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1、第第四四单元单元 核酸化学核酸化学第十二章第十二章核酸通论核酸通论第十三章第十三章核酸的结构核酸的结构第十四章第十四章核酸的理化性质核酸的理化性质第十五章第十五章核酸的研究方法核酸的研究方法小小结结第15章核酸的研究方法l 一、核酸的分离、提纯和定量测定一、核酸的分离、提纯和定量测定l 二、核酸的超速离心二、核酸的超速离心l 三、核酸的凝胶电泳三、核酸的凝胶电泳l 四、核酸的核苷酸序列测定四、核酸的核苷酸序列测定l 五、五、DNADNA聚合酶链反应聚合酶链反应(PCR)(PCR)l 六、六、DNADNA的化学合成的化学合成一、一、核酸的分离核酸的分离、提纯和定量测定提纯和定量测定l(一一)DN
2、A的分离和纯化的分离和纯化l(二二)RNA的分离与纯化的分离与纯化l(三三)核酸的鉴定核酸的鉴定(一一)DNA的分离和纯化的分离和纯化l真核生物中的染色体真核生物中的染色体DNA与碱性蛋白（组蛋白）结合与碱性蛋白（组蛋白）结合成核蛋白（成核蛋白（DNP）形式存在于核内）形式存在于核内。DNP溶于水和浓盐溶溶于水和浓盐溶液（如液（如1mol/L氯化钠），但不溶于生理盐溶液氯化钠），但不溶于生理盐溶液(0.14mol/L氯化钠）氯化钠）,利用这一性质，可将细胞破碎后，用浓盐提取后利用这一性质，可将细胞破碎后，用浓盐提取后加水稀释至加水稀释至0.14mol/L盐溶液，使盐溶液，使DNP纤维沉淀。纤维
3、沉淀。l用苯酚抽提，除去蛋白质。用苯酚抽提，除去蛋白质。l苯酚是很强的蛋白质变性剂苯酚是很强的蛋白质变性剂，用水饱和的苯酚与，用水饱和的苯酚与DNP一起震荡，冷冻离心，一起震荡，冷冻离心，DNA溶于上层水相溶于上层水相，不溶性变性蛋，不溶性变性蛋白质残留物位于中间界面，一部分变性蛋白质停留在酚相。白质残留物位于中间界面，一部分变性蛋白质停留在酚相。(二二)RNA的分离与纯化的分离与纯化lRNA比比DNA更不稳定，而且更不稳定，而且RNase无处不在，因此无处不在，因此RNA的分离更为困难。的分离更为困难。l制备制备RNA通常需要注意通常需要注意3点：点：l一、制备的玻璃器皿要经过高温焙烤，塑料
4、用具要高压一、制备的玻璃器皿要经过高温焙烤，塑料用具要高压灭菌。灭菌。l二、在破碎细胞的同时加入强变性剂使二、在破碎细胞的同时加入强变性剂使RNase失活。失活。l三、在三、在RNA的反应体系内加入的反应体系内加入Rnase的抑制剂。的抑制剂。(三三)核酸的鉴定核酸的鉴定l 核酸纯度核酸纯度的鉴定可以通过测定样品在的鉴定可以通过测定样品在260nm和和280nm的的光吸收比值光吸收比值来确定，进一步鉴定可用来确定，进一步鉴定可用凝胶凝胶电泳电泳等方法。等方法。l核酸含量核酸含量的测定一般是通过测定的测定一般是通过测定磷含量磷含量、核糖核糖含量含量或或紫外吸收紫外吸收等方法来确定。等方法来确定。
5、 根据元素分析，根据元素分析，每每11g11g核酸约含有核酸约含有1g1g磷，即每测磷，即每测得得1g1g磷就相当于含有磷就相当于含有11g11g核酸。核酸。(RNA(RNA含磷量约为含磷量约为8.5%8.5%9.0%9.0%，DNADNA含磷量约为含磷量约为9.2%)9.2%)。 定磷法是用浓硫酸将核酸中的有机磷消化为无定磷法是用浓硫酸将核酸中的有机磷消化为无机磷，然后与钼酸铵定磷试剂显色，通过比色法测机磷，然后与钼酸铵定磷试剂显色，通过比色法测定磷含量，从而求出核酸含量。定磷含量，从而求出核酸含量。1.1.定磷法定磷法RNA中核糖用苔黑酚法测定，中核糖用苔黑酚法测定，DNA中脱氧核糖用二苯
6、胺中脱氧核糖用二苯胺法测定法测定。苔黑酚反应：苔黑酚反应：D-核糖与浓核糖与浓HCl和甲基间苯二酚混合后，加和甲基间苯二酚混合后，加热呈绿色。热呈绿色。(因为核糖与酸作用产生糠醛，糠醛与甲基间苯因为核糖与酸作用产生糠醛，糠醛与甲基间苯二酚和二酚和FeCl3作用呈绿色作用呈绿色)。二苯胺反应：二苯胺反应：D-2-脱氧核糖与酸和二苯胺一同加热呈蓝色。脱氧核糖与酸和二苯胺一同加热呈蓝色。(因为因为D-2-脱氧核糖与酸作用产生脱氧核糖与酸作用产生-羟基羟基-酮戊醛，后者与酮戊醛，后者与二苯胺作用呈蓝色二苯胺作用呈蓝色)。2.2.定糖法定糖法常用常用OD260/OD280的比值来判定核酸样品的纯度。的比
7、值来判定核酸样品的纯度。对于纯样品对于纯样品:1个个OD260值相当于值相当于50ug/ml双螺旋双螺旋DNA，或或40ug/ml单链单链DNA(或或RNA)，或或20ug/ml寡核苷酸。寡核苷酸。(详见详见P507核酸的紫外吸收核酸的紫外吸收)3.3.紫外吸收法紫外吸收法光光 吸吸 收收220240260280nm0.10.20.30.4123DNADNA的紫外吸收光谱的紫外吸收光谱天然天然DNA变性变性DNA核苷酸总核苷酸总吸收值吸收值波长二二、核酸的超速离心核酸的超速离心l核酸与蛋白质及其它杂质各有不同的沉降系数核酸与蛋白质及其它杂质各有不同的沉降系数（S），可以用超速离心的方法使核酸和
8、其它杂质），可以用超速离心的方法使核酸和其它杂质分开。也可以用此法将不同种核酸进行分离。分开。也可以用此法将不同种核酸进行分离。RNA分离常用蔗糖密度梯度超离心，分离常用蔗糖密度梯度超离心，DNA分离常分离常用氯化铯密度梯度超离心。用氯化铯密度梯度超离心。l(见见P294-295沉降法测相对分子量沉降法测相对分子量，S=110-13秒秒)l例如应用啡啶嗅红氯化铯密度梯度超离心：例如应用啡啶嗅红氯化铯密度梯度超离心：石蜡油石蜡油蛋白质蛋白质开环及开环及线形线形DNADNA闭环质粒闭环质粒DNADNARNA、超螺旋超螺旋DNADNA如图所示如图所示l RNARNA、超螺旋、超螺旋DNADNA在管底
9、在管底l 闭环质粒闭环质粒DNADNA在第二层在第二层l 开环或线形开环或线形DNADNA在第三层在第三层l 蛋白质出现在第四层。蛋白质出现在第四层。三、核酸的凝胶电泳l凝胶电泳是核酸研究中最为常用的方法之一。凝胶电凝胶电泳是核酸研究中最为常用的方法之一。凝胶电泳兼有分子筛效应和电荷效应双重效果，所以分离效应很泳兼有分子筛效应和电荷效应双重效果，所以分离效应很高。高。l核酸分析中常用的凝胶电泳有琼脂糖凝胶电泳和聚丙核酸分析中常用的凝胶电泳有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳。烯酰胺凝胶电泳。琼脂糖凝胶琼脂糖凝胶孔径较大，常用于分析孔径较大，常用于分析DNA；聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶孔径较小
10、，常用于分析孔径较小，常用于分析RNA或片段较小或片段较小的的DNA。琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳图谱琼脂糖凝胶电泳图谱凝胶成像及分析系统凝胶成像及分析系统四、核酸的核苷酸序列测定l1977年年Sanger、Maxam及及Gilbert分别建立了分别建立了两种较完善而快速的测定两种较完善而快速的测定DNA序列的方法序列的方法,下下面做分别介绍。面做分别介绍。(1)化学断裂法化学断裂法(2)末端终止法末端终止法(又名双脱氧法又名双脱氧法)(1)化学断裂法l由由MaxamMaxam和和GilbertGilbert于于19771977年年创立创立。用一种多核苷酸激酶用一种多核苷酸激酶将
11、含将含3232P P的磷酸接在待测的磷酸接在待测DNADNA片段的片段的5 5 -OH-OH端。端。l5 -5 -末端标记上末端标记上3232P P的的DNADNA片片段在适当的试剂及条件下在段在适当的试剂及条件下在特定的碱基位置断裂。特定的碱基位置断裂。MaxamGilbertl根据对测序根据对测序DNA断裂的碱基位置不同，可分为四组：断裂的碱基位置不同，可分为四组：G组组表示表示DNA链在链在G位断裂，位断裂，G+A组组表示表示DNA在在G位和位和A位都可断裂位都可断裂T+C组组表示表示DNA在在T位和位和C位都可断裂位都可断裂C组组表示表示DNA在在C位断裂。位断裂。lG组组:用硫酸二甲
12、酯使嘌呤环上的用硫酸二甲酯使嘌呤环上的N7N7甲基化甲基化lG+A组组:用甲酸使用甲酸使A A和和G G嘌呤环上的嘌呤环上的N N质子化质子化lT+C组组:用肼使用肼使T T和和C C的嘧啶环断裂用哌啶除去碱基的嘧啶环断裂用哌啶除去碱基lC组组:当有盐存在时，只有当有盐存在时，只有C C与肼反应，并被哌啶除去与肼反应，并被哌啶除去l 将上述四种处理所得核苷酸片段进行凝胶电泳及放射自显将上述四种处理所得核苷酸片段进行凝胶电泳及放射自显影，将影，将G道与道与G+A道的条带作比较，即可知道道的条带作比较，即可知道DNADNA片段中何片段中何处是处是A及及G的断裂点。的断裂点。l同理，将同理，将C道和
13、道和T+C道的条带作比较，可推知道的条带作比较，可推知DNADNA片段中片段中T和和C的断裂点。的断裂点。l再将再将G、G+A、T+C及及C四道中的条带作综合比较，就可以四道中的条带作综合比较，就可以将将DNADNA分子中的核苷酸序列测定出来。分子中的核苷酸序列测定出来。l如待测如待测DNA片段：片段：5 -32P-GCTACGTA-3 在在特特异切断后，可得如下带有异切断后，可得如下带有32P的各种片段。的各种片段。在在A处切断：处切断：32P-GCT32P-GCTACGT在在G处切断：处切断：32P-GCTAC在在C处切断：处切断：32P-G32P-GCTA在在T处切断：处切断：32P-G
14、C32P-GCTACG则所测得的序列为：则所测得的序列为：CTACGTA进行凝胶电泳，最短的片段跑在最前面进行凝胶电泳，最短的片段跑在最前面经过放射自显影可得：经过放射自显影可得：（2）末端终止法(又名双脱氧法)DNA合成时，需要提供下列条件：合成时，需要提供下列条件：1.单链模板单链模板DNA2.DNA聚合酶聚合酶3.与模板与模板3端互补的引物端互补的引物4.四种脱氧核苷三磷酸四种脱氧核苷三磷酸(dATP、dGTP、dCTP和和dTTP)（2）末端终止法(又名双脱氧法)l该方法是在酶法测序技术基础上进行了改进，该方法是在酶法测序技术基础上进行了改进，以以2，3-双脱氧核苷三磷酸作为核苷酸链合
15、成的抑制剂双脱氧核苷三磷酸作为核苷酸链合成的抑制剂.22，3-3-双脱氧核苷三磷酸双脱氧核苷三磷酸（2）末端终止法(又名双脱氧法)l反应分别在反应分别在4个试管中进行，每一试管中都含有：个试管中进行，每一试管中都含有：1.待测的待测的DNA单链片段，作为模板。单链片段，作为模板。2.DNA聚合酶聚合酶(如如DNA聚合酶聚合酶I)。3.序列已知且与模板序列已知且与模板3端互补的引物。端互补的引物。4.四种脱氧核苷三磷酸四种脱氧核苷三磷酸(dATP、dGTP、dCTP和和dTTP)。5.四种双脱氧核苷酸中的一种，作为四种双脱氧核苷酸中的一种，作为DNA链合成的末端链合成的末端终止剂。终止剂。l 在
16、适当条件下进行互补链的合成，由于新掺在适当条件下进行互补链的合成，由于新掺入的核苷酸只能同新生链入的核苷酸只能同新生链3端的端的-OH连接，而连接，而2，3-双脱氧核苷三磷酸核糖基的双脱氧核苷三磷酸核糖基的2，3位位-OH的氧已脱掉，失去了和后来的核苷酸连接的可能的氧已脱掉，失去了和后来的核苷酸连接的可能性，这时碱基的掺入就有两种可能性：性，这时碱基的掺入就有两种可能性：（2）末端终止法(又名双脱氧法)l 一种可能是一种可能是dNTP掺入新生链，使链继续延伸。掺入新生链，使链继续延伸。l一种可能是一种可能是2，3-ddNTP掺入，使新生链的合掺入，使新生链的合成终止。成终止。l由于两者掺入的几
17、率不同，就形成一套长度不一由于两者掺入的几率不同，就形成一套长度不一的的DNA片段。最后通过片段。最后通过A、T、G和和C四组反应的四组反应的凝胶电泳放射自显影图谱，即可读出所测样品互凝胶电泳放射自显影图谱，即可读出所测样品互补链的核苷酸序列。补链的核苷酸序列。（2）末端终止法(又名双脱氧法)（2）末端终止法(又名双脱氧法)五五、DNA聚合酶链式反应聚合酶链式反应（PCR）l聚合酶链式反应聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）是一项是一项体外扩增体外扩增DNA的生物技术，已在全球广泛应用，其基本步的生物技术，已在全球广泛应用，其基本步骤是：骤是：l1、设计一对
18、、设计一对DNA扩增所需要的引物扩增所需要的引物l2、优化反应体系、优化反应体系包括适量的模板、引物、包括适量的模板、引物、4种种dNTP、TaqDNA聚合酶和适量聚合酶和适量Mg2+。l3、选择、选择3个温度进行热循环：个温度进行热循环：变性温度（变性温度（94oC）；退火温度（）；退火温度（待定oC）；延伸温度（）；延伸温度（72oC）l4、检测结果、检测结果最普通的方法是进行凝胶电泳，用溴化乙锭染色，紫外光下检测结最普通的方法是进行凝胶电泳，用溴化乙锭染色，紫外光下检测结果。果。PCRPCRPCR的基本反应步骤的基本反应步骤变性变性95C延伸延伸72C退火退火Tm-5CPCR PCR 循
19、环循环 第一步第一步 加热变性加热变性靶序列靶序列靶序列靶序列PCR PCR 循环循环- - 第二步第二步 引物与靶序列退火引物与靶序列退火靶序列靶序列靶序列靶序列Primer 1Primer 2BiotinBiotin53553533靶序列靶序列靶序列靶序列Primer 1Primer 2BiotinBiotin53553533Taq DNAPolymerasePCR PCR 循环循环 - - 第三步第三步 - - 引物延伸引物延伸 第第1个个 PCR 循环完成后循环完成后 得到两个拷贝的靶序列得到两个拷贝的靶序列靶序列靶序列 靶序列靶序列BiotinBiotin3030次循环后靶序列扩增的
20、数量次循环后靶序列扩增的数量No.ofNo.AmpliconCyclesCopiesofTarget122438416532664201,048,576301,073,741,8241cycle=2Amplicon2cycle=4Amplicon3cycle=8Amplicon4cycle=16Amplicon5cycle=32Amplicon6cycle=64Amplicon7cycle=128AmpliconDNA 聚合酶聚合酶-Taq酶酶l Taq Taq酶是从水生栖热菌酶是从水生栖热菌 Thermus AquaticusThermus Aquaticus（TaqTaq）中分离出的具有热
21、稳定性的中分离出的具有热稳定性的DNA DNA 聚合酶。聚合酶。 l TaqTaq酶的发现对于酶的发现对于PCRPCR技术的应用具有里程碑的意义。技术的应用具有里程碑的意义。PCRPCR循环包括变性（循环包括变性（9090C C左右）、退火（左右）、退火（5050C C左右）、左右）、延伸（延伸（7070C C左右），每一步对温度的要求都不一样，左右），每一步对温度的要求都不一样，多数酶在高温时即变性失活，然而该酶可以耐受多数酶在高温时即变性失活，然而该酶可以耐受9090以上的高温而不失活，所以不需要每个循环加酶，使以上的高温而不失活，所以不需要每个循环加酶，使PCRPCR技术变得非常简捷、同
22、时也大大降低了成本，技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本，PCRPCR技术得以大量应用，并逐步应用于临床。技术得以大量应用，并逐步应用于临床。l（PCRPCR动画动画） 第第1212章章 核酸通论核酸通论一、核酸的发现和研究简史一、核酸的发现和研究简史二、核酸的种类和分布二、核酸的种类和分布三、核酸的生物功能三、核酸的生物功能第第13章章 核酸的结构核酸的结构l一、核苷酸一、核苷酸(nucleotide)(nucleotide)l二、核酸的共价结构二、核酸的共价结构l三、三、DNADNA的高级结构的高级结构l四、四、RNARNA的高级结构的高级结构第14章核酸的物理化学性质l一、核酸的水解一、核酸的水解l二、核酸的酸碱性质二、核酸的酸碱性质l三、核酸的紫外吸收三、核酸的紫外吸收l四、核酸的变性、复性及杂交四、核酸的变性、复性及杂交第15章核酸的研究方法l 一、核酸的分离、提纯和定量测定一、核酸的分离、提纯和定量测定l 二、核酸的超速离心二、核酸的超速离心l 三、核酸的凝胶电泳三、核酸的凝胶电泳l 四、核酸的核苷酸序列测定四、核酸的核苷酸序列测定l 五、五、DNADNA聚合酶链反应聚合酶链反应(PCR)(PCR)l 六、六、DNADNA的化学合成的化学合成
