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1、第五章、植物人工繁殖一、植物人工繁殖器官形成方式l植物无性繁殖过程中器官形成方式有：n 不定芽型 n 器官型 n 器官发生型 n 胚状体发生型 n 原球茎型 1、不定芽型：、不定芽型：l 诱导顶诱导顶端分生端分生组织产组织产生不定芽，再生成生不定芽，再生成植株的方式。即植株的方式。即选选取已取已经发经发育成熟的育成熟的顶顶芽和腋芽，芽和腋芽，连连同它同它们们的短枝的短枝经经表面消毒表面消毒后，在无菌条件下培养，后，在无菌条件下培养，诱导诱导不定芽并不定芽并使其生根形成植株的方式。使其生根形成植株的方式。l 只要有明只要有明显显的的顶顶端分生端分生组织组织和次生分生和次生分生组织组织的植物均适用
2、。的植物均适用。l特点：不特点：不仅仅繁殖率高，利用外植体原有繁殖率高，利用外植体原有的芽，包括的芽，包括隐隐芽在内繁殖数量大，同芽在内繁殖数量大，同时时能保持能保持该该物种的物种的遗传稳遗传稳定性。定性。不定芽型2、器官型：、器官型：l从器官外植体从器官外植体诱导诱导不定芽不定芽 ，再生成植株，再生成植株的方式。即的方式。即选选取充分取充分发发育的器官育的器官诸诸如茎、如茎、叶、花器、叶、花器、鳞鳞片等，片等，经经离体培养而离体培养而产产生生植株的方式。植株的方式。l如烟草、大蒜、甘如烟草、大蒜、甘蓝蓝的花茎培养的花茎培养诱导诱导不不定芽；水仙、百合、定芽；水仙、百合、风风信子、信子、贝贝母
3、的母的鳞鳞片培养片培养诱导诱导不定芽；不定芽；亚亚麻的下胚麻的下胚轴轴培养培养诱导诱导不定芽；虎眼万年青的任何一部分不定芽；虎眼万年青的任何一部分均可均可诱导诱导不定芽。不定芽。l特点：特点：遗传遗传性也比性也比较稳较稳定，但繁殖速度定，但繁殖速度慢。慢。3、器官、器官发发生型：生型：l从器官外植体从器官外植体诱导诱导愈愈伤组织伤组织，经经愈愈伤组伤组织细织细胞的分化再生成植株的方式。胞的分化再生成植株的方式。l例：禾本科：甘蔗、水稻、小麦，百合、例：禾本科：甘蔗、水稻、小麦，百合、小小苍兰苍兰、菊花、番茄、石刁柏、柑橘、菊花、番茄、石刁柏、柑橘、棕棕榈榈等常以器官等常以器官发发生型方式再生植
4、株。生型方式再生植株。l特点：繁殖速度快，由于特点：繁殖速度快，由于经经愈愈伤组织伤组织而而再生植株，再生植株，遗传遗传性不性不稳稳定。定。愈伤组织分化不定芽4、胚状体、胚状体发发生型生型l由植物器官、由植物器官、组织组织和和细细胞培养而直接胞培养而直接发发生生类类胚体胚体结结构，最后以胚状体成苗的方构，最后以胚状体成苗的方式。式。l在被子植物中有胚状体在被子植物中有胚状体发发生的植物已达生的植物已达100余种，分属近余种，分属近40个科。个科。l特点：特点：遗传遗传性一致，有些植物体性一致，有些植物体细细胞胞发发生数量也相当大。如胡生数量也相当大。如胡罗罗卜卜1L培养基有培养基有10万个以上
5、的胚状体。万个以上的胚状体。器官发生与胚状体发生几种器官发生方式的优点、缺几种器官发生方式的优点、缺点比较点比较l（1）不定芽型容易成苗，）不定芽型容易成苗，对对培养基要求培养基要求不高，后代不高，后代遗传遗传性性较为稳较为稳定，但取材受定，但取材受到一定的限制，到一定的限制，仅仅限于具有明限于具有明显顶显顶端分端分生生组织组织和次生分生和次生分生组织组织的物种；的物种；l（2）器官型和胚状体）器官型和胚状体发发生型，生型，对对培养基培养基要求高，器官要求高，器官发发生条件苛刻。繁殖数量生条件苛刻。繁殖数量不如不定芽型和器官不如不定芽型和器官发发生型多，但生型多，但遗传遗传性性稳稳定；定；l（
6、3）器官）器官发发生型成苗数量大，生型成苗数量大，对对培养基培养基要求不算高，容易要求不算高，容易调调配。但由于是通配。但由于是通过过愈愈伤组织伤组织成苗，成苗，细细胞的染色体容易胞的染色体容易发发生生数量和数量和结结构构变变异，很异，很难难使再生植株群体使再生植株群体保持保持稳稳定的定的遗传遗传性性。5、原球茎型、原球茎型l是是兰兰属特有的器官属特有的器官发发生方式。种子消毒生方式。种子消毒后，在培养基上播种，后，在培养基上播种，经经一段一段时间时间培养培养而而发发生原球茎，然后由原球茎直接生原球茎，然后由原球茎直接长长成成植株。植株。原球茎分化蝴蝶兰原球茎分化二、植物组织培养l植物组织培养
7、（plant tissue culture）：将植物器官、组织、细胞或原生质体等外植体材料于无菌条件下培养在人工培养基上，在适当条件下诱发长成完整植株的一种技术。主要内容l发展历史l植物组织培养的基本步骤l植物细胞分化与脱分化l植物组织培养再生植株的途径l植物组织培养的问题分析1、发展历史1l细胞学说 Schwann Schleidenl植物组织培养之父 Haberlanclt 1902年 细胞全能性 lWhite 1934年诱导愈伤组织。 1943年正式提出 细胞全能性 l植物激素的发现 F.W.Went发现生长素 1934年l1948年，崔徴和Skoog发现激素杠杆现象l1956年，发现K
8、Tl细胞-胚状体-植株 Steward 胡萝卜 1958年发展历史2l20世纪60年代后期，植物组织培养开始走向大规模应用阶段。n法国Morel(1952年)等以大丽花茎尖进行培养试验，得到了无病毒植株。通过原球茎途径快繁，成为“兰花工业”n1964-1966年，印度科学家Guha 和Maheswari 在曼陀罗花药培养中首次由花粉诱导得到了单倍体植株。n1972年，Carlson 通过两个种的烟草原生质体融合培养，获得了第一个体细胞杂交的杂种植株。2、植物组织培养的基本步骤l培养基的准备-培养材料的采集-消毒-制备外植体-接种和培养-芽和根的诱导-练苗移栽l涉及内容：涉及内容：l培养基及其配
9、制培养基及其配制l外植体的选择及处理外植体的选择及处理l接种和培养（环境条件的控制）接种和培养（环境条件的控制）l芽和根的诱导芽和根的诱导l组培苗的练苗和移栽组培苗的练苗和移栽（1）、培养基及其配制l基本培养基基本培养基l MS, B5, HE, SH, ER, NT, KM-8P, White, N6, RM, BM, Hoagland, CPW等等l完全培养基完全培养基l 培养基中包括植物生长所必需的培养基中包括植物生长所必需的16种营养元素和某些生理活性物质。种营养元素和某些生理活性物质。l生生长长物物质质配制：配制：lIAA、IBA、GA3先溶于少量先溶于少量95%酒精，酒精，再加水定
10、容至一定再加水定容至一定浓浓度；度；lNAA可溶于可溶于热热水或少量水或少量95%酒精中，再酒精中，再加水定容至一定加水定容至一定浓浓度度l2，4-D用用1MNaOH溶解后，再加水定容溶解后，再加水定容至一定至一定浓浓度度lKT和和BA先溶于少量先溶于少量1MHCl中，再加水中，再加水定容定容l玉米素先溶于少量玉米素先溶于少量95%酒精中，再加酒精中，再加热热水至一定水至一定浓浓度。度。培养基的配制培养基的配制l配制母液：按顺序加药，避免沉淀；l配制培养基：琼脂、糖、大量元素、微量元素、铁盐、有机物、激素、调pH值常用培养基l富盐平衡培养基：MS、LS、BL、BM、ERl高硝态氮培养基：B5、
11、N6、SH。l中盐培养基：Nitsch、Miller、Blaydes、Hl低盐培养基：White、WS、HE、HB母液配制 l母液配制顺序是：l用灵敏度为0.1mg的天平称取药品。l往烧杯中加入适量蒸馏水。l将药品放入烧杯内,并用玻璃棒搅拌使其溶解,难溶时可适当加温以加速溶解。l要待一种药品完全溶解再加入下一种药品l所加入的药品应依次加入，直至药品全部加入溶解为止,定容.l母液装入相应的瓶内，特别是有机成分的母液应该放入4冰箱。 （2）、外植体的选择及处理）、外植体的选择及处理1l选择优良的基因型选择优良的基因型l从健壮的植株上取材从健壮的植株上取材l选择外植体的大小选择外植体的大小l选取外植
12、体的时间选取外植体的时间(季节因素、天气因素）季节因素、天气因素）l （2）、外植体的选择及处理）、外植体的选择及处理2l取材母株的预处理取材母株的预处理l外植体休眠期的处理外植体休眠期的处理l外植体的消毒外植体的消毒外植体的消毒l第一，要第一，要选选取植物取植物组织组织内部无菌的材料内部无菌的材料l从健壮的植株上取材，不要取有从健壮的植株上取材，不要取有伤伤口的口的或有病虫的材料；或有病虫的材料；l晴天，最好是中午或下午取材，不要在晴天，最好是中午或下午取材，不要在阴雨天或露水未干阴雨天或露水未干时时取材。取材。l第二，第二，杀杀死材料表面死材料表面带带有的各种微生物有的各种微生物常用消毒剂
13、的使用及其效果常用的消毒剂常用的消毒剂l漂白粉漂白粉：一种常用的低毒有效的消毒一种常用的低毒有效的消毒剂剂，它是由多种成分它是由多种成分组组成的复合化合物，一成的复合化合物，一般含般含10-20%（W/V）次）次氯氯酸酸钙钙，易吸潮，易吸潮散失有效散失有效氯氯而失效，使用而失效，使用浓浓度一般度一般为为5-10%，或其，或其饱饱和溶液。取出上清夜，和溶液。取出上清夜，处处理材料理材料10-30分分钟钟，杀杀菌效果好，且不易菌效果好，且不易伤伤害害组织组织，活性，活性氯为氯为佳。佳。l密封密封贮贮存，防止失效，且不能存，防止失效，且不能贮贮藏太久，藏太久，特特别应别应随配随用。随配随用。l次次氯
14、氯酸酸钠钠：用市售的安替福民配制成含：用市售的安替福民配制成含210%的次的次氯氯酸酸钠钠，一般，一般组织组织浸泡浸泡1030分分钟钟。它分解。它分解氯氯气起气起杀杀菌作用，很菌作用，很易洗除，易洗除，对对植物无害。植物无害。l酒精：含量酒精：含量为为70-75%的酒精，具有的酒精，具有较较强强的渗透力和的渗透力和杀杀菌力，生菌力，生长组织长组织只需浸只需浸10-30秒秒钟钟。常用作表面。常用作表面灭灭菌的第一步，因菌的第一步，因不能不能彻彻底底杀杀菌，往往尚需用其他菌，往往尚需用其他杀杀菌菌剂剂灭灭菌。菌。常用的消毒剂常用的消毒剂l氯氯化汞：一种重金属化合物，有化汞：一种重金属化合物，有剧剧
15、毒。毒。0.1-0.2%氯氯化汞是一种效果极好的化汞是一种效果极好的杀杀菌菌剂剂。一般浸。一般浸3-12分分钟钟。用。用氯氯化汞消毒的化汞消毒的材料要用无菌水反复冲洗，洗材料要用无菌水反复冲洗，洗净净残留的残留的汞，否汞，否则对则对培养物会培养物会产产生毒害作用。生毒害作用。接种光照培养箱试管苗大规模培养愈伤组织分化不定芽炼苗和移栽l当小苗生根成为完整的再生植株后，可以出瓶种植l由于环境有很大的改变，首先要进行炼苗，使之适应外界环境n1）开盖，保持小苗的水分供需平衡n2）放置在与种植环境相一致的光、温条件下；或降低温度，增加光照n3）防止菌类滋生l一般采用三步法金线兰移栽一周的植株3、植物细胞
16、分化与脱分化1l在发育过程中，具有全能性的细胞（如在发育过程中，具有全能性的细胞（如受精卵细胞）逐步转变成形态、结构、受精卵细胞）逐步转变成形态、结构、功能各异的组织细胞的过程，称功能各异的组织细胞的过程，称细胞分化（cell differentiation）l机体发育的过程，实际上就是一个细胞机体发育的过程，实际上就是一个细胞分化的过程分化的过程植物细胞分化与脱分化2l已经分化的细胞，在一定的条件下，重已经分化的细胞，在一定的条件下，重新回复到原始的未分化状态，称新回复到原始的未分化状态，称去分化或脱分化（dedifferentiation）l愈伤组织（愈伤组织（callus）：）：愈伤组织
17、是由外植体组织增生的细胞产生的一团不定型的疏散排列的薄壁细胞。l去分化的细胞，在一定的条件下，又重去分化的细胞，在一定的条件下，又重新分化成各种特异性的组织细胞的过程，新分化成各种特异性的组织细胞的过程，称称再分化（redifferentiation）4、植物组织培养再生植株的途径l再生植株的途径n 器官发生途径 n 体细胞胚发生途径 器官发生途径1l器官器官发发生（生（organogenesis）：）：组织组织和和细细胞培养物形成的愈胞培养物形成的愈伤组织伤组织分化形成芽分化形成芽或根的或根的过过程。程。l外植体（外植体（explant）：用于离体无菌培养）：用于离体无菌培养的离体材料称的离
18、体材料称为为外植体，可以是器官、外植体，可以是器官、组织组织、细细胞和原生胞和原生质质体等。用于体等。用于继继代培代培养的养的组织组织培养培养物切段也可称物切段也可称为为外植体。外植体。器官发生途径2l外植体愈伤组织植株：n启动期n愈伤组织诱导与继代培养n拟分生组织的形成n器官原基和器官的形成l 器官形成有三种方式 n 先发芽后生根 n 先生根后发芽 n 同时生根发芽 体细胞胚发生途径l体细胞胚（somatic embryo）：又叫胚状体，指离体培养条件下没有经过受精过程而形成的胚胎类似物。l体细胞胚发生途径：n 器官外植体直接发生途径 n 悬浮培养细胞发生途径 n 愈伤组织发生途径 n 单细
19、胞发生途径：主要指小孢子或大孢子 n 原生质体发生途径 n 器官发生与胚状体发生的区别5、植物组织培养的问题分析l玻璃化问题l褐变问题l污染问题玻璃化及预防 l 植物组培玻璃化苗的叶和嫩梢呈水晶透明或半透明水渍状；整株矮化肿胀、失绿；叶片皱缩成纵向卷曲，脆弱易碎；叶表缺少角质层蜡质，没有功能性气孔，不具栅栏组织，仅有海绵组织。l 玻璃化苗中因其体内含水量高，干物质、叶绿素、蛋白质、纤维素和酶活性降低，组织畸形，器官功能不全，分化能力降低，所以很难成活，严重影响组培苗繁殖率的提高。 l 玻璃化的起因是细胞生长过程中的环境变化。试管苗为了适应变化了的环境而呈玻璃状。产生玻璃化苗的因素主要有激素浓度
20、、琼脂用量、温度、离子水平、光照时间、通风条件等。 预防措施l 尽管玻璃化苗的出现已成为不少快速繁殖的中的普遍现象，但目前对某些植物的玻璃化已得到有效控制。1）.适当控制培养基中无机营养成分l 大多数植物在MS培养基上生长良好，玻璃化苗的比例较低，主要是由于MS培养基的硝态氮、钙、锌、锰的含量较高的缘故。适当增加培养基中钙、锌、锰、钾、铁、铜、镁的含量，降低氮和氯元素比例，特别是降低铵态氮浓度，提高硝态氮浓度，可减少玻璃化苗的比例。2）.适当提高培养基中蔗糖和琼脂的浓度l 适当提高培养基中蔗糖的含量，可降低培养基中的渗透势，减少外植体从培养基中获得过多的水分。而适当提高培养基中琼脂的含量，尤其
21、在高温季节，可降低培养基的衬质势，造成细胞吸水阻遏，也可降低玻璃化；如将琼脂浓度提高到1.1%时，洋蓟的玻璃化苗完全消失。3）.适当降低细胞分裂素和赤霉素的浓度l 细胞分裂素和赤霉素可以促进芽的分化，但是为了防止玻璃化现象，应适当减少其用量，或增加生长素的比例。在继代培养时，要逐步减少细胞分裂素的含量。4）.增加自然光照，控制光照时间l 在试验中发现，玻璃苗放在自然光下几天后茎、叶变红，玻璃化逐渐消失。这是因为自然光中的紫外线能促进试管苗成熟，加快木质化。光照时间不宜太长，大多数植物以812h为宜；光照度在100018001x之间，就此可以满足植物生长的要求。5）.控制好温度l 培养温度要适宜
22、植物的正常生长发育。如果培养室的温度过低，应采取增温措施。热击处理，可防治玻璃化的发生。如用40热击处理瑞香愈伤组织培养物可完全消除其再生苗的玻璃化，同时还能提高愈伤组织芽的分化频率。6）.改善培养器皿的气体交换状况l 如使用棉塞、滤纸片或通气好的封口膜封口。7）.在培养基中添加其他物质l 在培养基中加入间苯三酚或根皮苷或其他添加物，可有效地减轻或防治试管苗玻璃化，如用0.5mg/L多效唑或10mg/L的矮壮素可减少重瓣丝石竹试管苗玻璃化的发生。在培养基中加入0.3的活性炭可降低玻璃苗的产生频率，对防止产生玻璃化有良好作用。 外植体褐变及防止 l 褐变是指外植体在培养过程中体内的多酚氧化酶被激
23、活，使细胞里的酚类物质氧化成棕褐色的醌类物质，这种致死性的褐化物不但向外扩散致使培养基逐渐变成褐色，而且还会抑制其他酶的活性，严重影响外植体的脱分化和器官分化，最后变褐而死亡的现象。 褐变的原因l 影响褐变的因素极其复杂，与植物种类、基因型、外植体年龄、取材时间、盐浓度、植物生长物质、培养条件、材料转移时间等有关。l 褐变的防止措施l选择适宜的外植体l适宜培养基l连续转移l加抗氧化剂l加活性炭污染及防止l外植体的选择及预处理l改进消毒方法l反复检查培养物l使用抗生素三、人工种子l概念：人工种子是外面包裹一层有机薄膜的植物胚状体。l 其实，任何一种繁殖体，无论是在涂膜胶囊中包裹的、裸露的或经干燥
24、的，只要能够发育成完整的植株，均可称之为人工种子。l人工种子的优势l人工种子的制作流程l人工种子的包埋方法l人工种子的贮存l存在问题胚状体与合子胚的比较人工种子的优势l采用人工种子进行快速繁殖便于运输和贮藏l人工胚乳可根据不同植物的要求配制，这样获得的人工种子就优越于天然种子，使生产效率更高。l可以固定杂种优势，加速良种繁育l可作为植物基因工程和遗传工程的桥梁l可保存珍贵品种人工种子的制作流程人工种子的包埋方法l液胶包埋法：液胶包埋法是将胚状体或小植株悬浮在一种粘滞的流体胶中直接播入土壤l干燥包埋法：干燥法是将体细胞胚经干燥后再用聚氧乙烯等聚合物进行包埋的方法l水凝胶法：通过离子交换或温度突变
25、形成的凝胶包裹材料的方法n离子交换凝胶：海藻酸盐n变温凝胶：琼脂离子交换凝胶法四、植物胚胎培养l植物胚胎培养（plant embryo culture）：指对植物的胚及胚性器官（如子房、胚珠）进行人工离体无菌培养，使其发育成幼苗的技术n 成熟胚及幼胚培养 n 胚乳培养 n 胚珠培养 n 子房培养 五、脱毒植物培养l诊诊断：了解供断：了解供试试材料感染病毒的种材料感染病毒的种类类l脱毒：根据所携脱毒：根据所携带带的病毒种的病毒种类选择类选择合适合适的的处处理方法理方法l鉴鉴定：由于大多数植物定：由于大多数植物经过经过脱毒脱毒处处理后，理后，其再生植株仍然其再生植株仍然带带病，有病，有时时无病毒植
26、株无病毒植株只占千分之几。所以只占千分之几。所以对对再生植株再生植株进进行行鉴鉴定，从中定，从中选选出无病毒苗是十分必要的。出无病毒苗是十分必要的。植物脱毒方法l物理方法n高温处理u温汤处理u热风处理n低温处理l化学方法l生物方法n茎尖培养n微体嫁接法n愈伤组织诱导脱毒n珠心胚培养法n花药培养脱毒脱毒植物鉴定l直接检测法l指示植物法n摩擦接种法n嫁接法l电镜法l抗血清检测法l分子检测技术马铃薯脱毒技术l马铃薯在营养繁殖时易受病毒的浸染，当条件适合时，病毒就会在植株内增殖，转运和积累，随着世代传递，病毒危害逐年加重，一般可造成减产50以上。研究发现，有30多种病毒易感染马铃薯，并引起品种退化，严
27、重影响马铃薯的生产。通过微茎尖组织培养技术能从马铃薯体内脱除PLRV、PVY、PVA、PAF、PVG、PVM、PSW等病毒。取材和培养l一般多采用在室内发芽，芽经热处理（38）2周。然后取顶芽或侧芽1厘米的茎尖，在自来水下冲洗干净，无菌条件下先用70的酒精浸润组织15-20秒，再用2的次氯酸钠溶液浸泡4-5min，然后用无菌水冲洗3次。马铃薯脱毒试管苗l预防组培苗玻璃化有哪些措施？l防止褐化有哪些方法？l简述人工种子的操作流程l植物脱毒有哪些方法？l脱毒植物的鉴定有哪些方法？l植物组织培养技术可应用到哪些方面？举一例加以说明。（课外作业，10月15日之前交）思考题1l名词：植物组织培养、愈伤组织、外植体、胚状体、器官发生、人工种子l试述植物组织培养的一般步骤l如何配制培养基母液？l如何配制培养基？l选择外植体时应注意什么？l植物无性繁殖过程中器官形成有哪些方式？
