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1、中式卷烟的中式卷烟的生物医学评价技术生物医学评价技术报告内容报告内容发展中式卷烟的意义发展中式卷烟的意义 从吸烟与健康谈起从吸烟与健康谈起中式卷烟的生物医学评价技术中式卷烟的生物医学评价技术 技术原理与方法技术原理与方法代表性中式卷烟的安全性评价举例代表性中式卷烟的安全性评价举例 烟丝添加神农液降低卷烟危害烟丝添加神农液降低卷烟危害 使用使用SRMSRM生物滤嘴降低卷烟危害生物滤嘴降低卷烟危害 吸烟与健康吸烟与健康事实与问题事实与问题A全全世世界界1/3的的成成年年男男性性吸吸烟烟，香香烟烟销销售售量量约约1.5 1010支支/d（约约1.0 107支支/min）A未未成成年年人人中中有有近近
2、1/5的的吸吸烟烟者者，而而且且每每天天还还以以810万万人人的的速速度度增加（近一半在亚洲）增加（近一半在亚洲）A发发达达国国家家吸吸烟烟人人数数呈呈下下降降趋趋势势，但但女女性性吸吸烟烟者者增增多多。目目前前美美国国吸吸烟烟的的女女性性约约2200万万人人，韩韩国国女女性性吸吸烟烟比比例例从从1989年年的的3.9%上上升升到到1998年年的的6.7%，增增加加了了近近2倍倍；在在日日本本，最最近近十十年年中中女女性性吸烟者的比例也达到近吸烟者的比例也达到近10%A在在中中国国，香香烟烟消消费费量量占占全全世世界界1/3，每每年年消消耗耗的的香香烟烟数数约约1.7 1012支支（每每分分钟
3、钟3.0 106支支），吸吸烟烟人人数数3.2亿亿，比比整整个个美美国国人人口口还还多多，成成年年人人中中，约约67%的的男男性性和和4%的的女女性性吸吸烟烟，未未成年人中，约成年人中，约1/3的男性和的男性和8%的女性吸烟的女性吸烟WHOWHO：20042004年公布的统计数字年公布的统计数字事实事实1965199819651998年间美国大于年间美国大于1818岁公民中吸烟者的比例（按性别）岁公民中吸烟者的比例（按性别）（CDC，MMWR, 2000，Vol 49, No. 39） 事实事实19641964 US Surgeon General US Surgeon General报告报告
4、吸烟对健康的不良影响吸烟对健康的不良影响19651965 41% 41%的美国成年人吸烟的美国成年人吸烟19671967 烟盒上标示烟盒上标示“吸烟有害健康吸烟有害健康”19701970 电视上禁止烟草广告电视上禁止烟草广告20002000 美国只有美国只有25%25%的成年人吸烟的成年人吸烟1900199819001998年间美国成年人年均吸烟年间美国成年人年均吸烟量量 u烟烟草草中中含含有有大大量量碳碳水水化化合合物物（占占40%50%），羧羧酸酸，色色素素，萜萜烯烯类类，链链烷烷烃烃，类类脂脂物物质质，以以及及一一些些生生长长必必需需的的营营养养物物（如如硝硝酸酸盐盐等等）和和某某些些污
5、污染染物物（如如农农药、重金属等）药、重金属等）u吸吸烟烟是是不不完完全全燃燃烧烧过过程程，烟烟草草经经一一系系列列热热分分解解与与热热合合成成反反应应，产产生生大大量量化化学学物物质质。据据分分析析，烟烟气气中中化化学学成成分分共共5068种种，除除烟烟草草中中存存在在的的1172种种外外，3896种是吸烟过程中产生的新的化学物质种是吸烟过程中产生的新的化学物质RobertsRoberts，1988 Tobacco Reporter1988 Tobacco Reporter事实事实u卷烟烟气卷烟烟气的的粒相物粒相物（如脂肪烃、芳香烃、萜类、羰基化合物、酚（如脂肪烃、芳香烃、萜类、羰基化合物、
6、酚类、有机酸、氮杂环、亚硝胺、金属）和类、有机酸、氮杂环、亚硝胺、金属）和气相物气相物（如氮、氧、（如氮、氧、CO2、CO、氢、挥发性烃类、酯类、呋喃类、腈类）中包含多、氢、挥发性烃类、酯类、呋喃类、腈类）中包含多种有害成分，如气相中的种有害成分，如气相中的CO、氮氧化物、丙烯醛、挥发性芳香、氮氧化物、丙烯醛、挥发性芳香烃、氢氰酸，粒相中的稠环芳烃、酚类、烟碱、亚硝胺、杂环化烃、氢氰酸，粒相中的稠环芳烃、酚类、烟碱、亚硝胺、杂环化合物及微量放射性元素，以及气相与粒相中都存在的自由基等合物及微量放射性元素，以及气相与粒相中都存在的自由基等uHoffmann list：卷烟烟气存在卷烟烟气存在44
7、种有害成分种有害成分 69种致癌物中种致癌物中（包括一些促癌剂或辅致癌物）（包括一些促癌剂或辅致癌物）NNK最受关注最受关注HoffmannD：ChemResToxicol2001;14(7):767-90 40年吸烟（年吸烟（40支支/天）的累积天）的累积NNK量可致癌量可致癌HoffmannD：PrevMed1997;26(4):427-34事实事实u几乎所有的机体组织、器官或系统均可受到几乎所有的机体组织、器官或系统均可受到吸烟吸烟的影响，的影响，其中，最敏感的部位是呼吸系统（肺、气管、咽喉）、其中，最敏感的部位是呼吸系统（肺、气管、咽喉）、循环系统（心脏、血管），神经系统（脑），免疫和
8、抗循环系统（心脏、血管），神经系统（脑），免疫和抗氧系统也是近年来研究较多的问题。孕妇、未成年人氧系统也是近年来研究较多的问题。孕妇、未成年人（特别是婴育儿）对吸烟的敏感性尤为值得关注（特别是婴育儿）对吸烟的敏感性尤为值得关注u吸烟吸烟可造成可造成4040种致命种致命疾病疾病，包括口腔癌、食道癌、喉癌、，包括口腔癌、食道癌、喉癌、肺癌、胰腺癌、胆囊癌、子宫内膜癌及其他非常罕见的肺癌、胰腺癌、胆囊癌、子宫内膜癌及其他非常罕见的疾病等。长期吸烟者肺癌发病率比不吸烟者高疾病等。长期吸烟者肺癌发病率比不吸烟者高10201020倍，倍，喉癌发病率高喉癌发病率高610610倍，冠心病发病率高倍，冠心病发病
9、率高2323倍。循环系倍。循环系统发病率高统发病率高3 3倍，气管炎发病率高倍，气管炎发病率高2828倍倍英国牛津拉德克里夫医院英国牛津拉德克里夫医院ICRF癌症研究中心癌症研究中心医学统计与流行病学教授医学统计与流行病学教授RichardPeto世界卫生组织烟草与卫生规划署研究员世界卫生组织烟草与卫生规划署研究员AlanD.Lopez19502000年期间发达国家的吸烟死亡率年期间发达国家的吸烟死亡率事实事实u全世界每年死于与全世界每年死于与吸烟吸烟有关的疾病人数达有关的疾病人数达400万，相当于每万，相当于每8秒就有秒就有1人死亡。预计这一数字在人死亡。预计这一数字在2020年会上升到年会
10、上升到1000万万u在中国，平均每天约有在中国，平均每天约有3 000人死于吸烟人死于吸烟 世界卫生组织烟草与卫生规划署世界卫生组织烟草与卫生规划署烟草与卫生：全球状况报告烟草与卫生：全球状况报告u在美国，因吸烟引起的死亡，包括母亲吸烟所致婴儿早熟及被动吸在美国，因吸烟引起的死亡，包括母亲吸烟所致婴儿早熟及被动吸烟等间接的影响在内，每年估计超过烟等间接的影响在内，每年估计超过400 000人，约为全部死亡数人，约为全部死亡数的的1/5，由此花费的医疗和保健费用约，由此花费的医疗和保健费用约1500亿美元亿美元 美国每年死于与吸烟有关美国每年死于与吸烟有关的疾病人数（的疾病人数（430,0004
11、30,000人）人） (引自：引自：CDC,MMWR1999;48;131-38)(19901994年间年平均值年间年平均值)事实事实19941994年美国与吸烟有关的疾病死亡情况年美国与吸烟有关的疾病死亡情况（引自：（引自：CDCCDC，MMWR 1997, Vol. 48, No. 43; 993-996MMWR 1997, Vol. 48, No. 43; 993-996）疾病男性女性合并癌症癌症肺癌81,17935,741116,920食道癌1,0551,9453,000其他癌症21,6599,74331,402合计103,89347,429151,322心血管疾病心血管疾病 高血压3
12、,2332,1515,450心脏病88,64445,591134,235中风14,9788,30323,281其他心血管疾病11,6825,17216,854合计118,60361,117179,820呼吸器官疾病肺炎11,2927,88119,173支气管炎/肺气肿9,2345,54114,865慢性阻塞性肺障碍30,38518,579 48,982其他呼吸疾病787 6681,455合计51,78832,689 84,475婴儿患病数1,0067051,711火灾死亡人数863499 1,362总数276,153276,153142,537142,537418,690418,6901995
13、年英国因吸烟的疾病死亡人数统计数据( (引自：引自：Health Education Authority, 1998)Health Education Authority, 1998)在英国，在英国，估计每年有估计每年有28.4万万 人因吸烟引起的疾病住院治人因吸烟引起的疾病住院治疗，其中死亡人数约疗，其中死亡人数约12万人。万人。据估计，据估计，19502000年间，年间，英国有英国有600万人死于与吸烟万人死于与吸烟有关的疾病，平均每年死于有关的疾病，平均每年死于吸烟的人数是二战前的吸烟的人数是二战前的12 倍。倍。1995年，英国死于吸年，英国死于吸烟的人数为烟的人数为12.31万人，是
14、万人，是交通事故交通事故(3444人人)、吸毒、吸毒(2663)、犯罪谋杀、犯罪谋杀(503)、自杀自杀(4379)、爱滋病、爱滋病(195)以及其他意外死亡以及其他意外死亡(8986)的的总和总和（20170）的的6倍倍疾病疾病死亡百分比死亡百分比死亡人数死亡人数男性男性女性女性男性男性女性女性合并合并癌症癌症肺癌907321,1009,50030,600咽喉癌74471,5004001,900食管癌71622,9001,6004,500膀胱癌48171,7003002,000肾癌415700100800胃癌35101,7003002,000胰癌21256008001,500其他癌症3472
15、,4005003,000白血病1910200100300合合计46,600心血管疾病心血管疾病心脏病231118,7007,60026,400主动脉瘤62484,0001,8005,800心肌退化2410300300600动脉硬化症175100100200中风1393,4003,9007,300合合计40,300其他疾病其他疾病支气管炎和肺气肿867915,1009,30024,400肺炎25115,8004,1009,900胃和十二指肠溃疡4741100010001,900总计81,30041,700123,100吸烟避免死亡吸烟避免死亡巴金森氏症9003001,200子宫肌瘤100100合
16、合计9004001,300总数数80,40041,300121,800问题问题u如果不进行剂量分析和评价，单凭卷烟烟气中存在的如果不进行剂量分析和评价，单凭卷烟烟气中存在的有害成分，就认定其对健康有不良影响，是不科学的有害成分，就认定其对健康有不良影响，是不科学的“所有的物质本身并非毒物，剂量才使一种物质变成毒物所有的物质本身并非毒物，剂量才使一种物质变成毒物”“毒物和药物之间的区别在于正确的剂量毒物和药物之间的区别在于正确的剂量”1616世纪著名医学家世纪著名医学家ParacelsusParacelsusu与城市空气污染比较，人类接触有害环境因素中，来与城市空气污染比较，人类接触有害环境因素
17、中，来自于卷烟烟气，相对来说是较少的自于卷烟烟气，相对来说是较少的u目前，目前，“吸烟有害健康吸烟有害健康”的的“证据证据”主要来自于流行主要来自于流行病学调查和动物实验研究的结果，存在商榷之处病学调查和动物实验研究的结果，存在商榷之处吸烟者的吸烟者的“误区误区”停止吸烟会导致体重增加停止吸烟会导致体重增加没有直接证据表明吸烟能导致癌症没有直接证据表明吸烟能导致癌症肺癌是多因素疾病肺癌是多因素疾病绝大多数人都吸烟绝大多数人都吸烟吸烟的危害远没有政府宣传和倡导的那么严重吸烟的危害远没有政府宣传和倡导的那么严重许多重度吸烟者并没有得病，且寿命很长许多重度吸烟者并没有得病，且寿命很长目前市场是的烟焦
18、油量都较低，每天吸烟少于目前市场是的烟焦油量都较低，每天吸烟少于2020支应该说是安全的支应该说是安全的环境烟草烟气对不吸烟者并没有严重的影响环境烟草烟气对不吸烟者并没有严重的影响问题问题中式卷烟的中式卷烟的生物医学评价技术生物医学评价技术技术原理与方法技术原理与方法筛选对烟气敏感的细胞筛选对烟气敏感的细胞系：系：用于实验研究的细胞用于实验研究的细胞系有数百种，其中人支气系有数百种，其中人支气管上皮细胞管上皮细胞(BEAS-2B)富富含含P450酶，在无需代谢活酶，在无需代谢活化因子化因子S9时能转化利用时能转化利用NNK等烟气中主要有害物等烟气中主要有害物质质研制中的细胞气体中毒装置研制中的
19、细胞气体中毒装置：细胞在培养液中染毒，与人类吸烟细胞在培养液中染毒，与人类吸烟实际情况有差别，研制细胞气体中实际情况有差别，研制细胞气体中毒装置对烟气评价意义重大毒装置对烟气评价意义重大卷烟烟气毒理学评价卷烟烟气毒理学评价动物吸烟中毒实验模动物吸烟中毒实验模型建立：型建立：动物在恒动物在恒氧、恒压、恒湿、氧、恒压、恒湿、恒温和烟气均匀条恒温和烟气均匀条件下自由吸入卷烟件下自由吸入卷烟烟气烟气动物吸烟试验动物吸烟试验烟气细胞中毒试验烟气细胞中毒试验急性毒性评价方案评价方案急急性性毒毒性性慢慢性性毒毒性性蓄蓄积积毒毒性性生生殖殖毒毒性性免免疫疫毒毒性性增增殖殖死死亡亡氧氧化化损损伤伤膜膜损损伤伤致
20、致突突致致畸畸致致癌癌基基因因毒毒性性烟草烟气中有数千种物质，单一烟草烟气中有数千种物质，单一或数种有害成分的分析难以全面真实或数种有害成分的分析难以全面真实客观地反映吸烟的健康影响。卷烟烟客观地反映吸烟的健康影响。卷烟烟气毒理学评价是以吸烟产生的烟气做气毒理学评价是以吸烟产生的烟气做为整体，通过动物和细胞中毒试验，为整体，通过动物和细胞中毒试验，用毒理学的方法，对卷烟烟气的健康用毒理学的方法，对卷烟烟气的健康影响进行评价。通过与同品质对照烟影响进行评价。通过与同品质对照烟比较，检验降焦减害技术应用于卷烟比较，检验降焦减害技术应用于卷烟中提高卷烟安全性的效果。中提高卷烟安全性的效果。 其其他他
21、功功能能检检测测第第一一级级，动动物物要要求求2 2种种，雌雌雄雄各各半半，细细胞胞至至少少2 2种种，代代表表人人和和动动物物来来源源的的支支气气管管和和成成纤纤维维细细胞胞各各1 1种种。最最好好是是2 2种种染染毒毒途途径径。如如果果两两种种卷卷烟烟（一一般般是是试试验验样样品品烟烟和和对对照照烟烟）的的急急性性毒毒性性差差异异明明显显，则则无无需需进进行行进进一一步步的的评评价，否则需进行第二级和第三级，甚至其他评价实验价，否则需进行第二级和第三级，甚至其他评价实验分级评价方案分级评价方案动物实验动物实验细胞实验细胞实验一级一级急性毒性试验急性毒性试验细胞存活试验细胞存活试验二级二级亚
22、慢毒试验亚慢毒试验细胞氧化应激和细胞膜损伤试验细胞氧化应激和细胞膜损伤试验三级三级三致（致突、致畸和致癌）试验三致（致突、致畸和致癌）试验基因突变和细胞转化试验基因突变和细胞转化试验其他实验其他实验免疫和抗氧化功能损伤，呼吸道免疫和抗氧化功能损伤，呼吸道损伤，心血管系统检查等损伤，心血管系统检查等基因与蛋白质表达水平检测基因与蛋白质表达水平检测实验动物及其吸烟染毒实验动物及其吸烟染毒实验动物实验动物 昆明小鼠和昆明小鼠和WistarWistar大鼠是我国大鼠是我国“新药审批办法新药审批办法”推荐使推荐使用的动物。动物到达后，按用的动物。动物到达后，按SOPA034SOPA034的要求接收。每笼
23、的要求接收。每笼5 5只，饲养在只，饲养在二级动物房内，温度二级动物房内，温度303011，湿度，湿度60605%5%。由获得资格认可的人员。由获得资格认可的人员饲养。所有动物按饲养。所有动物按SOPA035SOPA035要求检疫观察要求检疫观察1-31-3天，在此时间内观察动天，在此时间内观察动物的疾病和死亡指征，出现异常现象需向专题负责人和临床兽医报物的疾病和死亡指征，出现异常现象需向专题负责人和临床兽医报告。由实验动物中心提供标准饲料。从动物到达至研究结束自由摄告。由实验动物中心提供标准饲料。从动物到达至研究结束自由摄食。用饮水瓶供应消毒自来水，由动物自由饮用。每日冲洗饮水瓶食。用饮水瓶
24、供应消毒自来水，由动物自由饮用。每日冲洗饮水瓶吸烟染毒吸烟染毒 用吸烟器吸烟，将烟气导入中毒室（有机玻璃盒），动用吸烟器吸烟，将烟气导入中毒室（有机玻璃盒），动物在恒氧、恒压、恒湿、恒温和烟气均匀的条件下自由吸入卷烟烟物在恒氧、恒压、恒湿、恒温和烟气均匀的条件下自由吸入卷烟烟气，造成动物吸烟中毒的实验模型气，造成动物吸烟中毒的实验模型E用于实验研究的靶细胞主要有用于实验研究的靶细胞主要有鼠鼠或或人人来源的来源的成纤维细胞成纤维细胞和和上皮细胞上皮细胞四大类四大类v叙利亚地鼠胚胎细胞叙利亚地鼠胚胎细胞（SHE）R优点：优点：易获得，易培养，稳定，经济易获得，易培养，稳定，经济Q缺点：缺点：敏感性
25、较差，结果难以外推到人敏感性较差，结果难以外推到人v人支气管上皮细胞人支气管上皮细胞（BEAS-2B）R优点优点：敏感性好，与人类接近：敏感性好，与人类接近Q缺点：缺点：难培养，费用高难培养，费用高将吸烟器抽烟的烟气，分别经过有机相（乙酸乙酯）和将吸烟器抽烟的烟气，分别经过有机相（乙酸乙酯）和无机相（基本培养液）收集。将有机溶剂挥发后，与培无机相（基本培养液）收集。将有机溶剂挥发后，与培养液混合，并将烟气浓度调整为养液混合，并将烟气浓度调整为1 1支烟支烟/ml/ml，加入细胞培，加入细胞培养液中培养细胞，造成细胞烟气中毒的实验模型养液中培养细胞，造成细胞烟气中毒的实验模型细胞系及其暴露卷烟烟
26、气染毒细胞系及其暴露卷烟烟气染毒通通常常急急性性毒毒性性是是指指动动物物1d1d内内单单次次或或多多次次染染毒毒后后在在714d714d中中连连续续观观察察动动物物产产生生的的毒毒性性反反应应及及死死亡亡情情况况。考考虑虑到到吸吸烟烟的的实实际际情情况况，在在吸吸烟烟的的急急性性毒毒性性实实验验中中，我我们们采采用用所所有有动动物物同同时时开开始始吸吸烟烟，连连续续染染毒毒，直直至至全全部部动动物物死死亡亡为为止止，观观察察动动物物吸吸烟烟的的反反应应，准准确确记记录录每每只只动动物物的的死死亡亡时时间间和和吸吸烟烟量量，计计算算平平均均活活存存时时间间和和平平均均致致死死吸吸烟烟量量，提提供
27、供以以下实验结果：下实验结果：v第第一一只只动动物物和和最最后后一一只只动动物物死死亡亡的的时时间间和和致致死死吸吸烟烟量量（即死亡时间和剂量的范围）（即死亡时间和剂量的范围）v一半动物发生死亡的时间和吸烟量（一半动物发生死亡的时间和吸烟量（T T1/21/2和和LDLD5050）v对照烟动物全部死亡时，实验烟动物的活存率对照烟动物全部死亡时，实验烟动物的活存率v必要时，需对急性致死动物的进行病理观察必要时，需对急性致死动物的进行病理观察 动物暴露卷烟烟气的急性毒性试验动物暴露卷烟烟气的急性毒性试验细胞存活试验细胞存活试验E细胞在正常情况下按一定生长速度倍增，当受到有害因细胞在正常情况下按一定
28、生长速度倍增，当受到有害因素作用时，细胞周期发生紊乱，表现出直接死亡或增殖素作用时，细胞周期发生紊乱，表现出直接死亡或增殖性死亡性死亡v接种效率试验接种效率试验 细胞在低密度接种条件下，受损伤细胞细胞在低密度接种条件下，受损伤细胞不能存活，而正常细胞在一定时间后形成集落（克隆），不能存活，而正常细胞在一定时间后形成集落（克隆），通过计数克隆数，可以计算活存细胞百分数通过计数克隆数，可以计算活存细胞百分数vMTT试验试验 噻唑兰（噻唑兰（MTT）是一种细胞染料，能被活细）是一种细胞染料，能被活细胞在生长过程中利用并在细胞内沉积，因此，胞在生长过程中利用并在细胞内沉积，因此，MTT试验试验可用来检
29、测细胞增殖死亡率，评价有害物质对细胞的毒可用来检测细胞增殖死亡率，评价有害物质对细胞的毒性作用性作用细胞氧化损伤细胞氧化损伤活性氧检测活性氧检测E几乎所有的环境有害因素均能通过直接或间接作用，诱几乎所有的环境有害因素均能通过直接或间接作用，诱发细胞产生包括活性氧在内的自由基，这一方面是由于发细胞产生包括活性氧在内的自由基，这一方面是由于外源性化合物的代谢活化，并与其细胞或基因毒性密切外源性化合物的代谢活化，并与其细胞或基因毒性密切相关；另一方面是细胞应激性启动抗氧化防御机制以对相关；另一方面是细胞应激性启动抗氧化防御机制以对抗外源性有害因素可能导致的细胞损伤。细胞活性氧水抗外源性有害因素可能导
30、致的细胞损伤。细胞活性氧水平反应了细胞对外源性有害因素作用时的毒性应答，也平反应了细胞对外源性有害因素作用时的毒性应答，也就是外源性化合物的毒性就是外源性化合物的毒性细胞内活性氧水平细胞内活性氧水平 细胞细胞中，分子探针中，分子探针DCFH-DA和和HE可分别与可分别与H2O2和和O2.反应，生成二氯荧光黄反应，生成二氯荧光黄（DCF）和溴乙锭和溴乙锭（EB），并产生），并产生绿色绿色和和红色红色荧光，荧光，通过测定细胞内通过测定细胞内DCF和和/或或EB的荧光强度，即可相对定的荧光强度，即可相对定量细胞内量细胞内H2O2和和O2.水平水平细胞外活性含量细胞外活性含量 过氧化氢（过氧化氢（H2
31、O2）用用辣根过氧化物辣根过氧化物酶酶和和酚红酚红捕获，通过标准曲线进行定量；捕获，通过标准曲线进行定量；超氧阴离子超氧阴离子（O2.）用用细胞色素细胞色素C捕获，通过测定吸光度改变进行捕获，通过测定吸光度改变进行定量；定量；羟自由基（羟自由基（.OH）用用番红花红番红花红捕获，通过测定吸捕获，通过测定吸光度改变进行定量光度改变进行定量过氧化氢过氧化氢细胞膜细胞膜是细胞与外界的屏蔽，具有是细胞与外界的屏蔽，具有信号转导信号转导与与物质交换物质交换的重要功能。有人提出膜损伤是疾病发生甚至癌变的标的重要功能。有人提出膜损伤是疾病发生甚至癌变的标志。细胞膜损伤可从以下几个方面进行评价：志。细胞膜损伤
32、可从以下几个方面进行评价：v膜的通透性膜的通透性 乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶（LDH）是胞浆中的一种常见酶，通是胞浆中的一种常见酶，通常情况下不能透过细胞膜外逸，因此，通过检测细胞外常情况下不能透过细胞膜外逸，因此，通过检测细胞外LDH的活性，的活性，可以评价可以评价膜通透性膜通透性的改变的改变v膜的结构与功能膜的结构与功能 腺苷三磷酸酶腺苷三磷酸酶（ATPase）是细胞膜上的一是细胞膜上的一种重要酶，负责重要离子的主动跨膜运输。通过检测细胞膜种重要酶，负责重要离子的主动跨膜运输。通过检测细胞膜ATPase的活性，可以评价的活性，可以评价膜功能性膜功能性的改变的改变v膜的流动性膜的流动性 采用荧光偏
33、振法，细胞经采用荧光偏振法，细胞经DPHDPH荧光探针标记后，用荧光探针标记后，用荧光分光光度计测荧光偏振度。荧光分光光度计测荧光偏振度。Kex362nm,Kem432nm,狭缝狭缝10nm,测温测温25细胞膜损伤细胞膜损伤长长期期毒毒性性（也也称称为为亚亚急急性性毒毒性性、亚亚慢慢性性毒毒性性、慢慢性性毒毒性性或或终终生生毒毒性性）是是指指动动物物反反复复多多次次染染毒毒的的毒毒性性反反应应。实实验验时时，动动物物每每天天固固定定时时间间吸吸烟烟1次次，按按实实验验设设计计要要求求控控制制吸吸烟烟时时间间和和吸吸烟烟量量，持持续续3个个月月后后活活杀杀一一批批，余余下下动动物物继继续续饲饲养
34、养1个个月月进进行行恢恢复复期期观观察察。分分别别在在吸吸烟烟前前、吸吸烟烟期期间间的的1个个月月和和2个个月月、停停止止吸吸烟烟时时（吸吸烟烟后后3个个月月）、停停止止吸吸烟烟后后1个个月月（吸吸烟烟后后4个个月月）观观察察动动物物体体重重变变化化、血血液液学学参参数数。实实验验结结束束后后，全全部部处处死死动动物物，进进行行肺肺组组织织病理学观察。观察指标包括病理学观察。观察指标包括v一一般般观观察察 外外观观体体征征和和行行为为活活动动（如如神神态态萎萎靡靡、倦倦缩缩不不动动或或过过度度兴兴奋奋、躁躁动动惊惊跳跳、肌肌肉肉麻麻痹痹或或震震颤颤、步步态态异异常常等等），皮皮毛毛帖帖身身或或
35、稀稀疏疏竖竖散散，粪粪便便性性状、颜色，食量及体重变化等状、颜色，食量及体重变化等v血血液液学学指指标标 红红细细胞胞或或网网织织红红细细胞胞细细胞胞数数，血血红红蛋蛋白白含含量量，白白细细胞胞及及其其分类细胞数，血小板计数，凝血时间等分类细胞数，血小板计数，凝血时间等v血血液液生生化化指指标标 天天氡氡氨氨酸酸氨氨基基转转换换酶酶（AST）、丙丙氨氨酸酸氨氨基基转转换换酶酶（ALT）、碱碱性性磷磷酸酸酶酶（ALP）、尿尿素素氮氮（BUN）、总总蛋蛋白白（TP）、白白蛋蛋白白（ALB）、血血糖糖（GLU）、总总胆胆红红素素（TBIL）、肝肝酐酐（CREA）、总总胆胆固醇（固醇（TCH）、钙浓度
36、（）、钙浓度（CA）等）等v病病检检器器官官 心心、肝肝、脾脾、肺肺、肾肾、肾肾上上腺腺、甲甲状状腺腺、胸胸腺腺、睾睾丸丸(子子宫宫)、脑、交列腺等的重量及其系数，以及部分器官的病理学检查脑、交列腺等的重量及其系数，以及部分器官的病理学检查动物暴露卷烟烟气的慢性毒性试验动物暴露卷烟烟气的慢性毒性试验细菌回复突变试验细菌回复突变试验 即即AmesAmes试验。实验用菌株为鼠伤试验。实验用菌株为鼠伤寒沙门氏菌不同组氨酸缺陷型突变株，根据致突变物寒沙门氏菌不同组氨酸缺陷型突变株，根据致突变物能灵敏而特异地使组氨酸缺陷型突变株回变成原型的能灵敏而特异地使组氨酸缺陷型突变株回变成原型的特点，故在缺乏组氨
37、酸的培养基上，只有少数自发回特点，故在缺乏组氨酸的培养基上，只有少数自发回变菌落生长，而能诱发细菌回变的致突变物可使细菌变菌落生长，而能诱发细菌回变的致突变物可使细菌生长增多，从而可判断被试物是否具有致突变性生长增多，从而可判断被试物是否具有致突变性染色体畸变分析染色体畸变分析v染色体数目畸变染色体数目畸变 非整倍体（亚二倍体和超二倍体）、非整倍体（亚二倍体和超二倍体）、多倍体和内复制多倍体和内复制v染色体结构畸变染色体结构畸变 裂隙、断裂、断片、着丝粒环和无裂隙、断裂、断片、着丝粒环和无着丝粒环等着丝粒环等v姐妹染色体交换姐妹染色体交换v微核试验微核试验致突变试验致突变试验Hchr 11分带
38、分带AL细胞细胞(400)AL细胞染色体核型细胞染色体核型次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶（次黄嘌呤磷酸核糖基转移酶（HPRTHPRT）主要参与嘌呤核苷酸的补救合主要参与嘌呤核苷酸的补救合途径，正常细胞能从头合成途径，正常细胞能从头合成DNADNA，因此，因此HPRTHPRT酶对细胞存活繁殖是非必酶对细胞存活繁殖是非必需的，需的，HPRTHPRT基因突变后仍能较长期活存。利用正常细胞中基因突变后仍能较长期活存。利用正常细胞中HPRTHPRT酶活酶活性，加入毒性嘌呤类似物性，加入毒性嘌呤类似物6-6-巯基鸟嘌呤巯基鸟嘌呤（6-TG6-TG）培养，细胞死亡，）培养，细胞死亡，而而HPRTHPRT基因突变的
39、细胞对基因突变的细胞对6-TG6-TG有抗性而活存，并形成克隆，以此可有抗性而活存，并形成克隆，以此可以检测以检测HPRTHPRT基因突变基因突变人类人类1111号染色体基因突变分析号染色体基因突变分析用人用人-中国仓鼠卵巢杂交细胞中国仓鼠卵巢杂交细胞（AL细细胞）胞）检测检测人类人类11号染色体号染色体（Hchr 11）基因突变是近几年发展起来）基因突变是近几年发展起来的一种快速、简便、经济、灵敏的检测基因突变的实验方法的一种快速、简便、经济、灵敏的检测基因突变的实验方法基因突变基因突变细胞恶性转化试验细胞恶性转化试验 细胞转化是是细胞失去原有正常形态和功能的细胞转化是是细胞失去原有正常形态
40、和功能的表型特征，是细胞癌前病变的重要标志，表现在细胞增殖速度加快表型特征，是细胞癌前病变的重要标志，表现在细胞增殖速度加快（倍增时间缩短），细胞间接触抑制消失（叠层生长），并具有异种（倍增时间缩短），细胞间接触抑制消失（叠层生长），并具有异种组织的浸润性（转移）。检测细胞转化能力是评价外源性化合物致癌组织的浸润性（转移）。检测细胞转化能力是评价外源性化合物致癌性的基本方法性的基本方法动物致癌试验动物致癌试验 选择肿瘤易感性高和肿瘤自然发生率低的纯品系动选择肿瘤易感性高和肿瘤自然发生率低的纯品系动物，常用小鼠和大鼠。年龄以刚断乳为宜，因它们的易感性较高，同物，常用小鼠和大鼠。年龄以刚断乳为宜，
41、因它们的易感性较高，同时也可具有较长的实验观察时间。计算癌瘤发生率，一般以病理组织时也可具有较长的实验观察时间。计算癌瘤发生率，一般以病理组织诊断为依据，并与对照组相比较，以确定致癌的显著性。确定诱癌潜诊断为依据，并与对照组相比较，以确定致癌的显著性。确定诱癌潜伏期的长短以第一例癌瘤发现时间或平均癌瘤发现时间计。判定癌瘤伏期的长短以第一例癌瘤发现时间或平均癌瘤发现时间计。判定癌瘤多发性，应计数包括同一机体内发生两种或两种以上类型的肿瘤，或多发性，应计数包括同一机体内发生两种或两种以上类型的肿瘤，或同一脏器、同一系统中出现多个同类型的癌瘤同一脏器、同一系统中出现多个同类型的癌瘤 致癌试验致癌试验
42、生殖毒性试验 雄性生殖毒性检测方法雄性生殖毒性检测方法 v精子活动度和精子计数分析精子活动度和精子计数分析v精子形态学试验精子形态学试验v亲代雄鼠睾丸亲代雄鼠睾丸( (附睾附睾) )重量系数重量系数v系列交配与扩展交配试验系列交配与扩展交配试验 雌性生殖毒性检测方法雌性生殖毒性检测方法v一代繁殖试验一代繁殖试验v多代繁殖试验多代繁殖试验v其它辅助试验其它辅助试验（如雌性动物动情周期观察、性激素水平的测定等（如雌性动物动情周期观察、性激素水平的测定等 ）胚胎毒性评定方法胚胎毒性评定方法v胚胎死亡率胚胎死亡率v生长迟缓率生长迟缓率v功能不全率功能不全率v畸形率畸形率免疫功能评价体液免疫体液免疫v血
43、对胸腺依赖抗原血对胸腺依赖抗原SRBCSRBC的抗体空斑反应的抗体空斑反应(PFC)(PFC)v血清抗体滴度血清抗体滴度( (血凝法、血凝法、ELISAELISA法法) )v有丝分裂原有丝分裂原LPSLPS刺激淋巴细胞转化刺激淋巴细胞转化细胞免疫细胞免疫vT T细胞数细胞数(ANAE(ANAE染色法染色法) )v迟发性变态反应迟发性变态反应(DTH)(DTH)v有丝分裂原有丝分裂原PHAPHA、ConAConA刺激淋巴细胞转化刺激淋巴细胞转化非特异免疫非特异免疫v自然杀伤细胞自然杀伤细胞v单核细胞及单核细胞及T T、B B淋巴细胞标记淋巴细胞标记v腹腔巨噬细胞对腹腔巨噬细胞对CRBCCRBC的
44、吞噬作用的吞噬作用v单核细胞对炭粒的廓清单核细胞对炭粒的廓清代表性中式卷烟代表性中式卷烟安全性评价举例安全性评价举例烟丝添加神农液降低卷烟危害烟丝添加神农液降低卷烟危害 使用使用SRMSRM生物滤嘴降低卷烟危生物滤嘴降低卷烟危害害烟丝添加神农液烟丝添加神农液降低卷烟危害的生物医学评价降低卷烟危害的生物医学评价五叶神卷烟五叶神卷烟试验样品试验样品v五叶神品牌卷烟五叶神品牌卷烟烟丝中添加2.5神农萃取液制成的卷烟(编号205#)v同品牌对照烟同品牌对照烟 未使用神农萃取液的空白烟烟丝添加神农液降低卷烟危害烟丝添加神农液降低卷烟危害对照烟对照烟五叶神烟五叶神烟动物数动物数( (只只) ) 3030动
45、物体重动物体重(g) (g) 20.07 2.63 19.92 2.67 死亡时间死亡时间(min) (min) 76.25224.50 211.60263.93 平均活存时间平均活存时间(min) (min) 180.01 42.22 233.06 11.57平均致死吸烟量平均致死吸烟量( (支支) ) 41.24 9.19 55.23 2.50 R与与同同品品质质对对照照烟烟比比较较，吸吸五五叶叶神神烟烟组组，小小鼠鼠的的平平均均活活存存时时间和平均致死吸烟量分别增加了间和平均致死吸烟量分别增加了29.4%29.4%和和34.1%34.1%R吸吸烟烟210 210 minmin，五五叶叶神
46、神烟烟组组小小鼠鼠100100% %存存活活，而而对对照照烟烟组组小小鼠鼠存存活活率率仅仅为为40%40%，当当对对照照烟烟组组小小鼠鼠全全都都死死亡亡时时，五五叶叶神神烟组小鼠的存活率为高达烟组小鼠的存活率为高达86.7%86.7% 小鼠吸烟急性致死毒性试验小鼠吸烟急性致死毒性试验空白烟空白烟五叶神五叶神淋巴细胞浸润淋巴细胞浸润1.83 0.581.00 0.71*肺泡壁增厚肺泡壁增厚2.50 0.672.11 0.60出血出血2.25 0.452.78 0.67*气管上皮变溥气管上皮变溥2.17 0.941.44 0.73肺囊泡肺囊泡1.92 0.671.11 0.78*管周水肿管周水肿2
47、.17 0.391.89 0.60肺损伤总分值肺损伤总分值12.83 1.7510.33 1.00*n=6,与空白烟比较，与空白烟比较，*p0.05,*p0.005吸烟急性致死小鼠肺组织病理改变吸烟急性致死小鼠肺组织病理改变空白烟空白烟五叶神五叶神淋巴细胞浸润淋巴细胞浸润3.40 0.552.80 0.45肺泡壁增厚肺泡壁增厚2.20 0.451.80 0.45出血出血2.60 0.552.00 0.00*气管上皮变溥气管上皮变溥3.20 0.841.60 0.55*肺囊泡肺囊泡2.60 0.551.60 0.55*管周水肿管周水肿3.80 0.452.80 0.45*肺损伤总分值肺损伤总分值
48、17.80 0.4512.60 1.34 *n=6,与空白烟比较，与空白烟比较，*p0.05,*p0.05 0.05 2 2支支/d/d13.213.22.4 2.4 0.050.053 3支支/d/d12.312.32.2 2.2 0.05 0.05 复方甘草合剂复方甘草合剂20ml/kg/d20ml/kg/d9.19.11.7 1.7 0.001 0.05 0.05 2 2支支/d/d45.245.29.8 9.8 0.050.053 3支支/d/d50.650.611.0 11.0 0.05 0.05 阳性对照药阳性对照药102.7102.719.4 19.4 0.001 0.05 0.
49、05 2 2支支/d/d0.630.630.045 0.045 0.050.053 3支支/d/d0.670.670.065 0.065 0.05 0.05 淑芬氏剂淑芬氏剂 20ml/kg/d20ml/kg/d0.980.980.18 0.18 0.001 0.001 增加离体气管酚红排泌量增加离体气管酚红排泌量（祛痰）（祛痰）改善瘀血组织的血液流动性改善瘀血组织的血液流动性组别组别全血粘度全血粘度(CP) (CP) 低切低切(20S)(20S)中切中切(60S)(60S)高切高切(120S)(120S)正常组正常组10.6210.621.89 1.89 7.597.591.04 1.04
50、5.965.960.65 0.65 对照烟对照烟3 3支支/d/d15.8215.821.56 1.56 10.3210.320.72 0.72 8.068.060.71 0.71 五叶神五叶神烟烟1 1支支/d/d15.7815.781.41 1.41 10.1410.140.65 0.65 7.827.820.39 0.39 2 2支支/d/d14.0914.092.03 2.03 9.309.301.16 1.16 7.207.200.87 0.87 3 3支支/d/d13.5513.552.21 2.21 9.299.291.28 1.28 7.127.120.85 0.85 水水20
51、ml/kg/d20ml/kg/d 13.1213.121.71 1.71 9.159.151.10 1.10 7.167.160.90 0.90 降低吸烟所致细胞染色单体交换（降低吸烟所致细胞染色单体交换（SCE）率）率组别组别SCESCE数范围数范围/ /细胞细胞 平均平均SCESCE数数/ /细胞细胞 空白对照空白对照08084.164.161.50 1.50 溶剂对照溶剂对照29294.284.281.60 1.60 对照烟对照烟4114116.846.841.57 1.57 五叶神烟五叶神烟39395.505.501.73 1.73 某外烟某外烟52052011.4211.423.15
52、 3.15 组别组别观察细胞数观察细胞数微核数微核数微核率微核率空白对照组空白对照组100001000017171.71.7对照烟组对照烟组101361013640403.95 3.95 实验烟组实验烟组100751007525252.48 2.48 阳性对照组阳性对照组101941019423523523.05 23.05 抑制吸烟所致细胞微核形成抑制吸烟所致细胞微核形成 神农萃取液应用于卷烟中，使小鼠和大鼠吸烟急性死亡的时间神农萃取液应用于卷烟中，使小鼠和大鼠吸烟急性死亡的时间和致死吸烟量分别增加了约和致死吸烟量分别增加了约60%和和30%；特别是当吸对照烟组；特别是当吸对照烟组动物全部死
53、亡时，五叶神烟组动物存活率高达动物全部死亡时，五叶神烟组动物存活率高达85%以上以上同为吸烟急性致死动物，五叶神烟组肺损伤程度明显减轻，表现同为吸烟急性致死动物，五叶神烟组肺损伤程度明显减轻，表现在在淋巴细胞浸润、肺泡壁增厚、出血、气管扩张、上皮变薄、肺淋巴细胞浸润、肺泡壁增厚、出血、气管扩张、上皮变薄、肺囊泡和管周水肿等多项病理损伤囊泡和管周水肿等多项病理损伤指标均明显好于对照烟组。指标均明显好于对照烟组。与同品质对照烟比较，五叶神卷烟的细胞毒性降低了约与同品质对照烟比较，五叶神卷烟的细胞毒性降低了约24倍，倍，诱发的诱发的细胞氧化损伤、膜损伤、染色体基因突变和细胞转化细胞氧化损伤、膜损伤、
54、染色体基因突变和细胞转化等细等细胞生物学改变均明显减轻胞生物学改变均明显减轻与同品质对照烟比较，五叶神卷烟与同品质对照烟比较，五叶神卷烟减少动物的刺激性咳嗽反应，减少动物的刺激性咳嗽反应，延长喘息性抽搐的潜伏期，增加离体气管酚红排泌量，改善瘀血延长喘息性抽搐的潜伏期，增加离体气管酚红排泌量，改善瘀血的血液流动性，降低了吸烟所致染色单体交换率，抑制吸烟所致的血液流动性，降低了吸烟所致染色单体交换率，抑制吸烟所致微核形成微核形成结论结论使用使用SRMSRM生物滤嘴生物滤嘴降低卷烟危害的生物医学评价降低卷烟危害的生物医学评价5mg5mg中南海混合型卷烟中南海混合型卷烟SRMSRM降低卷烟烟气自由基的
55、效果及稳定性降低卷烟烟气自由基的效果及稳定性实验样品实验样品1#烟烟 普通香烟普通香烟2#烟烟 5 mg 中南海香烟中南海香烟4#烟烟 5 mg 中南海中南海SRM低自由基香烟低自由基香烟(以上样品均由北京卷烟厂提供以上样品均由北京卷烟厂提供)细胞毒作用细胞毒作用小鼠急性毒性小鼠急性毒性雄性小鼠吸烟雄性小鼠吸烟1个月后生殖器官改变个月后生殖器官改变吸烟组动物体重、睾丸重量及附睾重量均低于不吸烟组，吸烟组动物体重、睾丸重量及附睾重量均低于不吸烟组，其中体重和附睾重量降低明显，但各吸烟组间无差异其中体重和附睾重量降低明显，但各吸烟组间无差异雄性小鼠吸烟雄性小鼠吸烟1个月后精子活性改变个月后精子活性
56、改变精子总数精子总数吸吸1#烟组动物精子总数烟组动物精子总数明显减少明显减少吸吸2#烟组动物精子总数烟组动物精子总数减少，但无统计学减少，但无统计学差异差异吸吸4#烟组动物精子总数烟组动物精子总数与不吸烟组相当与不吸烟组相当活泼活泼(I类类)和较活泼和较活泼(II类类)的精子数的精子数吸吸1#1#烟组动物最少，烟组动物最少，2#2#烟次之，烟次之，4#4#烟最多，但均明显低于不吸烟组烟最多，但均明显低于不吸烟组吸吸4#4#烟组动物的活性精子数明显烟组动物的活性精子数明显多于多于1#1#烟组和烟组和2#2#烟组烟组死精子死精子(IV类类)数数吸烟组，吸烟组，1#1#烟和烟和2#2#烟差不多，烟差
57、不多，4#4#组较少，但均高于不吸烟组组较少，但均高于不吸烟组吸吸4#4#烟组动物的死精子数明显少烟组动物的死精子数明显少于于2#2#烟和烟和1#1#烟烟活动不良精子活动不良精子(III类类)3 3个吸烟组相近，稍高于不吸烟个吸烟组相近，稍高于不吸烟组，但统计上无明显差异组，但统计上无明显差异不不吸吸烟烟小小鼠鼠吸吸2#烟烟小小鼠鼠吸吸1#烟烟小小鼠鼠吸吸4#烟烟小小鼠鼠小鼠吸烟小鼠吸烟3个月后器官免疫功能个月后器官免疫功能小鼠免疫功能小鼠免疫功能吸烟组动物体重、脾脏重量及胸腺重量均低于不吸烟组，其吸烟组动物体重、脾脏重量及胸腺重量均低于不吸烟组，其1#和和2#烟组减轻明显，烟组减轻明显，4#
58、烟组与不吸烟组统计上差异列明显，烟组与不吸烟组统计上差异列明显，且且4#烟组胸腺重量及其指数均明显高于烟组胸腺重量及其指数均明显高于1#和和2#烟组烟组非非特特异异免免疫疫体体液液免免疫疫细细胞胞免免疫疫3项免疫指标吸烟组均低于不项免疫指标吸烟组均低于不吸烟组，除外吸烟组，除外#烟的体液和细烟的体液和细胞免疫外，均与不吸烟组有胞免疫外，均与不吸烟组有显著性差异显著性差异4#烟组所检测的烟组所检测的3项免疫指标项免疫指标均明显高于均明显高于1#和和2#烟组烟组小鼠骨髓微核形成试验小鼠骨髓微核形成试验与不吸烟组比较，吸烟组微核发生率明显增高，红系造与不吸烟组比较，吸烟组微核发生率明显增高，红系造血
59、功能显著下降血功能显著下降吸烟组间比较，吸烟组间比较，4#4#烟组微核发生率明显低于烟组微核发生率明显低于1#1#和和2#2#烟组，烟组，红系造血功能也明显高于红系造血功能也明显高于1#1#和和2#2#烟组烟组结论结论SRMSRM能高效稳定地降低卷烟烟气中自由基含量能高效稳定地降低卷烟烟气中自由基含量SRMSRM低自由基香烟与同品牌同焦油含量香烟比较，安全性明显低自由基香烟与同品牌同焦油含量香烟比较，安全性明显提高，表现在以下几个方面：提高，表现在以下几个方面：v细胞毒效应减少细胞毒效应减少50%50%以上以上v动物急性毒性反应明显减轻动物急性毒性反应明显减轻( (活存时间延长活存时间延长30
60、%30%致死剂量减少致死剂量减少33%33%，肺组织病理损伤程度也明显减轻，肺组织病理损伤程度也明显减轻) )v精细胞总数高精细胞总数高17%17%，活泼精子多，活泼精子多120%120%，死精子减少，死精子减少27%27%v体液免疫、细胞免疫和非特异免疫功能体液免疫、细胞免疫和非特异免疫功能分别增加分别增加30%30%、25%25%和和60%60%v骨髓微发生率下降骨髓微发生率下降41%41%，红系造血功能增高，红系造血功能增高27% 27% 结语结语u吸烟与健康吸烟与健康关系密切，并越来越受到社会各关系密切，并越来越受到社会各界，特别是烟草行业和卫生部门的广泛关注界，特别是烟草行业和卫生部门的广泛关注u发展以低危害卷烟为代表的中式卷烟发展以低危害卷烟为代表的中式卷烟成成为关系到烟草行业生存与发展的重大问题为关系到烟草行业生存与发展的重大问题u烟医结合开展卷烟的安全性评价烟医结合开展卷烟的安全性评价将为研将为研发低危害卷烟提供重要的技术支撑，必将产发低危害卷烟提供重要的技术支撑，必将产生巨大的社会效益和经济效益生巨大的社会效益和经济效益谢谢大家谢谢大家Thank for your attention
