种病病病病毒毒毒毒可可可可引引引引起起起起动动动动物物物物或或或或植植植植物物物物发发发发生生生生肿肿肿肿瘤瘤瘤瘤。肿肿肿肿瘤瘤瘤瘤病病病病毒毒毒毒中中中中有有有有DNADNA

7、病病病病毒毒毒毒，也也也也有有有有RNARNA病病病病毒。毒。毒。毒。 8RousRous肉瘤病毒(Rous (Rous sarcoma sarcoma virus)virus)：一一一一种种种种RNARNA病病病病毒毒毒毒，其其其其基基基基因因因因组组组组含含含含有有有有一一一一个个个个癌癌癌癌基基基基因因因因srcsrc，编编编编码码码码产产产产物物物物为为为为具具具具有有有有蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质激激激激酶酶酶酶活活活活性性性性的的的的pp60pp60srcsrc蛋蛋蛋蛋白白白白，可可可可使使使使许许许许多蛋白质磷酸化，通过级联反应，诱发细胞癌变。多蛋白质磷酸化，通过级联反应，诱发细胞

8、癌变。多蛋白质磷酸化，通过级联反应，诱发细胞癌变。多蛋白质磷酸化，通过级联反应，诱发细胞癌变。pp60pp60srcsrc蛋蛋蛋蛋白白白白是是是是一一一一种种种种膜膜膜膜蛋蛋蛋蛋白白白白，结结结结合合合合在在在在质质质质膜膜膜膜的的的的内内内内表表表表面面面面，它它它它可可可可催催催催化化化化磷磷磷磷酸酸酸酸根根根根转转转转移移移移到到到到一一一一些些些些蛋蛋蛋蛋白白白白质质质质的的的的酪酪酪酪氨氨氨氨酸酸酸酸残残残残基基基基上上上上，使使使使磷磷磷磷酸酸酸酸化化化化酪酪酪酪氨氨氨氨酸酸酸酸在在在在细细细细胞胞胞胞中中中中的的的的含含含含量量量量提提提提高高高高了了了了1010倍。倍。倍。倍。

9、9(Src(Src蛋白蛋白蛋白蛋白,Tyr,Tyr激酶激酶激酶激酶) )P PTyrTyr蛋白质磷酸化蛋白质磷酸化蛋白质磷酸化蛋白质磷酸化细胞癌变细胞癌变无活性无活性无活性无活性pp60pp60srcsrcRSV病毒中病毒中v-src基因的致癌机制图解基因的致癌机制图解质膜质膜质膜质膜跨膜受体蛋白跨膜受体蛋白跨膜受体蛋白跨膜受体蛋白细胞外配体细胞外配体细胞外配体细胞外配体活性活性活性活性p pp60p60srcsrc质膜质膜质膜质膜跨膜受体蛋白跨膜受体蛋白跨膜受体蛋白跨膜受体蛋白磷酸化酪氨酸两种作用：磷酸化酪氨酸两种作用：一是使细胞的正常调节一是使细胞的正常调节机制失调机制失调, ,细胞增殖失

10、去细胞增殖失去控制；控制；二是使细胞的粘着性丧二是使细胞的粘着性丧失失, ,易发生扩散和转移。易发生扩散和转移。 10虽虽虽虽然然然然动动动动物物物物细细细细胞胞胞胞在在在在培培培培养养养养皿皿皿皿、培培培培养养养养瓶瓶瓶瓶、培培培培养养养养板板板板中中中中均均均均可可可可生生生生长长长长，但但但但在在在在体体体体外外外外利利利利用用用用培培培培养养养养罐罐罐罐进进进进行行行行大大大大量量量量培培培培养养养养就就就就不不不不象象象象培培培培养养养养细细细细菌菌菌菌和酵母那样容易，是动物细胞培养的技术难题之一。和酵母那样容易，是动物细胞培养的技术难题之一。和酵母那样容易，是动物细胞培养的技术难题

11、之一。和酵母那样容易，是动物细胞培养的技术难题之一。目目目目前前前前这这这这一一一一问问问问题题题题已已已已经经经经解解解解决决决决，人人人人们们们们在在在在微微微微生生生生物物物物培培培培养养养养用用用用的的的的发发发发酵酵酵酵罐罐罐罐的的的的基基基基础础础础上上上上研研研研制制制制出出出出一一一一种种种种用用用用于于于于哺哺哺哺乳乳乳乳动动动动物物物物细细细细胞胞胞胞培培培培养养养养的的的的反反反反应应应应罐罐罐罐，用用用用以以以以大大大大量量量量培培培培养养养养悬悬悬悬浮浮浮浮细细细细胞胞胞胞（1 1个个个个振振振振动动动动搅搅搅搅拌拌拌拌器器器器：可可可可以以以以使使使使细胞得到充足的

12、营养和氧气）。细胞得到充足的营养和氧气）。细胞得到充足的营养和氧气）。细胞得到充足的营养和氧气）。转化动物细胞的规模化培养转化动物细胞的规模化培养11细细细细 胞胞胞胞 融融融融 合合合合 (Cell (Cell fusion)fusion)又又又又 称称称称 为为为为 细细细细 胞胞胞胞 杂杂杂杂 交交交交 (Cell (Cell hybridization)hybridization)，现现现现多多多多统统统统称称称称为为为为细细细细胞胞胞胞杂杂杂杂交交交交，是是是是指指指指2 2个个个个或或或或2 2个个个个以以以以上的细胞融合成上的细胞融合成上的细胞融合成上的细胞融合成1 1个细胞的过

13、程个细胞的过程个细胞的过程个细胞的过程。人人人人工工工工的的的的细细细细胞胞胞胞融融融融合合合合开开开开始始始始于于于于1950s1950s，此此此此后后后后作作作作为为为为一一一一门门门门新新新新兴兴兴兴技技技技术术术术发发发发展展展展非非非非常常常常快快快快，应应应应用用用用范范范范围围围围也也也也极极极极为为为为广广广广泛泛泛泛，不不不不仅仅仅仅同同同同种种种种类类类类细细细细胞胞胞胞间间间间可以融合，种间远缘细胞也能融合。可以融合，种间远缘细胞也能融合。可以融合，种间远缘细胞也能融合。可以融合，种间远缘细胞也能融合。 细胞工程的发展是建立在细胞融合基础上的细胞工程的发展是建立在细胞融合

14、基础上的细胞工程的发展是建立在细胞融合基础上的细胞工程的发展是建立在细胞融合基础上的。第二章第二章 细胞融合技术细胞融合技术12细细细细胞胞胞胞融融融融合合合合不不不不仅仅仅仅可可可可用用用用于于于于生生生生物物物物学学学学的的的的基基基基础础础础理理理理论论论论研研研研究究究究，而而而而且且且且在在在在生生生生产产产产实实实实践践践践上上上上还还还还有有有有重重重重要要要要的的的的应应应应用用用用价价价价值值值值，如如如如目目目目前前前前在在在在单单单单克克克克隆隆隆隆抗抗抗抗体体体体的的的的制制制制备备备备、核核核核质质质质关关关关系系系系、体体体体细细细细胞胞胞胞的的的的遗遗遗遗传传传传

15、和和和和发发发发育育育育、新新新新品品品品种种种种的的的的培培培培养养养养、免免免免疫疫疫疫作作作作用用用用、疾疾疾疾病病病病的的的的治治治治疗疗疗疗和和和和性性性性状状状状的的的的改改改改良、潜伏病毒的研究等，已取得了显著的成绩。良、潜伏病毒的研究等，已取得了显著的成绩。良、潜伏病毒的研究等，已取得了显著的成绩。良、潜伏病毒的研究等，已取得了显著的成绩。其中最突出的就是在制备其中最突出的就是在制备其中最突出的就是在制备其中最突出的就是在制备单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体单克隆抗体方面的应用！方面的应用！方面的应用！方面的应用！13根根根根据据据据所所所所用用用用促促促促融融融融剂剂剂剂的的的

16、的不不不不同同同同，细细细细胞胞胞胞融融融融合合合合技技技技术术术术主主主主要要要要可可可可分为四大类：分为四大类：分为四大类：分为四大类：病毒介导的细胞融合技术病毒介导的细胞融合技术病毒介导的细胞融合技术病毒介导的细胞融合技术化学介导的细胞融合技术化学介导的细胞融合技术化学介导的细胞融合技术化学介导的细胞融合技术电击介导的细胞融合技术电击介导的细胞融合技术电击介导的细胞融合技术电击介导的细胞融合技术激光介导的细胞融合技术激光介导的细胞融合技术激光介导的细胞融合技术激光介导的细胞融合技术14一、病毒介导的细胞融合技术一、病毒介导的细胞融合技术vv促促促促融融融融剂剂剂剂：麻麻麻麻疹疹疹疹病病病

17、病毒毒毒毒、副副副副流流流流感感感感病病病病毒毒毒毒、新新新新城城城城鸡鸡鸡鸡瘟瘟瘟瘟病病病病毒毒毒毒、仙仙仙仙台台台台病病病病毒毒毒毒以以以以及及及及其其其其他他他他一一一一些些些些副副副副粘粘粘粘液液液液科科科科的病毒的病毒的病毒的病毒vv基基基基本本本本原原原原理理理理：病病病病毒毒毒毒被被被被膜膜膜膜中中中中的的的的糖糖糖糖蛋蛋蛋蛋白白白白含含含含有有有有融融融融合合合合蛋蛋蛋蛋白白白白(fusion (fusion protein)protein), , 既既既既可可可可介介介介导导导导病病病病毒毒毒毒同同同同宿宿宿宿主主主主细细细细胞融合胞融合胞融合胞融合, , 又可诱导细胞与细胞

18、融合。又可诱导细胞与细胞融合。又可诱导细胞与细胞融合。又可诱导细胞与细胞融合。 操作繁琐；操作繁琐；操作繁琐；操作繁琐；促融效果较好促融效果较好促融效果较好促融效果较好15融融融融合合合合蛋蛋蛋蛋白白白白是是是是副副副副粘粘粘粘病病病病毒毒毒毒的的的的两两两两种种种种包包包包膜膜膜膜糖糖糖糖蛋蛋蛋蛋白白白白之之之之一一一一，其其其其主主主主要要要要功功功功能能能能是是是是引引引引起起起起病病病病毒毒毒毒包包包包膜膜膜膜与与与与靶靶靶靶细细细细胞胞胞胞膜膜膜膜或或或或被被被被感感感感染染染染的靶细胞膜之间发生融合。的靶细胞膜之间发生融合。的靶细胞膜之间发生融合。的靶细胞膜之间发生融合。细细细细胞

19、胞胞胞融融融融合合合合过过过过程程程程需需需需要要要要另另另另一一一一种种种种包包包包膜膜膜膜糖糖糖糖蛋蛋蛋蛋白白白白血血血血凝凝凝凝素素素素- - - -神神神神经经经经氨氨氨氨酸酸酸酸酶酶酶酶的的的的协协协协助助助助。融融融融合合合合蛋蛋蛋蛋白白白白需需需需要要要要和和和和同同同同源源源源性性性性血血血血凝凝凝凝素素素素- - - -神神神神经经经经氨氨氨氨酸酸酸酸酶酶酶酶共共共共同同同同表表表表达达达达才才才才能能能能显显显显示示示示出出出出融融融融合合合合细胞的活性。细胞的活性。细胞的活性。细胞的活性。 16病毒病毒病毒病毒增殖增殖增殖增殖紫外线灭活紫外线灭活紫外线灭活紫外线灭活稀释稀

20、释稀释稀释细胞悬液细胞悬液细胞悬液细胞悬液细胞融合细胞融合细胞融合细胞融合诱导诱导诱导诱导基本操作流程基本操作流程筛选筛选筛选筛选17二、化学介导的细胞融合技术二、化学介导的细胞融合技术聚乙二醇聚乙二醇聚乙二醇聚乙二醇(polyethyleneglycol(polyethyleneglycol，PEGPEG) )vv促融剂：促融剂：促融剂：促融剂：vv基基基基本本本本原原原原理理理理：一一一一般般般般认认认认为为为为，PEGPEG改改改改变变变变各各各各类类类类细细细细胞胞胞胞的的的的膜膜膜膜结结结结构构构构，使使使使两两两两细细细细胞胞胞胞相相相相互互互互接接接接触触触触部部部部位位位位的的

21、的的膜膜膜膜脂脂脂脂双双双双层层层层中中中中磷磷磷磷脂脂脂脂分分分分子子子子发发发发生生生生疏疏疏疏散散散散、进进进进而而而而使使使使其其其其结结结结构构构构发发发发生生生生重重重重排排排排，再再再再加加加加上上上上膜膜膜膜脂脂脂脂双双双双层层层层的的的的相相相相互互互互亲亲亲亲合合合合以以以以及及及及彼彼彼彼此此此此间间间间表表表表面面面面张张张张力力力力的的的的作作作作用用用用，引引引引起起起起相相相相临临临临的的的的重重重重排排排排质质质质膜膜膜膜在在在在修修修修复复复复时时时时相相相相互互互互合合合合并并并并在在在在一一一一起起起起, , 使使使使两两两两细细细细胞胞胞胞的的的的胞胞胞

22、胞质质质质沟通沟通沟通沟通, , 从而造成相互接触的细胞之间发生融合。从而造成相互接触的细胞之间发生融合。从而造成相互接触的细胞之间发生融合。从而造成相互接触的细胞之间发生融合。操作简便；操作简便；操作简便；操作简便；促融效果好促融效果好促融效果好促融效果好18诱导诱导基本操作流程基本操作流程A A细胞细胞细胞细胞融合细胞融合细胞B B细胞细胞细胞细胞A/BA/B细胞混合物细胞混合物细胞混合物细胞混合物按一定数量比例混合按一定数量比例混合与细胞混合物充分混匀与细胞混合物充分混匀与细胞混合物充分混匀与细胞混合物充分混匀一定温度、一定时间一定温度、一定时间一定温度、一定时间一定温度、一定时间计数计

23、数筛选筛选筛选筛选PEG配配制制：加加热热溶溶化化，按按体体积积比比加加入入预预热热至至50oC的的无无血血清清培培养养基基后后混混匀匀，降降温温至至使用温度待用使用温度待用PEGPEG配制配制配制配制PEG(MW1000-PEG(MW1000-4000,4060%)4000,4060%)19促促促促融融融融效效效效果果果果与与与与PEGPEG的的的的分分分分子子子子量量量量及及及及其其其其浓浓浓浓度度度度成成成成正正正正比比比比；但但但但PEGPEG分分分分子子子子量量量量越越越越大大大大、浓浓浓浓度度度度越越越越高高高高, , 对对对对细细细细胞胞胞胞的的的的毒毒毒毒性性性性也也也也就就就

24、就越越越越大大大大（在在在在实实实实验验验验时时时时常常常常常常常常采采采采用用用用的的的的分分分分子子子子量量量量1000400010004000的的的的PEGPEG，浓度一般为，浓度一般为，浓度一般为，浓度一般为4060%4060%）PEGPEG介导细胞融合效果的影响因素：介导细胞融合效果的影响因素：介导细胞融合效果的影响因素：介导细胞融合效果的影响因素：1. PEG1. PEG1. PEG1. PEG分子量与浓度分子量与浓度分子量与浓度分子量与浓度: : : :融融融融合合合合效效效效果果果果与与与与温温温温度度度度成成成成正正正正比比比比（质质质质膜膜膜膜流流流流动动动动性性性性与与与

25、与温温温温度度度度成成成成正正正正比比比比），为为为为获获获获得得得得最最最最佳佳佳佳融融融融合合合合效效效效果果果果, , 在在在在细细细细胞胞胞胞可可可可能能能能承承承承受受受受的的的的温温温温度度度度范范范范围围围围内内内内可可可可适适适适当当当当提提提提高高高高处处处处理理理理的的的的温温温温度度度度（哺乳动物细胞，一般采用（哺乳动物细胞，一般采用（哺乳动物细胞，一般采用（哺乳动物细胞，一般采用38403840）2. PEG2. PEG2. PEG2. PEG的的的的pHpHpHpH值值值值: : : :pH8.08.2pH8.08.2：融合效果较好：融合效果较好：融合效果较好：融合效

26、果较好3. PEG3. PEG3. PEG3. PEG作用时间作用时间作用时间作用时间: : : :处处处处理理理理时时时时间间间间越越越越长长长长，融融融融合合合合效效效效果果果果越越越越好好好好, , 但但但但对对对对细细细细胞胞胞胞的的的的毒毒毒毒害害害害也也也也就就就就越越越越大大大大（一一一一般般般般将将将将处处处处理理理理时时时时间间间间限限限限制制制制在在在在1min1min之内）之内）之内）之内）4. 4. 4. 4. 融合温度融合温度融合温度融合温度: : : :20三、电击介导的细胞融合技术三、电击介导的细胞融合技术操作简便、快速操作简便、快速操作简便、快速操作简便、快速/

27、 /促促促促融效果好融效果好融效果好融效果好/ /高回收率高回收率高回收率高回收率/ /对细胞毒性小对细胞毒性小对细胞毒性小对细胞毒性小原原理理：游游游游离离离离动动动动物物物物细细细细胞胞胞胞或或或或去去去去壁壁壁壁原原原原生生生生质质质质体体体体，在在在在电电电电融融融融合合合合室室室室中中中中，在在在在高高高高频频频频交交交交流流流流电电电电场场场场的的的的作作作作用用用用下下下下，细细细细胞胞胞胞被被被被极极极极化化化化成成成成偶偶偶偶极极极极子子子子，造造造造成成成成细细细细胞胞胞胞间间间间相相相相互互互互连连连连接接接接成成成成点点点点接接接接触触触触状状状状态态态态；然然然然后后

28、后后施施施施加加加加方方方方波波波波脉脉脉脉冲冲冲冲予予予予以以以以刺刺刺刺激激激激，由由由由于于于于电电电电脉脉脉脉冲冲冲冲的的的的瞬瞬瞬瞬间间间间作作作作用用用用，可可可可击击击击破破破破两两两两细细细细胞胞胞胞接接接接触触触触点点点点处处处处的的的的质质质质膜膜膜膜，此此此此时时时时质质质质膜膜膜膜的的的的脂脂脂脂类类类类分分分分子子子子发发发发生生生生重重重重组组组组，同同同同时时时时由由由由于于于于细细细细胞胞胞胞表表表表面面面面的的的的张张张张力力力力作作作作用，两个点接触细胞逐步发生细胞融合。用，两个点接触细胞逐步发生细胞融合。用，两个点接触细胞逐步发生细胞融合。用，两个点接触细

29、胞逐步发生细胞融合。BioRadBioRad电融合仪电融合仪电融合仪电融合仪21动物细胞动物细胞动物细胞动物细胞0.6M0.6M甘露醇，甘露醇，甘露醇，甘露醇，0.5mMCaC10.5mMCaC12 22H2H2 20 080-300V/cm,80-300V/cm,0.5-10.5-1兆赫兹兆赫兹兆赫兹兆赫兹, ,30-9030-90秒秒秒秒0.5-1.5KV/cm,0.5-1.5KV/cm,幅度脉宽幅度脉宽幅度脉宽幅度脉宽2525微秒微秒微秒微秒融合细胞融合细胞融合细胞融合细胞诱导诱导诱导诱导基本操作流程基本操作流程筛选筛选筛选筛选电击液电击液电击液电击液悬浮于悬浮于悬浮于悬浮于融合小室的电

30、极间融合小室的电极间融合小室的电极间融合小室的电极间加入至加入至加入至加入至细胞排列成串细胞排列成串细胞排列成串细胞排列成串电泳效应电泳效应电泳效应电泳效应正弦交变电场正弦交变电场正弦交变电场正弦交变电场施加施加施加施加2-32-3个脉冲电场个脉冲电场个脉冲电场个脉冲电场施加施加施加施加22原原理理：贴贴贴贴在在在在一一一一起起起起的的的的两两两两个个个个细细细细胞胞胞胞，用用用用高高高高峰峰峰峰值值值值功功功功率率率率密密密密度度度度激激激激光光光光对对对对细细细细胞胞胞胞接接接接触触触触处处处处的的的的质质质质膜膜膜膜进进进进行行行行辐辐辐辐照照照照，质质质质膜膜膜膜发发发发生生生生光光光

31、光击击击击穿穿穿穿，可可可可产产产产生生生生微微微微米米米米量量量量级级级级的的的的微微微微孔孔孔孔，因因因因质质质质膜膜膜膜上上上上的的的的微微微微孔孔孔孔可可可可逆逆逆逆，质质质质膜膜膜膜分分分分子子子子在在在在重重重重组组组组过过过过程程程程中中中中借借借借助助助助细细细细胞胞胞胞连连连连接接接接处处处处小小小小孔孔孔孔的的的的很很很很高高高高的的的的表表表表面面面面曲曲曲曲率而处于高张力状态，导致细胞发生融合。率而处于高张力状态，导致细胞发生融合。率而处于高张力状态，导致细胞发生融合。率而处于高张力状态，导致细胞发生融合。四、激光细胞融合技术四、激光细胞融合技术23激光细胞融合法与其它

32、化学物理方法相比较具有许多优点：激光细胞融合法与其它化学物理方法相比较具有许多优点：激光细胞融合法与其它化学物理方法相比较具有许多优点：激光细胞融合法与其它化学物理方法相比较具有许多优点：（1 1 1 1）能选择任意两个细胞之间进行融合；）能选择任意两个细胞之间进行融合；）能选择任意两个细胞之间进行融合；）能选择任意两个细胞之间进行融合；（2 2 2 2）因因因因仅仅仅仅在在在在两两两两个个个个细细细细胞胞胞胞的的的的接接接接触触触触点点点点照照照照射射射射激激激激光光光光，故故故故作作作作用用用用于细胞的应力和障碍小于细胞的应力和障碍小于细胞的应力和障碍小于细胞的应力和障碍小; ; ; ;（

33、3 3 3 3）可进行非接触、安全且远距离的无菌操作；）可进行非接触、安全且远距离的无菌操作；）可进行非接触、安全且远距离的无菌操作；）可进行非接触、安全且远距离的无菌操作；（4 4 4 4）能适时观察融合过程。）能适时观察融合过程。）能适时观察融合过程。）能适时观察融合过程。24第三章第三章第三章第三章 哺乳动物克隆技术哺乳动物克隆技术哺乳动物克隆技术哺乳动物克隆技术（细胞核移植技术）（细胞核移植技术）（细胞核移植技术）（细胞核移植技术） 25随随随随着着着着19971997年年年年2 2月月月月NatureNature杂杂杂杂志志志志报报报报道道道道英英英英国国国国RoslinRoslin

34、研研研研究究究究所所所所I.WilmutI.WilmutI.WilmutI.Wilmut等等等等人人人人创创创创造造造造的的的的克克克克隆隆隆隆羊羊羊羊多多多多莉莉莉莉(Dolly)(Dolly)诞诞诞诞生生生生，生物工程掀开了新的一页。生物工程掀开了新的一页。生物工程掀开了新的一页。生物工程掀开了新的一页。克克克克隆隆隆隆(clone)(clone)一一一一词词词词原原原原意意意意为为为为无无无无性性性性繁繁繁繁殖殖殖殖系系系系，在在在在体体体体外外外外培培培培养养养养的的的的细细细细胞胞胞胞中中中中早早早早有有有有使使使使用用用用，细细细细胞胞胞胞克克克克隆隆隆隆是是是是指指指指由由由由一

35、一一一个个个个细细细细胞胞胞胞经经经经细细细细胞胞胞胞分分分分裂裂裂裂而而而而产产产产生生生生出出出出的的的的一一一一群群群群细细细细胞胞胞胞，而而而而动动动动物物物物克克克克隆隆隆隆是是是是指指指指由由由由一一一一个个个个动动动动物物物物经经经经无无无无性性性性繁繁繁繁殖殖殖殖而而而而产产产产生生生生的的的的遗遗遗遗传传传传性性性性状状状状完完完完全全全全相相相相同同同同的的的的后代个体。后代个体。后代个体。后代个体。26克克克克隆隆隆隆羊羊羊羊“ “多多多多莉莉莉莉” ”诞诞诞诞生生生生后后后后，克克克克隆隆隆隆技技技技术术术术研研研研究究究究立立立立即即即即成成成成为为为为世世世世界界界

36、界各各各各国国国国生生生生物物物物学学学学家家家家竞竞竞竞相相相相开开开开展展展展的的的的生生生生物物物物学学学学高高高高新新新新技技技技术研究。术研究。术研究。术研究。克克克克隆隆隆隆技技技技术术术术之之之之所所所所以以以以一一一一经经经经产产产产生生生生立立立立即即即即引引引引起起起起高高高高度度度度重重重重视视视视，是是是是因因因因为为为为克克隆隆技技术术不不但但具具有有重重要要的的理理论论意意义义而而且且具具有良好的应用前景有良好的应用前景。 为什么要进行动物克隆?例：例：1997年，美国威斯康星州的一个奶牛年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一有一头叫叫卢辛达的奶牛，年辛达的奶牛，年产牛

37、奶牛奶30.8t，创造了世界奶牛造了世界奶牛产奶量最高的奶量最高的纪录；而一而一头普通奶牛的普通奶牛的产奶量年平均水平奶量年平均水平仅为3-4t，如果能用体，如果能用体细胞核移植技胞核移植技术，克隆，克隆高高产奶牛，就可以大大提高牛奶奶牛，就可以大大提高牛奶产量。量。29第一节第一节 哺乳动物克隆的发展历史哺乳动物克隆的发展历史同种胚胎细胞克隆同种胚胎细胞克隆同种体细胞克隆同种体细胞克隆异种体细胞克隆异种体细胞克隆克克克克隆隆隆隆动动动动物物物物技技技技术术术术的的的的发发发发展展展展已已已已经经经经历历历历了了了了6060余余余余年年年年的的的的漫漫漫漫长长长长探探探探索索索索，根根根根据据

38、据据供供供供体体体体细细细细胞胞胞胞核核核核与与与与去去去去核核核核卵卵卵卵细细细细胞胞胞胞的的的的来来来来源源源源可可可可归纳为归纳为归纳为归纳为3 3个标志性的发展阶段个标志性的发展阶段个标志性的发展阶段个标志性的发展阶段。3019381938年年年年, , 德国科学家德国科学家德国科学家德国科学家SpemannSpemann最早提出克隆设想最早提出克隆设想最早提出克隆设想最早提出克隆设想。19521952年年年年, , 美美美美国国国国科科科科学学学学家家家家BriggsBriggs和和和和KingKing将将将将发发发发育育育育后后后后期期期期的的的的青青青青蛙胚胎细胞核植入青蛙卵中蛙

39、胚胎细胞核植入青蛙卵中蛙胚胎细胞核植入青蛙卵中蛙胚胎细胞核植入青蛙卵中, , 没有发育。没有发育。没有发育。没有发育。19651965年年年年, , 中中中中国国国国科科科科学学学学家家家家童童童童第第第第周周周周完完完完成成成成了了了了金金金金鱼鱼鱼鱼核核核核移移移移植植植植并并并并获获获获得成功得成功得成功得成功。19811981年年年年, , IllmenseeIllmensee和和和和HoppeHoppe用用用用小小小小鼠鼠鼠鼠胚胚胚胚胎胎胎胎细细细细胞胞胞胞第第第第一一一一次次次次获得了获得了获得了获得了克隆小鼠克隆小鼠克隆小鼠克隆小鼠，但其实验未能被重复。，但其实验未能被重复。，但

40、其实验未能被重复。，但其实验未能被重复。19841984年年年年, , 丹丹丹丹麦麦麦麦科科科科学学学学家家家家WilladsenWilladsen用用用用胚胚胚胚胎胎胎胎细细细细胞胞胞胞克克克克隆隆隆隆羊羊羊羊获成功。获成功。获成功。获成功。第一阶段第一阶段 同种胚胎细胞克隆同种胚胎细胞克隆童第周童第周童第周童第周（1902-19791902-1979）童第周等童第周等( (1965) )将金鱼囊胚细将金鱼囊胚细胞核移植到鳑鮍的去核卵中胞核移植到鳑鮍的去核卵中, 获得了少数核质杂种获得了少数核质杂种( (nucleo-cytoplasmic hybrid, NCH) )幼鱼幼鱼3219901

41、99019901990年年年年, , , ,中中中中国国国国科科科科学学学学院院院院发发发发育育育育生生生生物物物物学学学学研研研研究究究究所所所所杜杜杜杜淼淼淼淼获获获获得得得得了了了了克克克克隆隆隆隆兔兔兔兔。 随随随随后后后后, , , ,中中中中国国国国科科科科学学学学家家家家利利利利用用用用胚胚胚胚胎胎胎胎细细细细胞胞胞胞相相相相继克隆成了继克隆成了继克隆成了继克隆成了羊、猪、牛、小鼠羊、猪、牛、小鼠羊、猪、牛、小鼠羊、猪、牛、小鼠等几种动物。等几种动物。等几种动物。等几种动物。1993199319931993年年年年, , , ,美美美美国国国国的的的的FirstFirstFirs

42、tFirst用用用用牛牛牛牛内内内内细细细细胞胞胞胞团团团团细细细细胞胞胞胞成成成成功功功功地地地地获获获获得了得了得了得了克隆牛克隆牛克隆牛克隆牛。1997199719971997年年年年, , , ,中国学者孟励在美国中国学者孟励在美国中国学者孟励在美国中国学者孟励在美国成功获得成功获得成功获得成功获得克隆猴克隆猴克隆猴克隆猴。 至此至此至此至此, , , ,国内外动物克隆采用的均为国内外动物克隆采用的均为国内外动物克隆采用的均为国内外动物克隆采用的均为胚胎细胞。胚胎细胞。胚胎细胞。胚胎细胞。331997199719971997年，用胚胎细胞获得的克隆猴年，用胚胎细胞获得的克隆猴年，用胚胎

43、细胞获得的克隆猴年，用胚胎细胞获得的克隆猴3419641964年年年年, Gurdon, Gurdon以爪以爪以爪以爪蟾为材料蟾为材料蟾为材料蟾为材料, , 最早进行了最早进行了最早进行了最早进行了体细胞核移植的尝试体细胞核移植的尝试体细胞核移植的尝试体细胞核移植的尝试, , 获得了获得了获得了获得了1.51.5的蝌蚪。的蝌蚪。的蝌蚪。的蝌蚪。第二阶段第二阶段 同种体细胞克隆同种体细胞克隆35Dolly 的的产生生19971997年年年年, ,英英英英国国国国罗罗斯斯斯斯林林林林研研研研究究究究所所所所I. I. WilmutWilmut等等等等宣宣宣宣布布布布用用用用成成成成年年年年羊羊羊羊

44、乳乳乳乳腺腺腺腺细细胞胞胞胞首首首首次次次次获获得得得得克克克克隆隆隆隆羊羊羊羊“ “多莉多莉多莉多莉” ”。实验成功的关成功的关键：血清血清饥饿法法 使使细胞核与去核卵胞核与去核卵细胞胞处于于细胞周期的同胞周期的同步状步状态, ,以利于恢复核的全能性以利于恢复核的全能性( (重重编程程).).3819981998年年，美美国国夏夏威威夷夷大大学学的的YanagimachiYanagimachi等等用用克克隆隆鼠鼠的的卵卵丘丘细细胞胞核核作作供供体体，获获得得了克隆再克隆小鼠。了克隆再克隆小鼠。19981998年年，新新西西兰兰成成功功地地克克隆隆了了奶奶牛牛，并并克克隆了世界上仅存的最后一头

45、珍稀牛。隆了世界上仅存的最后一头珍稀牛。至此，同种体细胞克隆进入成熟阶段。至此，同种体细胞克隆进入成熟阶段。39克隆牛克隆牛克隆牛克隆牛克隆克隆克隆克隆猕猕猴猴猴猴克隆狗克隆狗克隆狗克隆狗4020022002年初，我国首批成年体细胞克隆牛的群体诞生年初，我国首批成年体细胞克隆牛的群体诞生年初，我国首批成年体细胞克隆牛的群体诞生年初，我国首批成年体细胞克隆牛的群体诞生41第三阶段第三阶段 异种体细胞克隆异种体细胞克隆 濒濒危物种数量日益减少，很危物种数量日益减少，很危物种数量日益减少，很危物种数量日益减少，很难难提供用于克隆提供用于克隆提供用于克隆提供用于克隆的卵母的卵母的卵母的卵母细细胞和代孕

46、受体，胞和代孕受体，胞和代孕受体，胞和代孕受体，促使科学家提出了异种促使科学家提出了异种促使科学家提出了异种促使科学家提出了异种克隆的克隆的克隆的克隆的设设想：想：想：想：将一种将一种将一种将一种动动物的体物的体物的体物的体细细胞核移植到另一胞核移植到另一胞核移植到另一胞核移植到另一种种种种动动物的去核物的去核物的去核物的去核( ( ( (遗传遗传物物物物质质) ) ) )卵母卵母卵母卵母细细胞中胞中胞中胞中，来得以，来得以，来得以，来得以实实现现克隆的技克隆的技克隆的技克隆的技术术。但此。但此。但此。但此阶阶段技段技段技段技术还处术还处在在在在实验实验探究探究探究探究阶阶段，尚未完全成熟。段

47、，尚未完全成熟。段，尚未完全成熟。段，尚未完全成熟。421998199819981998年年年年1 1 1 1月，美国威斯康星大学的科学家们月，美国威斯康星大学的科学家们月，美国威斯康星大学的科学家们月，美国威斯康星大学的科学家们以牛的卵细胞为受体以牛的卵细胞为受体以牛的卵细胞为受体以牛的卵细胞为受体，成功克隆出猪、牛、羊、，成功克隆出猪、牛、羊、，成功克隆出猪、牛、羊、，成功克隆出猪、牛、羊、鼠和猕猴五种哺乳动物的胚胎。鼠和猕猴五种哺乳动物的胚胎。鼠和猕猴五种哺乳动物的胚胎。鼠和猕猴五种哺乳动物的胚胎。1998199819981998年年年年1999199919991999年，美国人年，美国

48、人年，美国人年，美国人WhiteWhiteWhiteWhite用珍稀动物用珍稀动物用珍稀动物用珍稀动物盘羊的体细胞核与牛卵结合，我国学者陈大元将盘羊的体细胞核与牛卵结合，我国学者陈大元将盘羊的体细胞核与牛卵结合，我国学者陈大元将盘羊的体细胞核与牛卵结合，我国学者陈大元将大熊猫体细胞核与兔卵结合，大熊猫体细胞核与兔卵结合，大熊猫体细胞核与兔卵结合，大熊猫体细胞核与兔卵结合，均成功克隆出早期均成功克隆出早期均成功克隆出早期均成功克隆出早期胚胎胚胎胚胎胚胎。4320002000年，欧洲年，欧洲盘羊羊-奥姆布雷塔被成功克隆，科奥姆布雷塔被成功克隆，科学家是学家是为了了营救目前世界上数目稀少的欧洲救目前

49、世界上数目稀少的欧洲盘羊，羊，避免它避免它们从地球上从地球上灭绝消失。消失。 442003200320032003年年年年5 5 5 5月，世界上第一只克隆月，世界上第一只克隆月，世界上第一只克隆月，世界上第一只克隆骡骡子子子子-格姆在美国格姆在美国格姆在美国格姆在美国诞诞生生生生4520052005年年8 8月月2424日，中国科学院日，中国科学院动物研究所物研究所陈大元教授大元教授领导的的团队，国，国际首例体首例体细胞克隆胞克隆亚洲黄羊在山洲黄羊在山东顺利降生（用山羊做受体）。利降生（用山羊做受体）。46第二节第二节 哺乳动物克隆的技术方法哺乳动物克隆的技术方法克隆动物主要方法：克隆动物主

50、要方法：p胚胎分割胚胎分割p胚胎细胞核移植胚胎细胞核移植p体细胞核移植体细胞核移植p连续细胞核移植连续细胞核移植47优质动物体细胞的来源优质动物体细胞的来源优质动物体细胞的来源优质动物体细胞的来源动物卵母细胞的成熟培养动物卵母细胞的成熟培养动物卵母细胞的成熟培养动物卵母细胞的成熟培养重构胚重构胚重构胚重构胚胚胎移植胚胎移植胚胎移植胚胎移植克隆动物检测克隆动物检测克隆动物检测克隆动物检测体细胞核移植法克隆动物的基本操作流程体细胞核移植法克隆动物的基本操作流程卵母细胞核卵母细胞核卵母细胞核卵母细胞核体细胞核体细胞核体细胞核体细胞核核移植核移植核移植核移植核移植核移植体外培养体外培养体外培养体外培养

51、481 1、动物体细胞的体外培养、动物体细胞的体外培养G G G G0 0 0 0期期期期( ( ( (细胞周期时相细胞周期时相细胞周期时相细胞周期时相) ) ) )常规体外培养常规体外培养常规体外培养常规体外培养降低血清使用量降低血清使用量降低血清使用量降低血清使用量细胞分裂停止细胞分裂停止细胞分裂停止细胞分裂停止移核前移核前移核前移核前49卵丘卵丘卵丘卵丘卵母细胞复合体卵母细胞复合体卵母细胞复合体卵母细胞复合体 (COC)(COC)用用用用M199M199M199M199洗洗洗洗3 3 3 3次次次次100l100l100l100l成熟培养液成熟培养液成熟培养液成熟培养液成熟培养液：成熟培

52、养液：成熟培养液：成熟培养液： M199M199M199M199 +10% FCS +10% FCS +10% FCS +10% FCS +10 g/mL PMSG +10 g/mL PMSG +10 g/mL PMSG +10 g/mL PMSG +10 g/mL HCG +10 g/mL HCG +10 g/mL HCG +10 g/mL HCG5%CO5%CO5%CO5%CO2 2 2 2，38.538.538.538.5，饱和湿度，饱和湿度，饱和湿度，饱和湿度24 h 24 h 24 h 24 h 或或或或 2828282830 h30 h30 h30 h观察卵丘扩展情况观察卵丘扩展情

53、况观察卵丘扩展情况观察卵丘扩展情况例例例例: : : : 小牛卵母细胞的成熟培养小牛卵母细胞的成熟培养小牛卵母细胞的成熟培养小牛卵母细胞的成熟培养2 2、卵母细胞的成熟培养、卵母细胞的成熟培养50盲吸法盲吸法荧光法荧光法挤压法挤压法吸引法吸引法蔗糖法蔗糖法3 3、去核方法、去核方法51带下注射带下注射直接胞质内注射法直接胞质内注射法4 4、核注射方法、核注射方法透明带透明带透明带透明带应用压电应用压电-脉冲设备脉冲设备直接注射法直接注射法52常规法常规法原核互换两步法原核互换两步法孤雌活化协同法孤雌活化协同法化学诱导法化学诱导法5 5、核移植方法、核移植方法53将将将将数数数数枚枚枚枚重重重重

54、构构构构胚胚胚胚放放放放入入入入100L100L的的的的胚胚胚胚胎胎胎胎培培培培养养养养液液液液（CR1-aaCR1-aa）中中中中培培培培养养养养48h48h后后后后，选选选选择择择择4 4细细细细胞胞胞胞以以以以上上上上的的的的胚胎移入铺满滋养层细胞的培养液滴中。胚胎移入铺满滋养层细胞的培养液滴中。胚胎移入铺满滋养层细胞的培养液滴中。胚胎移入铺满滋养层细胞的培养液滴中。在在在在120h120h半半半半换换换换液液液液，148h148h加加加加入入入入1mg/mL1mg/mL的的的的葡葡葡葡萄糖。以后每隔萄糖。以后每隔萄糖。以后每隔萄糖。以后每隔48h48h半换液。半换液。半换液。半换液。6

55、 6、重构胚胎的体外培养、重构胚胎的体外培养小鼠胎儿成纤维细胞小鼠胎儿成纤维细胞小鼠胎儿成纤维细胞小鼠胎儿成纤维细胞547 7、胚胎移植方法、胚胎移植方法假孕的同步发情的寄母假孕的同步发情的寄母u输卵管内移植输卵管内移植( (移植移植1 12 2细胞的受精卵细胞的受精卵) )u子宫角移植子宫角移植( (移植桑椹胚移植桑椹胚) )55体体体体细细细细胞胞胞胞核核核核卵卵卵卵母母母母细细细细胞胞胞胞重构胚重构胚重构胚重构胚移入同步发情的动移入同步发情的动移入同步发情的动移入同步发情的动物输卵管或子宫内物输卵管或子宫内物输卵管或子宫内物输卵管或子宫内体细胞克隆动物研究路线图体细胞克隆动物研究路线图体

56、细胞克隆动物研究路线图体细胞克隆动物研究路线图体外培养体外培养体外培养体外培养去核去核去核去核胚胎移植胚胎移植胚胎移植胚胎移植移核移核移核移核568 8、克隆动物的检测方法、克隆动物的检测方法u微卫星图谱法微卫星图谱法u同工酶法同工酶法57克隆牛克隆牛克隆牛克隆牛“动动动动动动动动”的微卫星检测结果的微卫星检测结果的微卫星检测结果的微卫星检测结果( ( ( (红色代表标准分子量，蓝色和绿色代表扩增片段红色代表标准分子量，蓝色和绿色代表扩增片段红色代表标准分子量，蓝色和绿色代表扩增片段红色代表标准分子量，蓝色和绿色代表扩增片段) ) ) )58l受胎率低（受胎率低（26.2%26.2%）l流产率

57、高流产率高 (53.8%)(53.8%)l克隆动物的存活率低（克隆动物的存活率低（35.7%)35.7%)l常出现早衰现象常出现早衰现象存存 在在 问 题59第三节第三节 克隆动物的衰老问题克隆动物的衰老问题克克克克隆隆隆隆羊羊羊羊“多多多多莉莉莉莉”出出出出现现现现了了了了早早早早衰衰衰衰现现现现象象象象，其其其其端端端端粒粒粒粒长长长长度度度度比比比比正正正正常常常常出出出出生生生生的的的的羊羊羊羊短短短短了了了了20%20%，这这这这与与与与供供供供核核核核羊羊羊羊Finn Finn DorsetDorset的的的的6 6岁年龄直接相关。岁年龄直接相关。岁年龄直接相关。岁年龄直接相关。人

58、类染色体端粒人类染色体端粒人类染色体端粒人类染色体端粒的荧光免疫原位的荧光免疫原位的荧光免疫原位的荧光免疫原位杂交照片杂交照片杂交照片杂交照片6019991999年年年年，美美美美籍籍籍籍华华华华人人人人杨杨杨杨向向向向中中中中教教教教授授授授第第第第一一一一个个个个报报报报道道道道了了了了克克克克隆隆隆隆动动动动物物物物具具具具有有有有正正正正常常常常长长长长度度度度的的的的端端端端粒粒粒粒和和和和遗遗遗遗传传传传年年年年龄龄龄龄，得得得得出出出出克克隆隆动动物物不不会会未未老老先先衰衰、克克隆隆动动物物的的遗遗传传年龄与供体动物年龄无关年龄与供体动物年龄无关的结论。的结论。的结论。的结论。

59、此此此此后后后后，这这这这一一一一结结结结论论论论被被被被美美美美国国国国麻麻麻麻省省省省的的的的ATCATC公公公公司司司司在在在在克克克克隆隆隆隆牛牛牛牛和和和和美美美美国国国国洛洛洛洛克克克克菲菲菲菲勒勒勒勒大大大大学学学学在在在在克克克克隆隆隆隆鼠鼠鼠鼠的的的的实实实实验验验验中中中中得到证实。得到证实。得到证实。得到证实。61总总总总之之之之，由由由由于于于于细细细细胞胞胞胞衰衰衰衰老老老老的的的的分分分分子子子子机机机机理理理理至至至至今今今今仍仍仍仍未未未未能能能能研研研研究究究究清清清清楚楚楚楚，因因因因此此此此有有有有关关关关克克克克隆隆隆隆动动动动物物物物的的的的衰衰衰衰老

60、老老老问问问问题题题题，目目目目前前前前仍在争论中，还需要进一步的研究来证实。仍在争论中，还需要进一步的研究来证实。仍在争论中，还需要进一步的研究来证实。仍在争论中，还需要进一步的研究来证实。端粒酶结构端粒酶结构端粒酶结构端粒酶结构的模式图解的模式图解的模式图解的模式图解62第四节第四节 克隆动物的应用前景克隆动物的应用前景克克隆隆动动物物在在畜畜牧牧业业和和医医学学方方面面具具有有极极为为重重要要的的意意义义，这这不不仅仅表表现现在在理理论论研研究究方方面面，更更重重要要的的是是其其在在应应用用开开发发方方面面的的实实用用价值。价值。631 1. 克克克克隆隆隆隆技技技技术术术术能能能能快快

61、快快速速速速培培培培育育育育出出出出大大大大量量量量的的的的优优优优良良良良品品品品种种种种家家家家畜畜畜畜，而而而而用用用用传传传传统统统统的的的的有有有有性性性性生生生生殖殖殖殖方方方方式式式式培培培培育育育育动动动动物物物物良良良良种种种种不不不不但但但但需需需需要要要要花花花花费费费费很很很很长长长长的的的的时时时时间间间间，而而而而且且且且优优优优良良良良性性性性状状状状难难难难以以以以在在在在后后后后代代代代得到控制。得到控制。得到控制。得到控制。克隆动物在畜牧业和医学方面的意义体现在：克隆动物在畜牧业和医学方面的意义体现在：2. 2. 克克克克隆隆隆隆动动动动物物物物的的的的遗遗

62、遗遗传传传传背背背背景景景景完完完完全全全全一一一一致致致致，因因因因而而而而可可可可以以以以避避避避免免免免动动动动物物物物实实实实验验验验的的的的背背背背景景景景干干干干扰扰扰扰，如如如如用用用用在在在在药药药药物物物物检检检检测测测测上上上上，所所所所得结果将更加稳定可靠。得结果将更加稳定可靠。得结果将更加稳定可靠。得结果将更加稳定可靠。643. 3. 动动动动物物物物克克克克隆隆隆隆技技技技术术术术可可可可以以以以用用用用来来来来保保保保护护护护濒濒濒濒危危危危动动动动物物物物，用用用用濒濒濒濒危危危危动动动动物物物物的的的的冷冷冷冷冻冻冻冻细细细细胞胞胞胞随随随随时时时时可可可可以以

63、以以克克克克隆隆隆隆出出出出新新新新的的的的成成成成体体体体动动动动物物物物，而而而而无须耗费大量的人力物力。无须耗费大量的人力物力。无须耗费大量的人力物力。无须耗费大量的人力物力。654. 4. 克克克克隆隆隆隆动动动动物物物物可可可可为为为为需需需需要要要要组组组组织织织织器器器器官官官官移移移移植植植植的的的的病病病病人人人人提提提提供供供供所所所所需需需需要要要要的的的的组组组组织织织织器器器器官官官官。国国国国外外外外已已已已经经经经开开开开始始始始了了了了这这这这方方方方面面面面的的的的研研研研究究究究，例例例例如如如如科科科科罗罗罗罗拉拉拉拉多多多多大大大大学学学学的的的的研研研

64、研究究究究者者者者用用用用来来来来源源源源于于于于克克克克隆隆隆隆牛牛牛牛胎胎胎胎儿儿儿儿的的的的多多多多巴巴巴巴胺胺胺胺生生生生成成成成细细细细胞胞胞胞，治治治治疗疗疗疗帕帕帕帕金金金金森森森森氏氏氏氏病病病病模模模模型型型型大大大大鼠鼠鼠鼠，已取得一定效果。已取得一定效果。已取得一定效果。已取得一定效果。66治疗性克隆示意图治疗性克隆示意图675 5、动动动动物物物物克克克克隆隆隆隆技技技技术术术术 如如如如果果果果与与与与 转转转转基基基基因因因因动动动动物物物物技技技技术术术术 结结结结合合合合起来将具有更大的发展潜力。起来将具有更大的发展潜力。起来将具有更大的发展潜力。起来将具有更大

65、的发展潜力。转基因动物克隆技术转基因动物克隆技术有有有有性性性性繁繁繁繁殖殖殖殖方方方方式式式式需需需需要要要要几几几几代代代代才才才才能能能能获获获获得得得得稳稳稳稳定定定定表表表表达达达达外外外外源源源源基基基基因因因因的的的的转转转转基基基基因因因因动动动动物物物物，而而而而通通通通过过过过转转转转基基基基因因因因克克克克隆隆隆隆动动动动物物物物的的的的方方方方式式式式，很很很很快快快快便便便便可可可可获获获获得得得得新新新新的的的的转转转转基基基基因因因因动动动动物物物物，从从从从而而而而提提提提高高高高转基因动物的生产效率。转基因动物的生产效率。转基因动物的生产效率。转基因动物的生产

66、效率。 68中国中国农业大学的科学家正在利用大学的科学家正在利用转基因奶牛生基因奶牛生产人人类母乳，并希望三年内在超市中母乳，并希望三年内在超市中销售。售。 692011年年8月，荷月，荷兰研究人研究人员对山羊山羊进行行转基因改造，基因改造，让羊奶羊奶含有与蜘蛛含有与蜘蛛丝一一样的蛋白的蛋白质。利用。利用这种羊奶种羊奶织成的成的织物物强度是度是钢铁的的10倍，制造防倍，制造防弹皮肤。皮肤。70治治治治疗疗疗疗性性性性克克克克隆隆隆隆 动物模型动物模型动物模型动物模型器官移植器官移植器官移植器官移植濒濒濒濒危危危危动动动动物物物物转基因动物转基因动物转基因动物转基因动物乳腺生物反应器乳腺生物反应

67、器乳腺生物反应器乳腺生物反应器基础研究基础研究基础研究基础研究遗传育种遗传育种遗传育种遗传育种 克隆71讨 论克隆人什么克隆人什么时候出候出现？克隆人有没有必要？克隆人有没有必要？72一位美国一位美国专家家说过，无，无论你相信你相信还是是怀疑，无疑，无论你支持你支持还是反是反对，“克隆人的潘多克隆人的潘多拉盒子将被打开拉盒子将被打开”，从那个盒子里跑出来的，从那个盒子里跑出来的是惊喜也好，是噩耗也好，人是惊喜也好，是噩耗也好，人类都只能接受都只能接受而无法阻止。而无法阻止。73第四章第四章第四章第四章哺乳动物胚胎培养哺乳动物胚胎培养哺乳动物胚胎培养哺乳动物胚胎培养 与胚胎移植与胚胎移植与胚胎移

68、植与胚胎移植 74第一节第一节 胚胎培养胚胎培养 早早早早在在在在19131913年年年年BrachetBrachet就就就就尝尝尝尝试试试试对对对对兔兔兔兔囊囊囊囊胚胚胚胚进进进进行行行行体体体体外外外外培培培培养养养养实实实实验验验验，可可可可是是是是由由由由于于于于对对对对各各各各种种种种动动动动物物物物胚胚胚胚胎胎胎胎所所所所需需需需的的的的体体体体外外外外培培培培养养养养液液液液配配配配方方方方不不不不清清清清楚楚楚楚，致致致致使使使使这这这这方方方方面面面面工工工工作作作作在在在在2020世世世世纪纪纪纪的的的的上上上上半半半半世世世世纪发展缓慢。纪发展缓慢。纪发展缓慢。纪发展缓慢

69、。19571957年年年年，美美美美国国国国学学学学者者者者WhittenWhitten找找找找到到到到了了了了能能能能使使使使小小小小鼠鼠鼠鼠早早早早期期期期胚胚胚胚胎胎胎胎在在在在体体体体外外外外生生生生长长长长发发发发育育育育的的的的培培培培养养养养液液液液配配配配方方方方，从从从从而而而而为为为为哺哺哺哺乳乳乳乳动动动动物体外胚胎培养打开了一条通路。物体外胚胎培养打开了一条通路。物体外胚胎培养打开了一条通路。物体外胚胎培养打开了一条通路。75哺哺哺哺乳乳乳乳动动动动物物物物胚胚胚胚胎胎胎胎培培培培养养养养和和和和胚胚胚胚胎胎胎胎移移移移植植植植在在在在现现现现代代代代医医医医学学学学和

70、和和和畜畜畜畜牧牧牧牧业业业业的的的的发发发发展展展展中中中中占占占占有有有有重重重重要要要要地地地地位位位位。近近近近 2020多多多多年年年年来来来来，世世世世界界界界上许多实验室均做了大量工作，发展迅速。上许多实验室均做了大量工作，发展迅速。上许多实验室均做了大量工作，发展迅速。上许多实验室均做了大量工作，发展迅速。 76把把把把受受受受精精精精卵卵卵卵和和和和不不不不同同同同发发发发育育育育时时时时期期期期的的的的早早早早期期期期胚胚胚胚胎胎胎胎取取取取到到到到体体体体外外外外进进进进行行行行培培培培养养养养，不不不不仅仅仅仅是是是是研研研研究究究究胚胚胚胚胎胎胎胎发发发发育育育育机机

71、机机理理理理的的的的重重重重要要要要手手手手段段段段，而而而而且且且且在在在在培培培培育育育育试试试试管管管管婴婴婴婴儿儿儿儿和和和和试试试试管管管管动动动动物物物物方方方方面面面面有有有有着着着着很很很很大的应用价值。大的应用价值。大的应用价值。大的应用价值。哺哺哺哺乳乳乳乳动动动动物物物物胚胚胚胚胎胎胎胎对对对对发发发发育育育育条条条条件件件件要要要要求求求求严严严严格格格格，而而而而且且且且各各各各种种种种动动动动物物物物胚胚胚胚胎胎胎胎所所所所需需需需的的的的营营营营养养养养条条条条件件件件又又又又有有有有所所所所不不不不同同同同，因因因因此无法制定胚胎培养液的通用配方。此无法制定胚胎

72、培养液的通用配方。此无法制定胚胎培养液的通用配方。此无法制定胚胎培养液的通用配方。77体外受精体外受精不同时期胚胎的体外不同时期胚胎的体外发育潜能发育潜能一定的合成一定的合成培养液培养液一定的气相一定的气相条件条件从已有的实验结果来看，体外胚胎培养从已有的实验结果来看，体外胚胎培养有下列几个关键环节：有下列几个关键环节：78成成成成熟熟熟熟的的的的卵卵卵卵子子子子在在在在试试试试管管管管内内内内同同同同精精精精子子子子相相相相遇遇遇遇完完完完成成成成受受受受精精精精作作作作用用用用的的的的过程，称为体外受精。过程，称为体外受精。过程，称为体外受精。过程，称为体外受精。获获获获得得得得卵卵卵卵子

73、子子子的的的的方方方方法法法法有有有有多多多多种种种种，如如如如自自自自然然然然排排排排卵卵卵卵、激激激激素素素素诱诱诱诱发发发发超数排卵超数排卵超数排卵超数排卵(superovulation)(superovulation)、从卵巢手术取卵。、从卵巢手术取卵。、从卵巢手术取卵。、从卵巢手术取卵。人人工工受受精精率率同同卵卵子子成成熟熟度度关关系系极极大大：卵卵卵卵巢巢巢巢中中中中越越越越接接接接近近近近排排排排卵卵卵卵时时时时间间间间的的的的卵卵卵卵子子子子，受受受受精精精精率率率率越越越越高高高高；未未未未成成成成熟熟熟熟或或或或过过过过熟熟熟熟的的的的卵子受精率低下。卵子受精率低下。卵子

74、受精率低下。卵子受精率低下。一、体外受精一、体外受精79人工受精所用的精子人工受精所用的精子人工受精所用的精子人工受精所用的精子必须是获能必须是获能必须是获能必须是获能( ( ( (capacitationcapacitation) ) ) )的的的的，直接排出的精子或从附睾中取，直接排出的精子或从附睾中取，直接排出的精子或从附睾中取，直接排出的精子或从附睾中取出的精子是不能授精的。出的精子是不能授精的。出的精子是不能授精的。出的精子是不能授精的。所所所所谓谓谓谓获获获获能能能能，即即即即精精精精子子子子在在在在雌雌雌雌性性性性生生生生殖殖殖殖管管管管中中中中停停停停留留留留期期期期间间间间，

75、发发发发生生生生了了了了一一一一定定定定的的的的生生生生理理理理、生生生生化化化化和和和和形形形形态态态态变变变变化化化化，从从从从而而而而获获获获得得得得了了了了同卵子结合的能力的过程。同卵子结合的能力的过程。同卵子结合的能力的过程。同卵子结合的能力的过程。在在在在体体体体外外外外，利利利利用用用用卵卵卵卵巢巢巢巢滤滤滤滤泡泡泡泡液液液液、血血血血清清清清、输输输输卵卵卵卵管管管管液液液液、子宫液和人工培养液处理，同样可使精子获能。子宫液和人工培养液处理，同样可使精子获能。子宫液和人工培养液处理，同样可使精子获能。子宫液和人工培养液处理，同样可使精子获能。80表表: : 丙酮酸钠、乳酸钠和丙

76、酮酸钠、乳酸钠和BSABSA对小鼠精子体外受精力的影响对小鼠精子体外受精力的影响培培培培 养养养养 液液液液 成成成成 分分分分卵卵卵卵 数数数数精子穿入的卵子数精子穿入的卵子数精子穿入的卵子数精子穿入的卵子数（%）基基基基础础培养液培养液培养液培养液 + 20+ 20毫克分子毫克分子毫克分子毫克分子浓浓度乳酸度乳酸度乳酸度乳酸钠钠 + 1+ 1毫克分子毫克分子毫克分子毫克分子浓浓度丙度丙度丙度丙酮酮酸酸酸酸钠钠 + 4+ 4毫克毫克毫克毫克/ /毫升毫升毫升毫升BSA*BSA* + + 以上三种成分以上三种成分以上三种成分以上三种成分18218224224221921925825833033

77、00 020206565143143289289（0 0）（9 9）（3030）（6565）（8888）人人人人工工工工培培培培养养养养液液液液中中中中的的的的丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸钠钠钠钠、乳乳乳乳酸酸酸酸钠钠钠钠和和和和小小小小牛牛牛牛血血血血清清清清白白白白蛋蛋蛋蛋白（白（白（白（BSABSABSABSA）对小鼠精子的获能影响很大。）对小鼠精子的获能影响很大。）对小鼠精子的获能影响很大。）对小鼠精子的获能影响很大。 81受受受受精精精精卵卵卵卵和和和和最最最最早早早早期期期期胚胚胚胚胎胎胎胎较较较较难难难难培培培培养养养养。例例例例如如如如，从从从从猪猪猪猪输输输输卵卵卵卵管管管管中中

78、中中收收收收集集集集到到到到的的的的受受受受精精精精卵卵卵卵，90909090能能能能发发发发育育育育到到到到2 2 2 2细细细细胞胞胞胞期期期期，但但但但很很很很少少少少超超超超过过过过4 4 4 4细细细细胞胞胞胞期期期期，可可可可是是是是从从从从子子子子宫宫宫宫中中中中收收收收集集集集到到到到的的的的6-86-86-86-8细细细细胞胞胞胞期期期期的的的的胚胎，却有胚胎，却有胚胎，却有胚胎，却有90909090的可发育到桑棋胚或囊胚。的可发育到桑棋胚或囊胚。的可发育到桑棋胚或囊胚。的可发育到桑棋胚或囊胚。又又又又如如如如牛牛牛牛受受受受精精精精卵卵卵卵：6 6 6 6可可可可培培培培养

79、养养养到到到到8-128-128-128-12细细细细胞胞胞胞期期期期；2 2 2 2细细细细胞胞胞胞期期期期胚胚胚胚胎胎胎胎：则则则则有有有有26262626可可可可发发发发育育育育到到到到8-128-128-128-12细细细细胞胞胞胞期期期期；8 8 8 8细细细细胞胞胞胞期期期期胚胚胚胚胎：则有胎：则有胎：则有胎：则有51515151可发育到桑椹胚。可发育到桑椹胚。可发育到桑椹胚。可发育到桑椹胚。二、不同时期胚胎的体外发育潜能二、不同时期胚胎的体外发育潜能82例例例例如如如如，19561956年年年年WhittenWhitten最最最最早早早早配配配配制制制制的的的的培培培培养养养养液

80、液液液只只只只能能能能使使使使8 8细胞期鼠胚发育成囊胚。细胞期鼠胚发育成囊胚。细胞期鼠胚发育成囊胚。细胞期鼠胚发育成囊胚。19571957年年年年WhittenWhitten发发发发现现现现，如如如如果果果果把把把把培培培培养养养养液液液液中中中中加加加加入入入入乳乳乳乳酸酸酸酸钙，则可使钙，则可使钙，则可使钙，则可使2 2细胞胚胎发育到囊胚。细胞胚胎发育到囊胚。细胞胚胎发育到囊胚。细胞胚胎发育到囊胚。19671967年年年年 WhittinghamWhittingham和和和和BiggersBiggers又又又又相相相相继继继继发发发发现现现现，小小小小鼠鼠鼠鼠合合合合子子子子在在在在含含

81、含含丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸/ /乳乳乳乳酸酸酸酸的的的的培培培培养养养养液液液液中中中中很很很很容容容容易易易易分分分分裂裂裂裂到到到到2-2-细细细细胞胞胞胞期期期期。后后后后来来来来他他他他们们们们证证证证明明明明，丙丙丙丙酮酮酮酮酸酸酸酸和和和和草草草草酰酰酰酰乙乙乙乙酸酸酸酸是是是是第第第第一一一一次次次次卵裂的单一能源，不必要含有乳酸。卵裂的单一能源，不必要含有乳酸。卵裂的单一能源，不必要含有乳酸。卵裂的单一能源，不必要含有乳酸。 83这这这这些些些些差差差差别别别别说说说说明明明明：并并并并非非非非各各各各时时时时期期期期的的的的胚胚胚胚胎胎胎胎发发发发育育育育能能能能力力力力不

82、不不不同同同同，很很很很可可可可能能能能是是是是由由由由于于于于各各各各时时时时期期期期胚胚胚胚胎胎胎胎所所所所需需需需的的的的发发发发育育育育条条条条件件件件不一样。不一样。不一样。不一样。综综综综上上上上所所所所述述述述，在在在在早早早早期期期期胚胚胚胚胎胎胎胎培培培培养养养养时时时时，要要要要牢牢牢牢记记记记“受受受受精精精精卵卵卵卵和和和和最最最最早早早早期期期期胚胚胚胚胎胎胎胎较较较较难难难难培培培培养养养养”的的的的规规规规律律律律，务务务务必必必必要要要要根根根根据据据据所所所所用用用用实实实实验验验验动动动动物物物物的的的的不不不不同同同同选选选选择择择择特特特特定定定定时时时

83、时期期期期的的的的胚胚胚胚胎胎胎胎，以以以以便成功地启动动物的胚胎培养。便成功地启动动物的胚胎培养。便成功地启动动物的胚胎培养。便成功地启动动物的胚胎培养。84各各各各种种种种动动动动物物物物胚胚胚胚胎胎胎胎对对对对培培培培养养养养液液液液成成成成分分分分要要要要求求求求不不不不同同同同。目目目目前前前前常常常常用用用用的的的的培培培培养养养养液液液液有有有有BMOC-3BMOC-3液液液液、WhittenWhitten液液液液、WhittinghamWhittingham液液液液、Hams Hams F10+20%F10+20%小小小小牛牛牛牛血血血血清清清清、SOFSOF培培培培养养养养液

84、液液液、PBS+15%PBS+15%小小小小牛牛牛牛血血血血清清清清、TCM-199TCM-199组织组织培养液、培养液、培养液、培养液、M12M12培养液、培养液、培养液、培养液、 M16M16培养液等。培养液等。培养液等。培养液等。三、一定的合成培养液三、一定的合成培养液培培培培养养养养液液液液的的的的成成成成分分分分对对对对早早早早期期期期胚胚胚胚胎胎胎胎发发发发育育育育至至至至关关关关重重重重要要要要，不不不不同同同同动动动动物物物物种种种种类及不同发育时期的胚胎对培养液组成成分的要求不同。类及不同发育时期的胚胎对培养液组成成分的要求不同。类及不同发育时期的胚胎对培养液组成成分的要求不

85、同。类及不同发育时期的胚胎对培养液组成成分的要求不同。例例例例如如如如，体体体体外外外外培培培培养养养养的的的的哺哺哺哺乳乳乳乳动动动动物物物物早早早早期期期期胚胚胚胚胎胎胎胎往往往往往往往往存存存存在在在在一一一一个个个个发发发发育育育育阻阻阻阻断断断断（blocks blocks blocks blocks of of of of developmentdevelopmentdevelopmentdevelopment）现现现现象象象象，即即即即从从从从受受受受精精精精卵卵卵卵开开开开始始始始的的的的体体体体外外外外培培培培养养养养很很很很难难难难一一一一直直直直发发发发育育育育到到到到囊

86、囊囊囊胚胚胚胚阶阶阶阶段段段段，而而而而是是是是停停停停留留留留在在在在某某某某一一一一时时时时期，无法向下发育。期，无法向下发育。期，无法向下发育。期，无法向下发育。85每每每每种种种种动动动动物物物物都都都都有有有有比比比比较较较较固固固固定定定定的的的的阻阻阻阻断断断断时时时时期期期期，如如如如小小小小鼠鼠鼠鼠的的的的2-2-2-2-细细细细胞胞胞胞阻阻阻阻断断断断(2-cell (2-cell (2-cell (2-cell block)block)block)block)，是是是是指指指指小小小小鼠鼠鼠鼠体体体体外外外外培培培培养养养养的的的的受受受受精精精精卵卵卵卵分分分分裂裂裂裂

87、一一一一次次次次成成成成为为为为2-2-2-2-细细细细胞胞胞胞后后后后，便便便便不不不不再再再再继继继继续续续续分分分分裂裂裂裂，而如果从而如果从而如果从而如果从2-2-2-2-细胞晚期开始培养则可以发育到囊胚。细胞晚期开始培养则可以发育到囊胚。细胞晚期开始培养则可以发育到囊胚。细胞晚期开始培养则可以发育到囊胚。其其其其它它它它动动动动物物物物如如如如牛牛牛牛的的的的的的的的阻阻阻阻断断断断时时时时期期期期为为为为8-168-168-168-16细细细细胞胞胞胞时时时时期期期期，猪为猪为猪为猪为4-4-4-4-细胞时期。细胞时期。细胞时期。细胞时期。针针针针对对对对这这这这一一一一现现现现象

88、象象象，人人人人们们们们首首首首先先先先从从从从改改改改变变变变培培培培养养养养液液液液成成成成分分分分入入入入手手手手，分分分分析析析析阻阻阻阻碍碍碍碍发发发发育育育育的的的的原原原原因因因因，结结结结果果果果发发发发现现现现葡葡葡葡萄萄萄萄糖糖糖糖对对对对小小小小鼠鼠鼠鼠胚胎发育有抑制作用，是造成胚胎发育有抑制作用，是造成胚胎发育有抑制作用，是造成胚胎发育有抑制作用，是造成2-2-2-2-细胞阻断的原因。细胞阻断的原因。细胞阻断的原因。细胞阻断的原因。86 值值得得得得注注注注意意意意的的的的是是是是：葡葡葡葡萄萄萄萄糖糖糖糖虽虽然然然然抑抑抑抑制制制制小小小小鼠鼠鼠鼠胚胚胚胚胎胎胎胎2-

89、2-细细胞胞胞胞向向向向4-4-细细胞胞胞胞的的的的发发育育育育，但但但但葡葡葡葡萄萄萄萄糖糖糖糖对对4-4-细细胞胞胞胞以以以以后后后后的的的的胚胚胚胚胎胎胎胎发发育又是必需的育又是必需的育又是必需的育又是必需的。 于于于于是是是是，Chatot(1988)Chatot(1988)对对BMOC-2BMOC-2培培培培养养养养液液液液进进行行行行了了了了改改改改良良良良，形形形形成成成成了了了了目目目目前前前前受受受受精精精精卵卵卵卵体体体体外外外外培培培培养养养养普普普普遍遍遍遍采采采采用用用用的的的的CZBCZB培培培培养养养养液液液液，它它它它是是是是以以以以谷谷谷谷氨氨氨氨酰酰氨氨氨氨

90、代代代代替替替替葡葡葡葡萄萄萄萄糖糖糖糖，结结果果果果90%90%左左左左右右右右的的的的受受受受精精精精卵卵卵卵发发育育育育到到到到4-4-细细胞胞胞胞时时期期期期，2-2-细细胞胞胞胞阻阻阻阻断被克服了。断被克服了。断被克服了。断被克服了。87克克克克服服服服体体体体外外外外发发育育育育阻阻阻阻断断断断的的的的另另另另一一一一方方方方法法法法为为共共共共同同同同培培培培养养养养(co-culture)(co-culture)，是是是是指指指指将将将将胚胚胚胚胎胎胎胎与与与与输输卵卵卵卵管管管管上上上上皮皮皮皮细细胞胞胞胞或或或或子子子子宫宫上皮上皮上皮上皮细细胞共同培养，以促胞共同培养，以

91、促胞共同培养，以促胞共同培养，以促进进胚胎胚胎胚胎胚胎发发育。育。育。育。利利利利用用用用共共共共培培培培养养养养技技技技术术已已已已使使使使猪猪猪猪、牛牛牛牛、羊羊羊羊等等等等克克克克服服服服了了了了体体体体外外外外发发育阻断育阻断育阻断育阻断现现象。象。象。象。哺哺哺哺乳乳乳乳动动物物物物早早早早期期期期胚胚胚胚胎胎胎胎与与与与输输卵卵卵卵管管管管上上上上皮皮皮皮或或或或子子子子宫宫上上上上皮皮皮皮细细胞胞胞胞共共共共同同同同培培培培养养养养系系系系统统，也也也也是是是是研研研研究究究究胚胚胚胚泡泡泡泡着着着着床床床床机机机机理理理理的的的的良良良良好手段。好手段。好手段。好手段。88早早

92、早早期期期期胚胚胚胚胎胎胎胎的的的的培培培培养养养养液液液液需需需需配配配配合合合合一一一一定定定定的的的的气气气气相相相相条条条条件件件件。一一一一般般般般用用用用含含含含5 5 5 5COCOCOCO2 2 2 2的空气或的空气或的空气或的空气或5 5 5 5O O O O2 2 2 2和和和和90909090N N N N2 2 2 2的混合气体调节的混合气体调节的混合气体调节的混合气体调节pHpHpHpH值。值。值。值。胚胚胚胚胎胎胎胎对对对对培培培培养养养养液液液液pHpHpHpH变变变变化化化化很很很很敏敏敏敏感感感感，pHpHpHpH值值值值超超超超出出出出的的的的范范范范围围围

93、围，会会会会引引引引起起起起胚胚胚胚胎胎胎胎死死死死亡亡亡亡。磷磷磷磷酸酸酸酸缓缓缓缓冲冲冲冲液液液液系系系系统统统统的的的的酸酸酸酸度度度度较较较较稳稳稳稳定定定定，气气气气相相相相可可可可用空气。用空气。用空气。用空气。进进进进行行行行体体体体外外外外培培培培养养养养的的的的哺哺哺哺乳乳乳乳动动动动物物物物胚胚胚胚胎胎胎胎，一一一一般般般般只只只只是是是是着着着着床床床床前前前前的的的的早期胚胎。早期胚胎。早期胚胎。早期胚胎。胚胚胚胚胎胎胎胎着着着着床床床床后后后后，同同同同母母母母体体体体建建建建立立立立了了了了密密密密切切切切的的的的物物物物质质质质交交交交换换换换关关关关系系系系，对

94、对对对营营营营养养养养条条条条件件件件的的的的要要要要求求求求更更更更加加加加复复复复杂杂杂杂。因因因因此此此此对对对对着着着着床床床床后后后后的的的的胚胚胚胚胎胎胎胎体体体体外外外外培养更加困难。培养更加困难。培养更加困难。培养更加困难。四、一定的气相条件四、一定的气相条件89和和和和L.T.Chen(1983)L.T.Chen(1983)将将将将受受受受精精精精后后后后3.5d3.5d的的的的鼠鼠鼠鼠胚胚胚胚培培培培养养养养到到到到相相相相当当当当于于于于在在在在子子子子宫宫内内内内正正正正常常常常发发育育育育的的的的第第第第10d10d胚胚胚胚胎胎胎胎，是是是是胚胚胚胚胎胎胎胎体体体体外

95、外外外培培培培养养养养时时间间最最最最长长的的的的。胚胚胚胚胎胎胎胎发发育育育育经经过过了了了了原原原原肠肠胚胚胚胚、神神神神经经胚胚胚胚、体体体体节节期期期期等等等等阶阶段段段段，培培培培养养养养到到到到第第第第10d10d时时发发发发育育育育出出出出了了了了肢肢肢肢芽芽芽芽、眼眼眼眼泡泡泡泡以以以以及及及及肺肺肺肺、肝肝肝肝、胰胰胰胰等等等等器器器器官官官官。这这这这在在在在哺哺哺哺乳乳乳乳动动动动物物物物胚胚胚胚胎胎胎胎完完完完全全全全体体体体外外外外培培培培养养养养的的的的道道道道路路路路上上上上前前前前进进进进了了了了一一一一大大大大步。步。步。步。近近近近年年年年来来来来，国国国国

96、内内内内外外外外均均均均有有有有人人人人实实实实验验验验将将将将小小小小鼠鼠鼠鼠或或或或兔兔兔兔等等等等的的的的胚胚胚胚泡泡泡泡与与与与子子子子宫宫宫宫内内内内膜膜膜膜上上上上皮皮皮皮细细细细胞胞胞胞共共共共培培培培养养养养，建建建建立立立立胚胚胚胚泡泡泡泡着着着着床床床床模模模模型型型型，试试试试图图图图探探探探明明明明哺哺哺哺乳乳乳乳动动动动物物物物胚胚胚胚泡泡泡泡着着着着床床床床的的的的机机机机理理理理。实实实实验验验验中中中中发发发发现现现现孕孕孕孕酮酮酮酮、雌雌雌雌二二二二醇醇醇醇等等等等激激激激素素素素能促进胚泡与子宫内膜上皮细胞之间的粘附率。能促进胚泡与子宫内膜上皮细胞之间的粘附

97、率。能促进胚泡与子宫内膜上皮细胞之间的粘附率。能促进胚泡与子宫内膜上皮细胞之间的粘附率。 90第二节第二节 胚胎移植胚胎移植 从从从从一一一一头头头头受受受受孕孕孕孕母母母母畜畜畜畜（供供供供体体体体）的的的的生生生生殖殖殖殖管管管管道道道道中中中中取取取取出出出出受受受受精精精精卵卵卵卵或或或或发发发发育育育育到到到到一一一一定定定定时时时时期期期期的的的的早早早早期期期期胚胚胚胚胎胎胎胎，移移移移植植植植到到到到与与与与供供供供体体体体母母母母畜畜畜畜同同同同步步步步发发发发情情情情的的的的母母母母畜畜畜畜（受受受受体体体体）生生生生殖殖殖殖管管管管道道道道的的的的一一一一定定定定部部部部

98、位位位位，继继继继续续续续发发发发长长长长、发发发发育育育育，长成子畜的技术称为长成子畜的技术称为长成子畜的技术称为长成子畜的技术称为胚胎移植。胚胎移植。胚胎移植。胚胎移植。在在在在人人人人类类类类中中中中，供供供供体体体体妇妇妇妇女女女女和和和和受受受受体体体体妇妇妇妇女女女女在在在在排排排排卵卵卵卵周周周周期期期期同同同同步步步步的的的的情情情情况况况况下下下下，转转转转移移移移受受受受精精精精卵卵卵卵或或或或早早早早期期期期胚胚胚胚胎胎胎胎，在在在在受受受受体体体体妇妇妇妇女女女女的的的的体体体体内内内内继继继继续续续续孕育的技术，亦称为胚胎移植。孕育的技术，亦称为胚胎移植。孕育的技术，

99、亦称为胚胎移植。孕育的技术，亦称为胚胎移植。9118901890年年年年，英英英英国国国国的的的的Walter Walter HeapeHeape成成成成功功功功地地地地进进行行行行了了了了家家家家兔兔兔兔的的的的胚胚胚胚胎胎胎胎移移移移植植植植实实验验，他他他他把把把把4-4-细细胞胞胞胞期期期期的的的的安安安安哥哥哥哥拉拉拉拉家家家家兔兔兔兔胚胚胚胚胎胎胎胎移移移移植植植植到到到到一一一一只只只只交交交交配配配配过过的的的的比比比比利利利利时时野野野野兔兔兔兔体体体体内内内内，生生生生下下下下了了了了2 2只只只只安安安安哥哥哥哥拉拉拉拉小小小小兔兔兔兔。该该实实验验的的的的成成成成功功功

100、功，证证实实了了了了早早早早期期期期胚胚胚胚胎胎胎胎在在在在生生生生理理理理条条条条件件件件一一一一致致致致的的的的受受受受体体体体母母母母兔兔兔兔内内内内正正正正常常常常发发育育育育的的的的可能性。可能性。可能性。可能性。此此此此后后后后，学学学学者者者者们们又又又又对对小小小小鼠鼠鼠鼠、绵绵羊羊羊羊、山山山山羊羊羊羊、猪猪猪猪、牛牛牛牛和和和和马马等等等等哺哺哺哺乳乳乳乳动动物物物物以以以以及及及及人人人人胚胚胚胚进进行行行行移移移移植植植植，均均均均取取取取得得得得了了了了成成成成功功功功。据据据据统统计计，至至至至19801980年年年年世世世世界界界界上上上上通通通通过过胚胚胚胚胎胎

101、胎胎移移移移植植植植生生生生出的牛已超出的牛已超出的牛已超出的牛已超过过2 2万万万万头头。92 胚胚胚胚胎胎胎胎移移移移植植植植技技技技术术术术有有有有着着着着重重重重要要要要的的的的实实实实践践践践意意意意义义义义，目目目目前前前前该该该该行业兴旺发达，取得了显著的经济效益。行业兴旺发达，取得了显著的经济效益。行业兴旺发达，取得了显著的经济效益。行业兴旺发达，取得了显著的经济效益。胚胎移植的应用价值主要表现在：胚胎移植的应用价值主要表现在：提高良种母畜的繁殖力提高良种母畜的繁殖力提高良种母畜的繁殖力提高良种母畜的繁殖力胚胎分割胚胎分割胚胎分割胚胎分割/ / / /胚胎移植胚胎移植胚胎移植胚

102、胎移植1 1 1 1头母畜头母畜头母畜头母畜1 1 1 1次生双胎次生双胎次生双胎次生双胎胚胎性别选择胚胎性别选择胚胎性别选择胚胎性别选择减少精液消耗减少精液消耗减少精液消耗减少精液消耗冻存良种胚胎冻存良种胚胎冻存良种胚胎冻存良种胚胎保护濒危动物保护濒危动物保护濒危动物保护濒危动物试管婴儿试管婴儿试管婴儿试管婴儿试管动物试管动物试管动物试管动物许多细胞工程技术许多细胞工程技术许多细胞工程技术许多细胞工程技术的最终步骤的最终步骤的最终步骤的最终步骤931 1 1 1头头头头母母母母牛牛牛牛（母母母母马马马马）1 1 1 1年年年年生生生生1 1 1 1胎胎胎胎，一一一一生生生生只只只只能能能能生

103、生生生育育育育10101010头头头头左左左左右右右右的的的的仔仔仔仔畜畜畜畜，可可可可是是是是其其其其卵卵卵卵巢巢巢巢中中中中却却却却含含含含有有有有75,00075,00075,00075,000个个个个生生生生殖殖殖殖细细细细胞胞胞胞，因因因因此此此此绝大部分卵未被利用。绝大部分卵未被利用。绝大部分卵未被利用。绝大部分卵未被利用。如如如如果果果果利利利利用用用用激激激激素素素素做做做做超超超超数数数数排排排排卵卵卵卵，1 1 1 1次次次次可可可可排排排排10101010个个个个卵卵卵卵，其其其其中中中中67676767个个个个能能能能成成成成为为为为正正正正常常常常胚胚胚胚胎胎胎胎，移

104、移移移植植植植到到到到寄寄寄寄母母母母体体体体内内内内成成成成孕孕孕孕，平平平平均均均均可可可可长长长长成成成成3 3 3 3一一一一4 4 4 4个个个个胚胚胚胚。1 1 1 1头头头头母母母母牛牛牛牛1 1 1 1年年年年可可可可做做做做5 5 5 5次次次次超超超超级级级级排排排排卵卵卵卵，所所所所以以以以1 1 1 1年年年年产仔数可比自然状态增产产仔数可比自然状态增产产仔数可比自然状态增产产仔数可比自然状态增产15151515倍以上。倍以上。倍以上。倍以上。1 1、提高良种母畜的繁殖力、提高良种母畜的繁殖力、提高良种母畜的繁殖力、提高良种母畜的繁殖力94中中中中国国国国科科科科学学学

105、学院院院院遗遗遗遗传传传传研研研研究究究究所所所所和和和和内内内内蒙蒙蒙蒙古古古古三三三三北北北北种种种种羊羊羊羊场场场场(1975)(1975)(1975)(1975)合合合合作作作作，使使使使用用用用超超超超数数数数排排排排卵卵卵卵技技技技术术术术，使使使使1 1 1 1头头头头7 7 7 7岁岁岁岁半半半半的的的的黑黑黑黑色色色色三三三三北北北北羔羔羔羔皮皮皮皮羊羊羊羊一一一一次次次次排排排排18181818个个个个卵卵卵卵。这这这这些些些些卵卵卵卵受受受受精精精精后后后后，移移移移植植植植到到到到白白白白色色色色蒙蒙蒙蒙古古古古羊羊羊羊体体体体内内内内，结结结结果果果果产产产产出出出出

106、了了了了11111111头头头头三三三三北北北北羔羔羔羔皮羊。皮羊。皮羊。皮羊。因因因因此此此此，利利利利用用用用这这这这种种种种技技技技术术术术在在在在短短短短期期期期内内内内即即即即可可可可使使使使优优优优良良良良家家家家畜大幅度增加。畜大幅度增加。畜大幅度增加。畜大幅度增加。95牛牛牛牛1 1 1 1次次次次成成成成孕孕孕孕，一一一一般般般般只只只只能能能能1 1 1 1胎胎胎胎1 1 1 1犊犊犊犊，双双双双胎胎胎胎不不不不多多多多见见见见。用用用用胚胚胚胚胎胎胎胎移移移移植可着双胎，繁殖率可扩大植可着双胎，繁殖率可扩大植可着双胎，繁殖率可扩大植可着双胎，繁殖率可扩大1 1 1 1倍。

107、倍。倍。倍。2 2、1 1头母畜头母畜头母畜头母畜1 1次生双胎次生双胎次生双胎次生双胎将将将将胚胚胚胚胎胎胎胎分分分分割割割割为为为为二二二二，再再再再结结结结合合合合胚胚胚胚胎胎胎胎移移移移植植植植，造造造造成成成成一一一一卵卵卵卵双双双双胎胎胎胎，使仔畜育成率提高使仔畜育成率提高使仔畜育成率提高使仔畜育成率提高1 1 1 1倍。倍。倍。倍。3 3、胚胎分割、胚胎分割、胚胎分割、胚胎分割/ /胚胎移植胚胎移植胚胎移植胚胎移植繁殖奶牛、奶羊可选择雌性胚胎进行移植。繁殖奶牛、奶羊可选择雌性胚胎进行移植。繁殖奶牛、奶羊可选择雌性胚胎进行移植。繁殖奶牛、奶羊可选择雌性胚胎进行移植。利利利利用用用用

108、体体体体外外外外授授授授精精精精法法法法，再再再再进进进进行行行行胚胚胚胚胎胎胎胎移移移移植植植植，精精精精液液液液用用用用量量量量少少少少，可减少良种公畜精液的消耗。可减少良种公畜精液的消耗。可减少良种公畜精液的消耗。可减少良种公畜精液的消耗。 5 5、减少精液消耗、减少精液消耗、减少精液消耗、减少精液消耗4 4、胚胎性别选择、胚胎性别选择、胚胎性别选择、胚胎性别选择96可可可可把把把把良良良良种种种种家家家家畜畜畜畜的的的的胚胚胚胚胎胎胎胎做做做做超超超超低低低低温温温温冻冻冻冻存存存存，建建建建立立立立“胚胚胚胚胎胎胎胎库库库库”。国国国国际际际际间间间间的的的的家家家家畜畜畜畜贸贸贸贸

109、易易易易，可可可可通通通通过过过过运运运运送送送送冷冷冷冷冻冻冻冻胚胚胚胚胎胎胎胎进进进进行行行行，不不不不必再笨重地运输成体种畜。必再笨重地运输成体种畜。必再笨重地运输成体种畜。必再笨重地运输成体种畜。美美美美国国国国佛佛佛佛罗罗罗罗里里里里达达达达大大大大学学学学（1984198419841984）试试试试图图图图利利利利用用用用胚胚胚胚胎胎胎胎移移移移植植植植术术术术把把把把亚亚亚亚洲洲洲洲水水水水牛牛牛牛胚胚胚胚移移移移植植植植到到到到当当当当地地地地乳乳乳乳牛牛牛牛体体体体内内内内孕孕孕孕育育育育，以以以以供供供供肉肉肉肉牛牛牛牛、乳乳乳乳牛牛牛牛用。用。用。用。6 6、冻存良种胚胎

110、、冻存良种胚胎、冻存良种胚胎、冻存良种胚胎97充充充充分分分分利利利利用用用用濒濒濒濒危危危危动动动动物物物物的的的的卵卵卵卵子子子子，结结结结合合合合胚胚胚胚胎胎胎胎冷冷冷冷冻冻冻冻和和和和人人人人工工工工受受受受精精精精技技技技术术术术，尽尽尽尽可可可可能能能能多多多多的的的的得得得得到到到到濒濒濒濒危危危危动动动动物物物物的的的的胚胚胚胚胎胎胎胎，然然然然后后后后再再再再经经经经胚胚胚胚胎胎胎胎移移移移植植植植技技技技术术术术，提提提提高高高高濒濒濒濒危危危危动动动动物物物物的的的的受受受受孕孕孕孕率率率率，以以以以获获获获得得得得更更更更多多多多的的的的成成成成体体体体动动动动物。物。

111、物。物。7 7、保护濒危动物、保护濒危动物、保护濒危动物、保护濒危动物98利利利利用用用用体体体体外外外外受受受受精精精精结结结结合合合合胚胚胚胚胎胎胎胎移移移移植植植植，可可可可以以以以解解解解除除除除人人人人的的的的某某某某些些些些不不不不孕孕孕孕症症症症。因因因因为为为为精精精精子子子子和和和和卵卵卵卵子子子子是是是是在在在在试试试试管管管管中中中中结结结结合合合合受受受受精精精精的的的的，所所所所以以以以这这这这样样样样得得得得到的婴儿又称试管婴儿。到的婴儿又称试管婴儿。到的婴儿又称试管婴儿。到的婴儿又称试管婴儿。1978197819781978年年年年，世世世世界界界界上上上上第第第

112、第一一一一个个个个试试试试管管管管婴婴婴婴儿儿儿儿在在在在英英英英国国国国诞诞诞诞生生生生。目目目目前前前前，世界上出生的试管婴儿已有上万个。世界上出生的试管婴儿已有上万个。世界上出生的试管婴儿已有上万个。世界上出生的试管婴儿已有上万个。近近近近几几几几年年年年，我我我我国国国国在在在在这这这这方方方方面面面面的的的的工工工工作作作作进进进进展展展展也也也也相相相相当当当当快快快快。在在在在医医医医学学学学上上上上应应应应用用用用这这这这种种种种技技技技术术术术，还还还还可可可可减减减减少少少少先先先先天天天天遗遗遗遗传传传传病病病病和和和和提提提提高高高高后后后后代代代代的的的的健健健健康康

113、康康素质。素质。素质。素质。8 8、试管婴儿、试管婴儿、试管婴儿、试管婴儿99许多多细胞胞工工程程技技术都都是是以以胚胚胎胎移移植植作作为最最终步步骤。如如嵌嵌合合体体技技术、转基基因因动物物技技术以以及及核核移移植植技技术等等，都都是是对哺哺乳乳动物物早早期期胚胚胎胎进行行操操作作的的，而而要要使使被被操操作作的的胚胚胎胎变成成动物物个个体体，必必须通通过胚胚胎胎移移植植，使使被被操操作作的的胚胚胎胎在在寄寄母母的的子子宫内内发育成熟。育成熟。 1010、许多细胞工程技术的最终步骤、许多细胞工程技术的最终步骤、许多细胞工程技术的最终步骤、许多细胞工程技术的最终步骤利利用用先先体体外外授授精精、再再进行行胚胚胎胎移移植植，孕孕育育出出的的动物物即即为试管管动物。物。试管管动物物技技术已已被被应用用于于畜畜牧牧业，所所用用卵卵子子可可以以是是从从屠屠宰宰场废弃的卵巢中分离弃的卵巢中分离获得，其得，其经济效益是效益是显而易而易见的。的。9 9、试管动物、试管动物、试管动物、试管动物