基因重组与基因工程课件

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1、基因重基因重组与基因工程与基因工程GeneticRecombination&GeneticGeneticRecombination&GeneticEngineeringEngineering基因重组与基因工程考核要求考核要求1.掌握基因重组的原理掌握基因重组的原理2.熟记基因工程技术中的基本原理熟记基因工程技术中的基本原理3.叙述基因工程的过程叙述基因工程的过程4.熟悉分子探针的运用熟悉分子探针的运用基因重组与基因工程基本概念基因重组与基因工程第一节：DNA的重组重组类型：重组类型：同源重组同源重组细菌介导的基因转移与重组细菌介导的基因转移与重组特异位点的重组特异位点的重组转座重组转座重组基因

2、重组与基因工程一、同源重组一、同源重组同源重组同源重组是指在两个是指在两个DNADNA分子同源序列间分子同源序列间通过链的断裂和再连接，进行单链或双通过链的断裂和再连接，进行单链或双链片段的交换，又称为基本重组，是最链片段的交换，又称为基本重组，是最基本的基本的DNADNA重组方式重组方式. .在真核生物和原核在真核生物和原核生物都有发生。生物都有发生。片段重组体片段重组体(patch recombinant)(patch recombinant)拼接重组体拼接重组体(splice recombinant) (splice recombinant) 基因重组与基因工程 内切酶内切酶 (recB

3、CD)DNA侵扰侵扰(recA)分支迁移分支迁移 (recA) 内切酶内切酶(recBCD) DNA 连接酶连接酶535353535353535353535353535353535335535353Holiday中间体中间体53535353基因重组与基因工程5353535353535353基因重组与基因工程53555333 DNA连接酶连接酶片片段段重重组组体体55553333内切酶内切酶(ruvC)内切酶内切酶(ruvC)53555333拼拼接接重重组组体体5555333353555333 DNA连接酶连接酶基因重组与基因工程意义意义1. 在减数分裂过程中，同源染色体之间在减数分裂过程中，同

4、源染色体之间 进行交换，形成生物个（群）体的多样性。进行交换，形成生物个（群）体的多样性。2. 是是DNA损伤修复的重要机制之一。损伤修复的重要机制之一。基因重组与基因工程基因重组与基因工程二、细菌的基因转移与重组二、细菌的基因转移与重组一、接合作用一、接合作用(conjugation)(conjugation)二、转化二、转化(transformation) (transformation) 三、转导三、转导 (transduction) (transduction)四、细胞融合四、细胞融合 以上均是在不同以上均是在不同DNADNA分子间发生的共价连接。分子间发生的共价连接。基因重组与基因工

5、程二、细菌的基因转移与重组二、细菌的基因转移与重组（一）接合作用（一）接合作用当当细细胞胞与与细细胞胞、或或细细菌菌通通过过菌菌毛毛相相互互接接触触时时，质质粒粒DNA从从一一个个细细胞胞（细细菌菌）转转移移至至另另一一细细胞胞（细细菌菌）的的DNA转转移移称称为为接接合合作用作用(conjugation)。基因重组与基因工程可接合质粒如可接合质粒如 F F 因子因子(F (F factor) factor) 基因重组与基因工程（二）转化作用（二）转化作用通过自动获取或人为地供给外源通过自动获取或人为地供给外源DNA，使细菌或培养的受体细胞获得新的遗传表型，使细菌或培养的受体细胞获得新的遗传表

6、型，称为称为转化作用转化作用 (transformation)。 基因重组与基因工程例：例：溶菌时，裂解的溶菌时，裂解的DNA片段被另一细菌摄取。片段被另一细菌摄取。基因重组与基因工程（三）转导作用（三）转导作用当当病病毒毒从从被被感感染染的的（供供体体）细细胞胞释释放放出出来来、再再次次感感染染另另一一（供供体体）细细胞胞时时，发发生生在在供供体体细细胞胞与与受受体体细细胞胞之之间间的的DNA转转移移及及基基因因重重组组即即为为转转导导作作用用(transduction)。基因重组与基因工程噬菌体的生活史噬菌体的生活史溶菌生长途径溶菌生长途径(lysis pathway)溶源菌生长途径溶源菌

7、生长途径(lysogenic pathway)基因重组与基因工程基因重组与基因工程*转染(transfection)l转染是染是转化的一种特殊形式。化的一种特殊形式。 由由transformation（转化）和化）和 infection（感染）（感染）两两词构成。构成。l原指将噬菌体、病毒或以其原指将噬菌体、病毒或以其为载体构建的重体构建的重组子子导入受体入受体细胞的胞的过程。程。l通通过感染方式将外来感染方式将外来DNA引入宿主引入宿主细胞，并胞，并导致致宿主宿主细胞胞遗传性状改性状改变的的过程称程称为转染。染。l将任何将任何类型型DNA转移至移至动物物细胞内的胞内的过程均可叫程均可叫转染。

8、染。基因重组与基因工程三、位点特异重组三、位点特异重组位点特异重组位点特异重组(site-specific recom-bination) 是由整合酶催化，在两是由整合酶催化，在两个个DNA序列的特异位点间发生的整合。序列的特异位点间发生的整合。基因重组与基因工程（一）（一）噬菌体噬菌体DNA的整合的整合噬噬菌菌体体的的整整合合酶酶识识别别噬噬菌菌体体和和宿宿主主染染色体的特异靶位点发生选择性整合；色体的特异靶位点发生选择性整合；反反转转录录病病毒毒整整合合酶酶可可特特异异地地识识别别、整整合合反反转转录录病病毒毒cDNA的的长长末末端端重重复复序序列列(long terminal repea

9、t, LTR)。 基因重组与基因工程 沙门氏菌沙门氏菌H H片段倒位决定鞭毛相转变。片段倒位决定鞭毛相转变。 H片段片段H1鞭毛蛋白鞭毛蛋白H2鞭毛蛋白鞭毛蛋白阻遏蛋白阻遏蛋白P2P2hixhix（二）细菌的特异位点重组（二）细菌的特异位点重组基因重组与基因工程（三）免疫球蛋白基因的重排（三）免疫球蛋白基因的重排免免疫疫球球蛋蛋白白(Ig)，由由两两条条轻轻链链(L链链)和和两两条条重重链链(H链链)组组成成，分分别别由由三三个个独独立立的的基基因因族族编编码码，其其中中两两个个编编码码轻轻链链( 和和 )，一一个个编编码码重链。重链。 轻链的基因片段：轻链的基因片段：重链的基因片段：重链的基

10、因片段：L V J C L V D J C 基因重组与基因工程基因重组与基因工程重重链链(IgH)基基因因的的V-D-J重重排排和和轻轻链链(IgL)基基因因的的V-J重重排排均均发发生生在在特特异异位位点点上上。在在V片片段段的的下下游游，J片片段段的的上上游游以以及及D片片段段的的两两侧侧均均存存在在保保守守的的重重组组信信 号号 序序 列列 (recombination signal sequence, RSS)。此此重重排排的的重重组组酶酶基基因因rag (recombination activating gene)共共有有两两个个，分分别别产产生生蛋蛋白白质质RAG1和和RAG2。

11、CACAGTG (12/23) ACAAAAACCGTGTCAC TGTTTTTGG重组信号序列重组信号序列基因片段基因片段基因重组与基因工程V片段片段J片段片段RSSRSS间插间插DNAOHOHVJ单链切开单链切开RAG1RAG2分子内转酯反应分子内转酯反应单链切开单链切开转移核苷酸转移核苷酸修复、连接修复、连接免免疫疫球球蛋蛋白白基基因因重重排排过过程程基因重组与基因工程基因重组与基因工程基因重组与基因工程基因重组与基因工程四、转座重组四、转座重组由由插插入入序序列列和和转转座座子子介介导导的的基基因因移移位或重排称为转座位或重排称为转座(transposition)。基因重组与基因工程插

12、入序列插入序列(insertion sequences, IS)组成：组成：二个反向重复序列二个反向重复序列(inverted repeats, IR)侧翼的正向重复序列侧翼的正向重复序列 一个转座酶（一个转座酶（transposase)编码基因编码基因 IRTransposase GeneIR转座形式：转座形式：保守性转座保守性转座(conservative transposition)复制性转座复制性转座(duplicative transposition)（一）插入序列转座（一）插入序列转座基因重组与基因工程插入序列的复制性转座插入序列的复制性转座基因重组与基因工程基因重组与基因工程转座

13、子转座子(transposons) 可从一个染色体可从一个染色体位点转移到另一位点的分散重复序列。位点转移到另一位点的分散重复序列。 转座子组成：转座子组成：反向重复序列反向重复序列转座酶编码基因转座酶编码基因抗生素抗性等有用的基因抗生素抗性等有用的基因IRIRTransposase Gene抗性基因抗性基因（二）转座子转座（二）转座子转座基因重组与基因工程基因重组与基因工程由转座子介导的转座由转座子介导的转座基因重组与基因工程第二节第二节重组重组DNADNA技术技术基因重组与基因工程重组重组DNA技术的发展史技术的发展史1865年年 G.J.Mendel的豌豆杂交试验的豌豆杂交试验18661

14、944年年 O.T.Avery的肺炎球菌转化实验的肺炎球菌转化实验1973年年 美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组美国斯坦福大学的科学家构建第一个重组DNA分子分子1977年年 美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上美国南旧金山由博耶和斯旺森建立世界上第一家遗传工程公司，专门应用重组第一家遗传工程公司，专门应用重组DNA技术技术制造医学上重要的药物。制造医学上重要的药物。1980年年 开始建造第一家应用重组开始建造第一家应用重组DNA技术生产技术生产胰岛素的工厂胰岛素的工厂1997年年 英国罗林研究所成功的克隆了多莉英国罗林研究所成功的克隆了多莉基因重组与基因工程一、相关概念一、相关概念DNA

15、克隆克隆工具酶工具酶目的基因目的基因基因载体基因载体二、基本原理及操作步骤二、基本原理及操作步骤 本节主要内容本节主要内容基因重组与基因工程一、重组一、重组DNA技术相关概念技术相关概念 克隆克隆(clone)来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。来自同一始祖的相同副本或拷贝的集合。获取同一拷贝的过程称为获取同一拷贝的过程称为克隆化克隆化(cloning)，即，即无性繁殖。无性繁殖。（一）（一） DNA克隆克隆基因重组与基因工程DNA克隆克隆应应用用酶酶学学的的方方法法，在在体体外外将将各各种种来来源源的的遗遗传传物物质质与与载载体体DNA接接合合成成一一具具有有自自我我复复制制能能力力的的DN

16、A分分子子复复制制子子(replicon)，继继而而通通过过转转化化或或转转染染宿宿主主细细胞胞，筛筛选选出出含含有有目目的的基基因因的的转转化化子子细细胞胞，再再进进行行扩扩增增提提取取获获得得大大量量同同一一DNA分分子子，也也称称基基因因克克隆隆或或重重组组DNA (recombinant DNA) 。基因重组与基因工程生物技术工程生物技术工程: 基因工程、蛋白质工程、基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程等。酶工程、细胞工程等。目的目的 分离获得某一目的基因或分离获得某一目的基因或DNA 获得目的基因的表达产物（蛋白质）获得目的基因的表达产物（蛋白质）基因工程基因工程(genetic

17、engineering) 实实现基因克隆所用的方法及相关的工作，又称现基因克隆所用的方法及相关的工作，又称重重组组DNA技术。技术。基因重组与基因工程（二）工具酶（二）工具酶 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶 DNA聚合酶聚合酶 逆转录酶逆转录酶 T4DNA连接酶连接酶 碱性磷酸酶碱性磷酸酶 末端转移酶末端转移酶 Taq DNA聚合酶聚合酶基因重组与基因工程重组重组DNA技术中常用的工具酶技术中常用的工具酶工工 具具 酶酶功功 能能限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶识别特异序列，切割识别特异序列，切割DNADNA连接酶连接酶催化催化DNA中相邻的中相邻的5磷酸基和磷酸基和3羟基末端之间形成磷酸羟

18、基末端之间形成磷酸二酯键，使二酯键，使DNA切口封合或使两个切口封合或使两个DNA分子或片段连接分子或片段连接DNA聚合酶聚合酶合成双链合成双链cDNA分子或片段连接分子或片段连接缺口平移制作高比活探针缺口平移制作高比活探针DNA序列分析序列分析填补填补3末端末端Klenow片段片段又名又名DNA聚合酶聚合酶I大片段，具有完整大片段，具有完整DNA聚合酶聚合酶I的的53 聚合、聚合、35 外切活性，而无外切活性，而无53 外切活外切活性。常用于性。常用于cDNA第二链合成，双链第二链合成，双链DNA 3 末端标记等末端标记等反转录酶反转录酶合成合成cDNA替代替代DNA聚合酶聚合酶I进行填补，

19、标记或进行填补，标记或DNA序列分析序列分析多聚核苷酸激酶多聚核苷酸激酶催化多聚核苷酸催化多聚核苷酸5羟基末端磷酸化，或标记探针羟基末端磷酸化，或标记探针末端转移酶末端转移酶在在3羟基末端进行同质多聚物加尾羟基末端进行同质多聚物加尾碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除末端磷酸基切除末端磷酸基基因重组与基因工程限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)识别识别DNA的特异序列的特异序列, 并在识别位点或并在识别位点或其周围切割双链其周围切割双链DNA的一类核酸内切酶。的一类核酸内切酶。GGATCCCCTAGGGCCTAGGATCC G+Bam H基因重组与基因工程作

20、用：作用：与与甲甲基基化化酶酶共共同同构构成成细细菌菌的的限限制制修修饰饰系系统统，限限制制外外源源DNA， 保保护护自自身身DNA。分类：分类：、类类（基因工程技术中常用的是基因工程技术中常用的是类类）基因重组与基因工程第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株；第四个字母代表株；用罗马数字表示发现的先后次序。用罗马数字表示发现的先后次序。命名：命名：Hin d 属属 系系 株株 序序H Haemophilus aemophilus ininfluenza

21、e fluenzae d d株株流感嗜血杆菌流感嗜血杆菌d d株的第三种酶株的第三种酶基因重组与基因工程类酶识别序列特点：类酶识别序列特点： 回文结构回文结构(palindrome)切口：切口：平端切口平端切口、粘端切口粘端切口GGGGA AT TCCCCCCCCT TA AGGGG基因重组与基因工程Bam HGTCCAGGCCTAGGATCC G+GGATCCCCTAGGHindGTCGACCAGCTGGACCTG+平端切口平端切口粘端切口粘端切口基因重组与基因工程有有些些限限制制性性内内切切酶酶虽虽然然识识别别序序列列不不完完全全相相同同，但但切切割割DNA后后，产产生生相相同同的的粘粘性

22、性末末端端，称称为为同同尾尾酶酶。这这两两个个相相同同的的粘粘性性末末端端称称为为配配伍伍未未端端(compatible end)。Bam Bam HHBg Bg ll GGATCC CCTAGG AGATCT TCTAGAGCCTAG GATCC G+ATCTAG GATCT A基因重组与基因工程（三）目的基因（三）目的基因 cDNA (complementary DNA)基因组基因组DNA (genomic DNA)基因重组与基因工程（四）基因载体（四）基因载体定义定义为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些有意义的蛋白质所采用的一

23、些DNA分子。分子。常用载体常用载体质粒质粒DNA噬菌体噬菌体DNA病毒病毒DNA基因重组与基因工程克隆载体克隆载体(cloning vector)为为使使插插入入的的外外源源DNA序序列列被被扩扩增增而而特特意设计的载体称为意设计的载体称为克隆载体克隆载体。表达载体表达载体(expression vector) 为为使使插插入入的的外外源源DNA序序列列可可转转录录翻翻译译成多肽链而特意设计的载体称为成多肽链而特意设计的载体称为表达载体表达载体。基因重组与基因工程载体的选择标准载体的选择标准能自主复制；能自主复制；具有两个以上的遗传标记物，便于重组体具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选

24、和鉴定；的筛选和鉴定；有克隆位点（外源有克隆位点（外源DNA插入点），常具插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；有多个单一酶切位点，称为多克隆位点；分子量小，以容纳较大的外源分子量小，以容纳较大的外源DNA。基因重组与基因工程1. 质粒质粒 (plasmid)特点特点: 能能在在宿宿主主细细胞胞内内独独立立自自主主复复制制；带带有有某某些些遗遗传信息传信息, 会赋予宿主细胞一些遗传性状。会赋予宿主细胞一些遗传性状。 细菌染色体外细菌染色体外的小型环状双链的小型环状双链DNADNA分子。分子。基因重组与基因工程基因重组与基因工程噬菌体噬菌体DNA改造系统改造系统 gt系列（插入型，适

25、用系列（插入型，适用cDNA克隆）克隆）EMBL系列（置换型，适用基因组克隆）系列（置换型，适用基因组克隆）2. 噬菌体噬菌体(phage) M13噬菌体噬菌体DNA改造系统（含改造系统（含lacZ基因）基因）M13mp系列系列pUC系列系列基因重组与基因工程Multiple Cloning Sites基因重组与基因工程3. 柯斯质粒柯斯质粒(cosmid)pJB8的物理图谱的物理图谱基因重组与基因工程酵母人工染色体酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC)动物病毒动物病毒DNA改造的载体改造的载体腺病毒载体腺病毒载体逆转录病毒载体逆转录病毒载体杆状病

26、毒载体杆状病毒载体其他其他基因重组与基因工程二、重组二、重组DNA技术基本原理技术基本原理目的基因的获取目的基因的获取重组重组DNA导入受体菌导入受体菌外源基因与载体的连接外源基因与载体的连接克隆载体的选择和构建克隆载体的选择和构建重组体的筛选重组体的筛选克隆基因的表达克隆基因的表达 基因重组与基因工程 以以 质质 粒粒 为为 载载 体体 的的DNA 克克 隆隆 过过 程程基因重组与基因工程（一）目的基因的获取（一）目的基因的获取1. 化学合成法化学合成法已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列基酸序列 。2.基因组基因组DNA文库文库(genomic

27、DNA library)3. cDNA文库文库(cDNA library)4. 聚合酶链反应聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) 基因重组与基因工程1.化学合成法化学合成法由已知氨基酸序列推测可能的由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列序列基因重组与基因工程组织或细胞染色体组织或细胞染色体DNADNA基因片段基因片段克隆载体克隆载体重组重组DNADNA分子分子含重组分子的转化菌含重组分子的转化菌限制性内切酶限制性内切酶受体菌受体菌存在于转化细菌内存在于转化细菌内由克隆载体所携带的所由克隆载体所携带的所有基因组有基因组DNA的集合的集合2. 基因组基因组DN

28、A文库文库基因重组与基因工程限制酶切位点限制酶切位点限制酶消化限制酶消化 除去中间片段除去中间片段cos LR coscos L左臂左臂R cos右臂右臂真核生物染真核生物染色体色体DNA限制酶部分消化限制酶部分消化 外源外源DNA与载体与载体DNA混合混合 连接反应连接反应 体外包装体外包装 用重组噬菌体用重组噬菌体感染大肠杆菌感染大肠杆菌 20 Kb DNA 片段片段 cos LR cos20 Kb 外源外源 DNA 片段片段 基因文库基因文库基因重组与基因工程mRNA cDNA 双链双链cDNA 重组重组DNA分子分子 cDNA文库文库 反转录酶反转录酶 载体载体 受体菌受体菌 复制复制

29、3.3.cDNAcDNA文库文库 逆转录酶逆转录酶A A A AT T T T AAAASISI核酸酶核酸酶 DNA聚合酶聚合酶碱水解碱水解T T T T基因重组与基因工程是一种在体外利用酶促反应大量获是一种在体外利用酶促反应大量获得特异序列的基因组得特异序列的基因组DNA或或cDNA的专的专门技术，又称为无细胞的分子克隆。门技术，又称为无细胞的分子克隆。4. 聚合酶链反应（聚合酶链反应（PCR）基因重组与基因工程（三）外源基因与载体的连接（三）外源基因与载体的连接1. 粘性末端连接粘性末端连接方式：方式：(1)同一限制酶切位点连接同一限制酶切位点连接(2)不同限制酶切位点连接不同限制酶切位点

30、连接（二）克隆载体的选择和构建二）克隆载体的选择和构建基因重组与基因工程Bam H切割反应切割反应 GGATCC CCTAGGT4 DNA连接酶连接酶15CGATCC GGCCTAG+目的基因用目的基因用 Bam H切割切割载体载体DNA用用Bam H切割切割重组体重组体载体自连载体自连目的基因自连目的基因自连同同一一限限制制酶酶切切位位点点连连接接基因重组与基因工程不同限制酶切位点的连接不同限制酶切位点的连接Eco R切割位点切割位点BgBgll切割位点切割位点+ +EcoR+ BgBgll双酶切双酶切Eco R+ BgBgll双酶切双酶切T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体配伍末端的

31、配伍末端的连接情况和同一连接情况和同一限制酶切位点连限制酶切位点连接相似。接相似。基因重组与基因工程2. 平端连接平端连接适用于：适用于：限制性内切酶切割产生的平端限制性内切酶切割产生的平端粘端补齐或切平形成的平端粘端补齐或切平形成的平端基因重组与基因工程目的基因目的基因载体载体限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶限制性内切酶T4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体载体自连载体自连目的基因目的基因 自连自连基因重组与基因工程3. 同聚物加尾连接同聚物加尾连接在末端转移酶在末端转移酶(terminal transferase)的作用下，在的作用下，在DNA片段末端加上同聚物序片段末端加上同聚物

32、序列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。列、制造出粘性末端，再进行粘端连接。基因重组与基因工程5335载体载体DNA5335目的基因目的基因限制酶或机械剪切限制酶或机械剪切限制酶限制酶 53 35 5 3 T(T)nT T(T)nT 35 5 3355 3 A(A)nA A(A)nA 35 -核酸外切酶核酸外切酶 -核酸外切酶核酸外切酶末端转移酶末端转移酶+ dATP末端转移酶末端转移酶+ dTTPT(T)nTA(A)nAA(A)nA T(T)nTT4 DNA连接酶连接酶15C重组体重组体基因重组与基因工程4. 人工接头人工接头(linker)连接连接由平端加上带有新的酶切位点的接头，由平端加上

33、带有新的酶切位点的接头，再用限制性酶切产生粘性末端，而进行粘再用限制性酶切产生粘性末端，而进行粘端连接。端连接。基因重组与基因工程Eco REco REco R人人工工接接头头及及其其应应用用CCGAATTCG GGCTTAAGC5-3-Eco R基因重组与基因工程受体菌条件受体菌条件安全宿主菌安全宿主菌 限制酶和重组酶缺陷限制酶和重组酶缺陷处于感受态处于感受态(competent) 导入方式导入方式转化转化 (transformation)转染转染 (transfection)感染感染 (infection)（四）重组（四）重组DNA导入受体菌导入受体菌基因重组与基因工程（五）重组体的筛选（

34、五）重组体的筛选1. 直接选择法直接选择法(1) 抗药性标记选择抗药性标记选择(2) 标志补救标志补救(marker rescue)(3) 分子杂交法分子杂交法原位杂交原位杂交Southern印迹印迹 2. 免疫学方法免疫学方法如免疫化学方法及酶免检测分析等如免疫化学方法及酶免检测分析等基因重组与基因工程( (插插入入失失活活法法) )抗抗药药性性标标记记选选择择基因重组与基因工程组氨酸缺陷组氨酸缺陷型大肠杆菌型大肠杆菌无组氨酸无组氨酸的培养基的培养基酵母咪唑甘油磷酵母咪唑甘油磷酸脱水酶基因酸脱水酶基因促进组氨酸合成促进组氨酸合成DNADNA重组体重组体标标志志补补救救基因重组与基因工程 互互

35、补补的的检检测测基因重组与基因工程原原位位杂杂交交基因重组与基因工程Southern印迹印迹基因重组与基因工程鸡的鸡的肌球蛋白的克隆和检出肌球蛋白的克隆和检出基因重组与基因工程重组重组DNA技术操作过程可形象归纳为技术操作过程可形象归纳为 小小 结结分分分离目的基因分离目的基因 切切限制酶切目的基因与载体限制酶切目的基因与载体接接拼接重组体拼接重组体 转转转入受体菌转入受体菌 筛筛筛选重组体筛选重组体 基因重组与基因工程重组重组DNADNA技术操作的主要步骤技术操作的主要步骤载体载体质粒质粒噬菌体噬菌体病毒病毒目的基因（外源基因）目的基因（外源基因）基因组基因组DNA cDNA 人工合成人工合

36、成PCR产物产物限制酶消化限制酶消化开环载体开环载体DNA目的基因目的基因连接酶连接酶重组体重组体转化转化体外包装，转染体外包装，转染带重组体的宿主带重组体的宿主筛选筛选表型筛选表型筛选酶切电泳鉴定酶切电泳鉴定菌落原位杂交菌落原位杂交基因重组与基因工程表达体系的建立表达体系的建立表达载体的构建表达载体的构建受体细胞的建立受体细胞的建立表达产物的分离纯化表达产物的分离纯化（六）克隆基因的表达（六）克隆基因的表达基因重组与基因工程1. 原核表达体系原核表达体系 （E.coli表达体系最为常用）表达体系最为常用）标准：标准：选择标志选择标志强启动子强启动子 翻译调控序列翻译调控序列多接头克隆位点多接

37、头克隆位点E.coli表达体系的不足表达体系的不足 不宜表达真核基因组不宜表达真核基因组DNA不能加工表达真核蛋白质不能加工表达真核蛋白质表达的蛋白质常形成不溶性包涵体表达的蛋白质常形成不溶性包涵体 (inclusion body) 很难表达大量可溶性蛋白很难表达大量可溶性蛋白基因重组与基因工程优点：优点：可表达克隆的可表达克隆的cDNA及真核基因组及真核基因组DNA可适当修饰表达的蛋白质可适当修饰表达的蛋白质表达产物分区域积累表达产物分区域积累缺点：缺点：操作技术难、费时、费钱操作技术难、费时、费钱转染转染 将表达载体导入真核细胞的过程将表达载体导入真核细胞的过程方法：方法：磷酸钙转染磷酸钙

38、转染DEAE葡聚糖介导转染葡聚糖介导转染电穿孔电穿孔 脂质体转染脂质体转染 显微注射显微注射 2. 真核表达体系真核表达体系 酵母、昆虫、哺乳类动物细胞酵母、昆虫、哺乳类动物细胞基因重组与基因工程表达载体表达载体pFASTBACI 的物理图谱的物理图谱基因重组与基因工程基因重组与基因工程（一）疾病基因的发现与克隆（一）疾病基因的发现与克隆根据基因定位克隆之并研究其性质，而认根据基因定位克隆之并研究其性质，而认识疾病的分子机制。识疾病的分子机制。三、重组技术与医学的关系三、重组技术与医学的关系（二）生（二）生物制药物制药基因重组与基因工程 重组重组DNA医药产品医药产品产产 品品功功 能能组织胞

39、浆素原激活剂组织胞浆素原激活剂抗凝抗凝血液因子血液因子VIII促进凝血促进凝血颗粒细胞颗粒细胞-巨噬细胞集落剌激因子巨噬细胞集落剌激因子剌激白细胞生成剌激白细胞生成促红细胞生成素促红细胞生成素剌激白细胞生成剌激白细胞生成生长因子生长因子(bFGF, EGF)刺激细胞生长与分化刺激细胞生长与分化生长素生长素治疗侏儒症治疗侏儒症胰岛素胰岛素治疗糖尿病治疗糖尿病干扰素干扰素( 1b, 2a, 2b, )抗病毒感染及某些肿瘤抗病毒感染及某些肿瘤白细胞介素白细胞介素激活、剌激各类白细胞激活、剌激各类白细胞超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶抗组织损伤抗组织损伤单克隆抗体单克隆抗体利用其结合特异性进行诊断试验、肿

40、利用其结合特异性进行诊断试验、肿瘤导向治疗瘤导向治疗乙肝疫苗乙肝疫苗(CHO, 酵母酵母)预防乙肝预防乙肝口服重组口服重组B亚单位菌体霍乱菌苗亚单位菌体霍乱菌苗预防霍乱预防霍乱基因重组与基因工程基基因因诊诊断断(genetic diagnosis)是利利用用分分子子生生物物学学及及分分子子遗遗传传的的技技术术和和原原理理，在在DNA水水平平分分析析、鉴鉴定定遗遗传传疾疾病病所所涉涉及及基基因因的的置置换换、缺失或插入等突变。缺失或插入等突变。（三）基因诊断（三）基因诊断基本过程基本过程区分或鉴定区分或鉴定DNA的异常的异常分离、扩增待测的分离、扩增待测的DNA片断片断基因重组与基因工程标准标准

41、. 能正确扩增靶基因；能正确扩增靶基因；. 能准确区分单个碱基的差别；能准确区分单个碱基的差别；. 本底或噪声低，不干扰本底或噪声低，不干扰DNA的鉴定的鉴定;. 便于完全自动化操作，适合大面积、便于完全自动化操作，适合大面积、大人群普查。大人群普查。基因重组与基因工程（四）基因治疗（四）基因治疗定义定义基因治疗基因治疗(gene therapy)是向有功能缺是向有功能缺陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补陷的细胞补充相应功能的基因，以纠正或补偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。偿其基因的缺陷，从而达到治疗的目的。方式方式体细胞基因治疗体细胞基因治疗 (somatic cell gene therapy)性细胞基因治疗性细胞基因治疗 (germ line gene therapy)基因重组与基因工程1. 产前诊断产前诊断2. 携带者测试携带者测试3. 症候前诊断症候前诊断4. 遗传病易感性遗传病易感性（五）遗传疾病的预防（五）遗传疾病的预防基因重组与基因工程复习思考题：1. 概念：（1）克隆（2）转化（3）转位（4）基因工程（5）转座（6）限制性核酸内切酶（7）载体（8）G文库（9）质粒（10）c文库2. 简述基因工程的基本过程。3. 简述目的基因的主要来源或途径。基因重组与基因工程基因重组与基因工程