实验二：细菌的形态结构与染色实验二：细菌的形态结构与染色n n本次实验的主要内容本次实验的主要内容: :n n细菌的基本形态：细菌的基本形态：细菌的基本形态：细菌的基本形态： 球菌、杆菌、弧菌球菌、杆菌、弧菌n n细菌的特殊结构：细菌的特殊结构：细菌的特殊结构：细菌的特殊结构： 芽胞、荚膜、鞭毛芽胞、荚膜、鞭毛n n细菌运动的观察：细菌运动的观察：细菌运动的观察：细菌运动的观察： 悬滴标本检查法悬滴标本检查法n n细菌染色检查法：细菌染色检查法：细菌染色检查法：细菌染色检查法： 革兰氏染色法革兰氏染色法、芽孢染色、芽孢染色、芽孢染色、芽孢染色 1 1 1 1片片片片/ / / /组组组组 球菌：葡球菌：葡球菌：葡球菌：葡萄球菌萄球菌萄球菌萄球菌螺形菌螺形菌螺形菌螺形菌弧菌：霍乱弧菌弧菌：霍乱弧菌弧菌：霍乱弧菌弧菌：霍乱弧菌螺菌螺菌螺菌螺菌1 1、细菌的基本形态、细菌的基本形态n n杆菌：杆菌：杆菌：杆菌：大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌大肠杆菌 2 2、细菌的特殊结构、细菌的特殊结构n n芽胞芽胞——增强细菌对不良环境的抗性增强细菌对不良环境的抗性增强细菌对不良环境的抗性增强细菌对不良环境的抗性n n荚膜荚膜——抗吞噬、抗损伤、抗干燥抗吞噬、抗损伤、抗干燥抗吞噬、抗损伤、抗干燥抗吞噬、抗损伤、抗干燥n n鞭毛鞭毛——运动器官，单生、双生、丛生、周生。
运动器官，单生、双生、丛生、周生运动器官，单生、双生、丛生、周生运动器官，单生、双生、丛生、周生n n菌毛菌毛——在电镜下才可以见到在电镜下才可以见到在电镜下才可以见到在电镜下才可以见到 细菌的特殊结构形态细菌的特殊结构形态芽胞芽胞芽胞芽胞荚膜荚膜荚膜荚膜鞭毛鞭毛鞭毛鞭毛肺炎双球菌的荚膜肺炎双球菌的荚膜肺炎双球菌的荚膜肺炎双球菌的荚膜伤寒杆菌的鞭毛伤寒杆菌的鞭毛伤寒杆菌的鞭毛伤寒杆菌的鞭毛n n枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌的芽胞的芽胞的芽胞的芽胞 芽孢染色法芽孢染色法 枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌 1片片/组组•芽孢的概念芽孢的概念：：是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成是芽孢杆菌属和梭菌属细菌生长到一定阶段形成 的一种抗逆性很强的休眠体结构，也被称为内生孢子，通常为圆的一种抗逆性很强的休眠体结构，也被称为内生孢子，通常为圆形形 或椭圆形在合适条件下，可吸水萌发，重新形成一个新的菌或椭圆形在合适条件下，可吸水萌发，重新形成一个新的菌体 是否产生芽孢，以及芽孢的形状、着生部位、芽孢囊是否膨是否产生芽孢，以及芽孢的形状、着生部位、芽孢囊是否膨大等特大等特 征是细菌分类的重要指标。
征是细菌分类的重要指标 基本原理：基本原理：与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚而致与正常细胞或菌体相比，芽孢壁厚而致密，通透性密，通透性 低，不易着色，但是，芽孢一旦着色就很低，不易着色，但是，芽孢一旦着色就很难被脱色利用这一特难被脱色利用这一特 点，首先用着色能力强的染料点，首先用着色能力强的染料（如孔雀绿）在加热条件下染色，使（如孔雀绿）在加热条件下染色，使 染料既可进入菌染料既可进入菌体也可进入芽孢，水洗脱色时，菌体中的染料被洗体也可进入芽孢，水洗脱色时，菌体中的染料被洗 脱，脱，而芽孢中的染料仍保留然后用对比度强的染料对菌体而芽孢中的染料仍保留然后用对比度强的染料对菌体复染，复染， 使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明使菌体和芽孢呈现出不同的颜色，因而能更明显地衬托出芽孢，便于观察显地衬托出芽孢，便于观察 实实 验验 器器 材材 1.1.菌种：菌种：枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌2.2.染色液：染色液：5%5%孔雀绿水溶液，稀释的复红（石碳孔雀绿水溶液，稀释的复红（石碳酸复红酸复红10ml10ml，蒸馏水，蒸馏水90ml90ml））3.3.仪器及其它用品：仪器及其它用品：普通光学显微镜、擦镜纸、普通光学显微镜、擦镜纸、绸布、酒精灯、载玻片、接种针、培养皿、香绸布、酒精灯、载玻片、接种针、培养皿、香柏油柏油、、二甲苯等二甲苯等 涂片涂片干燥干燥固定固定涂片制备： 涂片------干燥------固定严格无菌操作严格无菌操作涂片薄而均匀涂片薄而均匀 固定时注意勿将标固定时注意勿将标本烤枯本烤枯固定目的：固定目的：杀菌，粘附，通透杀菌，粘附，通透性性切忌紧靠火焰切忌紧靠火焰, ,以防菌体变形以防菌体变形 4)4)染色染色 向载玻片滴加数滴向载玻片滴加数滴5%5%孔雀绿水溶液覆盖涂菌位置，孔雀绿水溶液覆盖涂菌位置，用夹子夹住载玻片在微火上加热至染液冒蒸气并维持用夹子夹住载玻片在微火上加热至染液冒蒸气并维持5min5min，加热时注意补充染液，切勿涂片干涸。
加热时注意补充染液，切勿涂片干涸 5)5)脱色脱色 冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水为无色冷却后，用缓流自来水冲洗至流出水为无色 6)6)复染复染 用用10%10%的复红液复染的复红液复染30-60s30-60s 7)7)水洗水洗 用缓流自来水冲洗至流出水为无色用缓流自来水冲洗至流出水为无色 8)8)干燥镜检干燥镜检 将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先将制备好的样片置于显微镜下进行观察，先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍低倍观察，再高倍观察，并找出适当的视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌的形态镜转出，在涂片上加香柏油，用油镜观察细菌的形态 实实 验验 结结 果果 芽孢呈绿色，菌体为红色芽孢呈椭圆到柱状，含芽孢呈绿色，菌体为红色芽孢呈椭圆到柱状，含芽孢菌体不膨大芽孢菌体不膨大 位于菌体中央或稍偏位于菌体中央或稍偏 3 3、细菌运动的观察－悬滴标本检查法、细菌运动的观察－悬滴标本检查法n n葡萄球菌运动方式葡萄球菌运动方式n n变形杆菌运动方式变形杆菌运动方式 4. 革兰氏染色的原理革兰氏染色的原理1.1.1.1.G+G+G+G+菌胞壁结构致密。
菌胞壁结构致密菌胞壁结构致密菌胞壁结构致密肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透肽聚糖层厚，脂质含量少，乙醇不易透入同时乙醇使细胞壁脱水形成一道屏障，阻止结晶紫入同时乙醇使细胞壁脱水形成一道屏障，阻止结晶紫——碘碘复合物从胞内渗出复合物从胞内渗出G-G-菌较为疏松，肽聚糖层很薄，而外膜、菌较为疏松，肽聚糖层很薄，而外膜、脂蛋白、脂多糖又均含大量脂质，易被乙醇溶解，致使细胞脂蛋白、脂多糖又均含大量脂质，易被乙醇溶解，致使细胞壁通透性变大，使结晶紫壁通透性变大，使结晶紫----碘复合物被乙醇溶解析出而脱色碘复合物被乙醇溶解析出而脱色2.2.2.2.G+G+G+G+菌等电点（菌等电点（菌等电点（菌等电点（PH2~3PH2~3PH2~3PH2~3）比）比）比）比G-G-G-G-菌（菌（菌（菌（PH4~5PH4~5PH4~5PH4~5）低在相同在相同PHPH下，下，G+G+所带的负电荷比所带的负电荷比G-G-多故与带正电的结晶紫染料结合较多，多故与带正电的结晶紫染料结合较多，不易脱色不易脱色. .3.3.3.3.核糖核酸镁盐的含量有关核糖核酸镁盐的含量有关核糖核酸镁盐的含量有关核糖核酸镁盐的含量有关: : : : G+G+多于多于G-G-n n上述两者中以上述两者中以上述两者中以上述两者中以1 1 1 1更重要，更重要，更重要，更重要，如如G+G+菌胞壁有破损，其染色性由菌胞壁有破损，其染色性由G+ G+ G-G- 涂片涂片干燥干燥固定固定涂片制备： 涂片------干燥------固定严格无菌操作严格无菌操作涂片薄而均匀涂片薄而均匀 固定时注意勿将标固定时注意勿将标本烤枯本烤枯固定目的：固定目的：杀菌，粘附，通透杀菌，粘附，通透性性切忌紧靠火焰切忌紧靠火焰, ,以防菌体变形以防菌体变形 1-2滴结晶紫初染１滴结晶紫初染１min 1-2滴碘液媒染滴碘液媒染1min2-3滴乙醇脱色滴乙醇脱色30sec1-2滴复红复染滴复红复染1min涂片固定涂片固定革兰氏染色法步骤（革兰氏染色法步骤（Gram StainGram Stain））吸水纸印干，吸水纸印干，镜检镜检H2O 轻轻冲洗轻轻冲洗H2O 轻轻冲洗轻轻冲洗H2O 轻轻冲洗轻轻冲洗H2O 轻轻冲洗轻轻冲洗 n n影响实验结果的因素：影响实验结果的因素：n n菌龄菌龄菌龄菌龄, , , , G+ G- G+ G- G+ G- G+ G-n n如果细菌细胞壁破损如果细菌细胞壁破损如果细菌细胞壁破损如果细菌细胞壁破损 G+ G-G+ G-G+ G-G+ G-n n脱色过长脱色过长脱色过长脱色过长G+ G-G+ G-G+ G-G+ G-，脱色过短，脱色过短，脱色过短，脱色过短G- G+G- G+G- G+G- G+结果结果: : 阳性菌阳性菌——蓝紫色蓝紫色 阴性菌阴性菌——红色红色 n n革兰氏染色的意义：革兰氏染色的意义：n n鉴别细菌鉴别细菌n n指导用药指导用药n n了解细菌的致病性，了解细菌的致病性， 大多大多 G+, 外毒素，外毒素，G- 内毒素内毒素 n n细菌运动的观察：细菌运动的观察：细菌运动的观察：细菌运动的观察： 悬滴标本检查法悬滴标本检查法( (最先进行）最先进行）n n细菌的基本形态：细菌的基本形态：细菌的基本形态：细菌的基本形态： 球菌、杆菌、弧菌球菌、杆菌、弧菌（示教）（示教）n n细菌的特殊结构：细菌的特殊结构：细菌的特殊结构：细菌的特殊结构： 芽胞、荚膜、鞭毛芽胞、荚膜、鞭毛（示教）（示教）n n细菌染色检查法：细菌染色检查法：细菌染色检查法：细菌染色检查法： 革兰氏和芽孢染色法革兰氏和芽孢染色法 1 1 1 1片片片片/ / / /组组组组n n注意：注意：n n示教的样品留在原处，不要任意调动显微镜，以免影响示教的样品留在原处，不要任意调动显微镜，以免影响示教的样品留在原处，不要任意调动显微镜，以免影响示教的样品留在原处，不要任意调动显微镜，以免影响到其它同学观看到其它同学观看到其它同学观看到其它同学观看n n菌液放回原处，显微镜用后放在原处菌液放回原处，显微镜用后放在原处菌液放回原处，显微镜用后放在原处菌液放回原处，显微镜用后放在原处n n值日生做好卫生后方可离开值日生做好卫生后方可离开值日生做好卫生后方可离开值日生做好卫生后方可离开n n实验报告应于做完实验后周末前按学号顺序交于实验报告应于做完实验后周末前按学号顺序交于实验报告应于做完实验后周末前按学号顺序交于实验报告应于做完实验后周末前按学号顺序交于A2-A2-624624门口的书架子上。
门口的书架子上门口的书架子上门口的书架子上。